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1、第八章第八章 色谱法原理色谱法原理（Principles of Chromatography）第一节第一节 概述概述 一、色谱法简介一、色谱法简介 色谱法（色谱法（Chromatography）是是一种分离分析方法一种分离分析方法。它是。它是利利用各物质在两相中具有不同的分配系数用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。色谱法早在色谱法早在1903年由俄国植物学家年由俄国植物学家Tswett分离植物色素时分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分
2、离无色物质，并采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用色谱法已广泛应用于许多领域于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。，成为十分重要的分离分析手段。色谱分离过程色谱分离过程123在色谱发展史上占有重要地位的英国人在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.P.Martin（马丁）（马丁）和和R.L.M.Synge（辛格），他们提出色谱塔板理论；发明液（辛格），他们提出色谱塔板理论；发
3、明液-液液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。R.L.M.Synge（1914-1994）A.J.P.MARTIN.(1910-2002)色色谱谱法法其其共共同同的的基基本本特特点点是是具具备备两两相相：不不动动的的一一相相，称称为为固固定定相相；另另一一相相是是携携带带样样品品流流过过固固定定相相的的流流动动体体，称称为为流流动动相相。当当流流动动相相中中样样品品混混合合物物经经过过固固定定相相时时，就就会会与与固固定定相相发发生
4、生作作用用，由由于于各各组组分分在在性性质质和和结结构构上上的的差差异异，与与固固定定相相相相互互作作用用的的类类型型、强强弱弱也也有有差差异异，因因此此在在同同一一推推动动力力的的作作用用下下，不不同同组组分分在在固固定定相相滞滞留留时时间间长长短短不不同同，从从而而按按先先后后不不同同的的次次序序从从固固定定相中流出。相中流出。组分分离示意图组分分离示意图 流动相流动相 检测器检测器 记录仪记录仪A+BABABBAABBA 二、色谱法分类二、色谱法分类 1按两相状态分类按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气体为流动相的色谱称为气相色谱（气相色谱（GC），根据固定相是根据固定相是固体吸附剂
5、还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为液体），又可分为气固色气固色谱谱（GSC）和气液色谱（和气液色谱（GLC）。液体为流动相的色谱称液体为流动相的色谱称液相色谱（液相色谱（LC），同理，液相色谱同理，液相色谱亦可分为亦可分为液固色谱（液固色谱（LSC）和液液色谱（和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（超临界流体色谱（SFC）。通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称相的色谱又称化学键
6、合相色谱（化学键合相色谱（CBPC）。）。2按分离机理分类按分离机理分类 利利用用组组分分在在吸吸附附剂剂（固固定定相相）上上的的吸吸附附能能力力强强弱弱不不同同而而得得以分离的方法，称为以分离的方法，称为吸附色谱吸附色谱法法。利利用用组组分分在在固固定定液液（固固定定相相）中中溶溶解解度度不不同同而而达达到到分分离离的的方法称为方法称为分配色谱法分配色谱法。利利用用组组分分在在离离子子交交换换剂剂（固固定定相相）上上的的亲亲和和力力大大小小不不同同而而达到分离的方法，称为达到分离的方法，称为离子交换色谱法离子交换色谱法。利利用用大大小小不不同同的的分分子子在在多多孔孔固固定定相相中中的的选选
7、择择渗渗透透而而达达到到分分离的方法，称为离的方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法或尺寸或尺寸排阻色谱法排阻色谱法。最最近近，又又有有一一种种新新分分离离技技术术，利利用用不不同同组组分分与与固固定定相相（固固定定化化分分子子）的的高高专专属属性性亲亲和和力力进进行行分分离离的的技技术术称称为为亲亲和和色色谱谱法法，常用于蛋白质的分离常用于蛋白质的分离。3按固定相的外形分类按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱，柱色谱，柱色谱，柱色谱，柱色谱又可分为又可分为又可分为又可分为填充柱色谱
8、和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱填充柱色谱和开管柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为固定相呈平板状的色谱法，称为固定相呈平板状的色谱法，称为固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱平板色谱平板色谱平板色谱，它又，它又，它又，它又可分为可分为可分为可分为薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱薄层色谱和纸色谱。三、色谱法的特点三、色谱法的特点1 1、高选择性；、高选择性；2 2、高效能；、高效能；3 3、高灵敏度可以分析质量分、高灵敏度可以分析质量分数为数为1010-6-61010-9-9数量级、检出限量低至数量级、检出限量低至1010-1l-1lg g的物质，的物质
9、，适于适于微量和痕量分析。微量和痕量分析。四、色谱法的应用四、色谱法的应用1 1、色谱分析广泛应用于极为、色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析复杂的混合物成分分析；2 2、液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。3 3、色色谱谱分分离离是是一一种种非非常常有有效效的的提提纯纯物物质质的的技技术术，常常用用于于制制备分离，得到高纯样品。备分离，得到高纯样品。4 4、色谱、色谱质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。质谱联用仪已成为研究分子结构的重要手段。第二节
10、第二节 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语一色谱流出曲线一色谱流出曲线 从色谱柱先后流出的各组分进入从色谱柱先后流出的各组分进入检检测器，检测测器，检测器产生响应信号，信号大小与组分浓度成正比，该器产生响应信号，信号大小与组分浓度成正比，该信号放大后输送到记录仪，信号放大后输送到记录仪，记录仪所画出的与样品记录仪所画出的与样品浓度相关的曲线就称为色谱流出曲线。浓度相关的曲线就称为色谱流出曲线。色色谱谱图图色谱峰保留时间基线峰宽 二、基线二、基线 当仪器中没有注入样品，仅有流动相通过时，当仪器中没有注入样品，仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值，即图中检测器响应信号的记录值，即图中
11、Ot线。稳定线。稳定的基线应该是一条水平直线。的基线应该是一条水平直线。三、峰高三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以，以h表表示，如图中示，如图中B A。四、保留值四、保留值 1死时间死时间tM 不不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速线速时，可
12、用柱长时，可用柱长L与与tM的比值计算。的比值计算。2保留时间保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图中的时间，称为保留时间，如图中OB它相当于样它相当于样品到达柱末端的检测器所需的时间品到达柱末端的检测器所需的时间 3调整保留时间调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即保留时间，即保留时间，即保留时间，即t tR R =t tR R-t-tMM 由由
13、于于组组份份在在色色谱谱柱柱中中的的保保留留时时间间t tR R包包含含了了组组份份随随流流动动相相通通过过柱柱子子所所需需的的时时间间和和组组份份在在固固定定相相中中滞滞留留所所需需的的时时间间，所所以以t tR R实实际际上上是是组组份份在在固固定定相相中中停停留留的的时时间间保保留留时时间间可可用用时时间间单单位位（如如s s）或或距距离离单单位位（如如cmcm）表示。表示。保留时间是色谱法定性的基本依据保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。者有
14、时用保留体积等参数进行定性检定。4死体积死体积 VM 指指色色谱谱柱柱在在填填充充后后，柱柱管管内内固固定定相相颗颗粒粒间间所所剩剩留留的的空空间间、色色谱谱仪仪中中管管路路和和连连接接头头间间的的空空间间以以及及检检测测器器的的空空间间的的总总和和当当后后两两项项很很小小而而可可忽忽略略不不计计时时，死死体体积可由死时间与流动相体积流速积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算：计算：VM=tMF0 5保留体积保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度
15、极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t tR的关系的关系的关系的关系如下：如下：如下：如下：VR=tRF0 6调整保留体积调整保留体积VR 某某组组份份的的保保留留体体积积扣扣除除死死体体积积后后，称称该该组组份份的的调整保留体积，即调整保留体积，即 VR=VR-VM 7相对保留值相对保留值2.1 某某组组份份2的的调调整整保保留留值值与与组组份份1的的调调整整保保留留值值之之比比，称为相对保留值：称为相对保留值：由由由由于于于于相相相相对对对对保保保保留留留留值值
16、值值只只只只与与与与柱柱柱柱温温温温及及及及固固固固定定定定相相相相的的的的性性性性质质质质有有有有关关关关，而而而而与与与与柱柱柱柱径径径径、柱柱柱柱长长长长、填填填填充充充充情情情情况况况况及及及及流流流流动动动动相相相相流流流流速速速速无无无无关关关关，因因因因此此此此，它它它它是是是是色色色色谱谱谱谱法法法法中，特别是中，特别是中，特别是中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。气相色谱法中，广泛使用的定性数据。气相色谱法中，广泛使用的定性数据。气相色谱法中，广泛使用的定性数据。必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留必须注
17、意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比体积之比体积之比体积之比 .五、区域宽度五、区域宽度 色色谱谱峰峰的的区区域域宽宽度度是是组组份份在在色色谱谱柱柱中中谱谱带带扩扩张张的的函函数数，它它反反映映了了色色谱谱操操作作条条件件的的动动力力学学因因素素度度量量色色谱峰区域宽度通常有三种方法：谱峰区域宽度通常有三种方法：1.标准偏差标准偏差 正正态态分分布布曲曲线线两两侧侧拐拐点点之之间间距距离离的的一一半半，即即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中如图中EF距离的一半。距离的一半。2.半峰宽半峰宽W1/2
18、 即峰高一半处对应的峰宽，如图中即峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离。间的距离。它与标准偏差它与标准偏差的关系是：的关系是：W1/2=2.354 3.基线宽度基线宽度W 即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上的的截截距距，如如图中图中IJ的距离。它与标准偏差的关系是：的距离。它与标准偏差的关系是：W=4 从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息：（l l）根根据据色色谱谱峰峰的的个个数数，可可以以判判断断样样品品中中所所含含组组份份的的最最少少个数个数 （2 2）根根据据色色谱谱峰峰的的保保留留值值(或或位位置置），可可以以
19、进进行行定定性性分分析析 （3 3）根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析）根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析 （4 4）色色谱谱峰峰的的保保留留值值及及其其区区域域宽宽度度，是是评评价价色色谱谱柱柱分分离离效效能的依据能的依据 （5 5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相和流动相)选择选择是否合适的依据是否合适的依据 第三节第三节 色谱法分析的基本原理色谱法分析的基本原理两组份峰间距足够远：两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的的热力学热力学性质决定。性质决定。每个组份峰
20、宽足够小：每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程程动力学动力学性质决定。性质决定。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。学两方面进行。一、分配系数一、分配系数K K和分配比和分配比k k 1分配系数分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分复多次地吸附一脱附过程
21、。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数，它是指在一定温度和压力下，组分在固定相分配系数，它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即，即 2.分配比分配比k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流分配在固定相和流动相中的质量比动相中的质量比。即。即 k k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的值越大，说明
22、组分在固定相中的量越多，相当于柱的值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。容量大，因此又称分配容量或容量因子。容量大，因此又称分配容量或容量因子。容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是它是它是它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k k 值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、
23、值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。式式中中CS，Cm分分别别为为组组分分在在固固定定相相和和流流动动相相的的浓浓度度；Vm为为柱柱中中流流动动相相的的体体积积，近近似似等等于于死死体体积积。Vs为为柱柱中中固固定定相相的的体体积积，在在各各种种不不同同的的类类型型的的色色谱谱中中有有不不同同的的含含义义。例例如如：在在分分配配色色谱谱中中，Vs表表示示固固定定液液的的体体积积；在尺寸
24、排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。3.分配系数分配系数K与分配比与分配比k的关系的关系 其中其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的称为相比率，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。又一个参数。例如，对填充柱，其例如，对填充柱，其值一般为值一般为635；对毛细管柱，其对毛细管柱，其值为值为60600。二、塔板理论二、塔板理论 把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入的分配行为，同时引入理论塔板数作为理论塔板数作为衡量柱效率的指标衡量柱效率的指标，
25、即色谱柱是由一系，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。列连续的、相等的水平塔板组成。每一每一块塔板的高度用块塔板的高度用H表示，称为塔板高度，表示，称为塔板高度，简称板高。简称板高。塔板理论假设：塔板理论假设：1.在在柱柱内内一一小小段段长长度度H内内，组组分分可可以以在在两两相相间间迅迅速速达达到到平平 衡。这一小段柱长称为理论塔板高度衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2.以以气气相相色色谱谱为为例例，载载气气进进入入色色谱谱柱柱不不是是连连续续进进行行的的，而而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。）。3.所所有有组组分分开开始始时时存存在
26、在于于第第0号号塔塔板板上上，而而且且试试样样沿沿轴轴（纵纵）向扩散可忽略。向扩散可忽略。4.分分配配系系数数在在所所有有塔塔板板上上是是常常数数，与与组组分分在在某某一一塔塔板板上上的的量无关。量无关。简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应的色谱柱，溶质平衡的次数应为：为：n=L/H n称为理论塔板数。称为理论塔板数。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论
27、塔板数理论塔板数n的增加而增加，随板高的增加而增加，随板高H的增大而减小。的增大而减小。塔板理论指出：塔板理论指出：第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数第一，当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大大于于50时，可得到基本对称的峰形曲线。时，可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，在色谱柱中，n值值一般很大，如气相色谱柱的一般很大，如气相色谱柱的n约为约为103 106，因而这时的，因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。流出曲线可趋近于正态分布曲线。当当当当n n5050时，就可以得到对称的峰形曲线。时，就可以得到对称的峰形曲线。时，就可以得到对称的峰形曲线。时，就可以得到对称的峰形曲线
28、。第二，当样品进入色谱柱后，第二，当样品进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数只要各组分在两相间的分配系数有微小差异有微小差异，经过反复多次分配平衡后，仍可获得良好的分离。，经过反复多次分配平衡后，仍可获得良好的分离。第三，第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为：与半峰宽及峰底宽的关系式为：n=5.54（tr/W1/2）2=16（tr/W）2 从公式可以看出，在从公式可以看出，在tr 一定时，如果色谱峰很窄，则说明一定时，如果色谱峰很窄，则说明n越越大，大，H越小，柱效能越高。越小，柱效能越高。在实际工作中，由公式在实际工作中，由公式 n=L/H 和和n=5.54(tr/W1/2)2=16(t
29、r/W)2 计算出来的的计算出来的的n和和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，离效能，因为采用因为采用tR计算时，没有扣除死时间计算时，没有扣除死时间tM，所以常用有所以常用有效塔板数效塔板数n有效有效表示柱效：表示柱效：n有效有效=5.54(tr /W1/2)2=16(tr /W)2 有效板高有效板高：H有效有效=L/n有效有效有关塔板理论的说明：有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定 液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等
30、；2）应定期对柱效评价，以防柱效下降、延长柱寿命。）应定期对柱效评价，以防柱效下降、延长柱寿命。3）塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位 置、提出了计算和评价柱效的参数。置、提出了计算和评价柱效的参数。但但该该理理论论是是在在理理想想情情况况下下导导出出的的，未未考考虑虑分分子子扩扩散散因因素素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：v 峰形为什么会扩张？峰形为什么会扩张？v 影响柱效的动力
31、学因素是什么？影响柱效的动力学因素是什么？三、速率理论三、速率理论 1956年年荷荷兰兰学学者者van Deemter（范范第第姆姆特特）等等在在研研究究气气液液色色谱谱时时，提提出出了了色色谱谱过过程程动动力力学学理理论论速速率率理理论论。他他们们吸吸收收了了塔塔板板理理论论中中板板高高的的概概念念，并并充充分分考考虑虑了了组组分分在在两两相相间间的的扩扩散散和和传传质质过过程程，从从而而在在动动力力学学基基础础上上较较好好地地解解释释了了影影响响板板高高的的各各种种因因素素。该该理理论论模模型型对对气气相相、液液相相色色谱谱都适用。都适用。van Deemter方程的数学简化式为方程的数学
32、简化式为:H=A+B/u+C u 式式中中u为为流流动动相相的的线线速速度度；A、B、C、为为常常数数，分分别别代代表表涡涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。（）涡流扩散项（）涡流扩散项 2dp（）（）分子扩散项分子扩散项B B 2Dg（）（）传质阻力项传质阻力项C 传质阻力与填充物的粒度和载气的分子量有关。传质阻力与填充物的粒度和载气的分子量有关。说明：说明：填填充充均均匀匀程程度度、担担体体粒粒度度、载载气气种种类类、载载气气流流速速、柱温、固定相液膜厚度等对柱效、峰扩张的影响。柱温、固定相液膜厚度等对柱效、峰扩张的影响。1.涡流扩散项
33、涡流扩散项 A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。动，故称涡流扩散。由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的引起了色谱峰的变宽。变
34、宽。涡流扩散过程示意图涡流扩散过程示意图 色谱峰变宽的程度由下式决定：色谱峰变宽的程度由下式决定：A=2dp 上式表上式表明，明，A与填充物的平均直径与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因的大小和填充不规则因子子有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此在涡流扩散。因此 A=0。2.2.分子扩散项分子扩散项 B/u B/u（纵向扩散项）纵向扩散
35、项）纵纵向向分分子子扩扩散散是是由由浓浓度度梯梯度度造造成成的的，样样品品会会自自发发的的向向前前和和向向后后扩扩散散，造造成成谱谱带带展展宽宽。分分子子扩扩散散项项系系数数为为B=2B=2D Dg g。是是填填充充柱柱内内流流动动相相扩扩散散路路径径弯弯曲曲的的因因素素，也也称称弯弯曲曲因因子子，它它反反映映了了固固定定相相颗颗粒粒的的几几何何形形状状对对自自由由分分子子扩扩散散的的阻阻碍碍情情况况。D Dg g为为组组分分在在流流动动相相中中扩扩散散系系数数（cmcm3 3ss-1-1）,分分子子扩扩散散项项与与组组分分在在流流动动相相中中扩扩散散系系数数D Dg g成正比成正比.D Dg
36、 g与流动相及组分性质有关：与流动相及组分性质有关：（a a）相对分子质量大的组分相对分子质量大的组分D Dg g小，小，D Dg g反比于流动反比于流动相相对分子质量的平方根，所以相相对分子质量的平方根，所以采用相对分子质量较采用相对分子质量较大的流动相（氩气），可使大的流动相（氩气），可使B B项降低；项降低；（b b）D Dg g随柱温增高而增加，但反比于柱压。随柱温增高而增加，但反比于柱压。另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，另外纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此为此为降低纵向扩散影
37、响，要加大流动相速度降低纵向扩散影响，要加大流动相速度。对于液。对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。相色谱，组分在流动相中纵向扩散可以忽略。3.传质阻力项传质阻力项 C Cu u 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同。动相，它们的传质过程不完全相同。（1 1）气液色谱气液色谱 传质阻力系数传质阻力系数C包括气相传质阻力系数包括气相传质阻力系数Cg和液相传质和液相传质阻力系数阻力系数Cl两项，即两项，即C=Cg+Cl dpdf流动相流动相固液界面固液界面固定固定液液组分分子组分分子ClCg 气气相相传
38、传质质过过程程是是指指试试样样组组分分从从气气相相移移动动到到固固定定相相表表面面的的过过程程。这这一一过过程程中中试试样样组组分分将将在在两两相相间间进进行行质质量量交交换换，即即进进行行浓浓度度分分配配。有有的的分分子子还还来来不不及及进进入入两两相相界界面面，就就被被气气相相带带走走；有有的的则则进进入入两两相相界界面面又又来来不不及及返返回回气气相相。这这样样使使得得试试样样在在两两相相界界面面上上不不能能瞬瞬间间达达到到分分配配平平衡衡，引引起起滞滞后后现现象象，从从而而使使色色谱谱峰峰变变宽宽。对对于于填填充充柱柱，气气相相传传质质阻阻力力系系数数Cg为：为：Cg=0.01k2/(
39、1+k)2 dp2/Dg 式中式中k为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度物粒度dp的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数Dg成反比。因此，成反比。因此，采用粒度小的填充物和相对分子质量小的采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气、氦气）做载气，可使气体（如氢气、氦气）做载气，可使Cg减小，提高柱效。减小，提高柱效。液相传质过程液相传质过程是指试样组分从固定相的气是指试样组分从固定相的气/液界面移动液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返到液相内部，并发生质量交换，达到分配
40、平衡，然后又返回气回气/液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此液界面的传质过程。这个过程也需要一定的时间，此时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于时，气相中组分的其它分子仍随载气不断向柱口运动，于是造成峰形扩张。液相传质阻力系数是造成峰形扩张。液相传质阻力系数 C1为：为：C1=2/3 k/(1+k)2 df2/Dl 由由上上式式看看出出，固固定定相相的的液液膜膜厚厚度度df薄薄，组组分分在在液液相相的的扩扩散散系系数数D1大大，则则液液相相传传质质阻阻力力就就小小。降降低低固固定定液液的的含含量量，可可以以降降低低液液膜膜厚厚度度，但但k值值随随之之变变小小，又又会会使使
41、C1增增大大。当当固固定定液液含含量量一一定定时时，液液膜膜厚厚度度随随载载体体的的比比表表面面积积增增加加而而降降低低，因因此此，一一般般采采用用比比表表面面积积较较大大的的载载体体来来降降低低液液膜膜厚厚度度。但但比比表表面面积积太太大大，由由于于吸吸附附造造成成拖拖尾尾峰峰，也也不不利利于于分分离离。虽虽然然提提高高柱柱温温可可增增大大D1，但但会会使使k值值减减小小，为为了了保保持持适适当当的的C1值值，应控制适宜的柱温。应控制适宜的柱温。（2）液液分配色谱液液分配色谱 传质阻力系数（传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相和固定相传质阻力系数（
42、传质阻力系数（Cs），），即即 C=Cm+Cs其中其中Cm又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即：质阻力，即：Cm=mdp2/Dm+smdp2/Dm式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱式中右边第一项为流动的流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀的。这种传质阻力对板高的慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀的。这种传质阻力对板高的影响与固定相粒度影响与固定相粒度
43、dp 的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数散系数Dm成反比，成反比，m是由柱和填充的性质决定的因子。是由柱和填充的性质决定的因子。右边第二项为滞留的流动相中的传质阻力。这是由右边第二项为滞留的流动相中的传质阻力。这是由于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在一个局于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在一个局部，滞留在固定相微孔内的流动相一般是停滞不动的流部，滞留在固定相微孔内的流动相一般是停滞不动的流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须首先动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须首先扩散到滞留区。如果固定相的微孔既小又深，传质速率
44、扩散到滞留区。如果固定相的微孔既小又深，传质速率就慢，对峰的扩展影响就大就慢，对峰的扩展影响就大。式中式中smsm是一常数，它与颗是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。显然，显然，固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速固定相的粒度愈小，微孔孔径愈大，传质速率就愈快，柱效就高。率就愈快，柱效就高。对高效液相色谱固定相的设计就对高效液相色谱固定相的设计就是基于这一考虑。是基于这一考虑。液液色谱中固定相传质阻力系数（液液色谱中固定相传质阻力系数（Cs）可用下式表示：可用下式表示：Cs=sdf2/Ds 公公式式说说明明试试样样分
45、分子子从从流流动动相相进进入入固固定定液液内内进进行行质质量量交交换换的的传传质质过过程程与与液液膜膜厚厚度度df平平方方成成正正比比，与与试试样样分分子子在在固固定定液液的的扩扩散散系系数数Ds成成反反比比。式式中中s是是与与容容量量因因子子k有有关关的系数。的系数。气气相相色色谱谱速速率率方方程程和和液液相相色色谱谱速速率率方方程程的的形形式式基基本本一一致致，主主要要区区别别在在液液液液色色谱谱中中纵纵向向扩扩散散项项可可忽忽略略不不计计,影影响响柱柱效的主要因素是传质阻力项。效的主要因素是传质阻力项。速率理论的要点速率理论的要点 (1)(1)组组分分分分子子在在柱柱内内运运行行的的多多
46、路路径径与与涡涡流流扩扩散散、浓浓度度梯梯度度所所造造成成的的分分子子扩扩散散及及传传质质阻阻力力使使气气液液两两相相间间的的分分配配平平衡衡不不能能瞬瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通通过过选选择择适适当当的的固固定定相相粒粒度度、载载气气种种类类、液液膜膜厚厚度度及及载气流速可提高柱效。载气流速可提高柱效。(3)(3)速速率率理理论论为为色色谱谱分分离离和和操操作作条条件件选选择择提提供供了了理理论论指指导导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各各种种因因素素相相互互制制约约
47、，如如载载气气流流速速增增大大，分分子子扩扩散散项项的的影影响响减减小小，使使柱柱效效提提高高，但但同同时时传传质质阻阻力力项项的的影影响响增增大大，又又使使柱柱效效下下降降；柱柱温温升升高高，有有利利于于传传质质，但但又又加加剧剧了了分分子子扩扩散散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。4.流动相线速度对板高的影响流动相线速度对板高的影响 5.固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响 粒粒度度越越细细，板板高高越越小小，并并且且受受线线速速度度影影响响亦亦小小。这这就就是是为为什什么么在在HPLC中中采采用用细细颗颗粒粒作作固固定定相
48、相的的根根据据。当当然然，固固定定相相颗颗粒粒愈愈细细，柱柱流流速速愈愈慢慢。只只有有采采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。取高压技术，流动相流速才能符合实验要求。四、分离度四、分离度 分分离离度度R是是一一个个综综合合性性指指标标。分分离离度度是是既既能能反反映映柱柱效效率率又又能能反反映映选选择择性性的的指指标标，称称总总分分离离效效能能指指标标。分分离离度度又又叫叫分分辨辨率率，它它定定义义为为相相邻邻两两组组分分色色谱谱峰峰保保留留值值之之差差与与两两组组分分色谱峰底宽总和之半的比值，色谱峰底宽总和之半的比值，即即 R=2(tr2-tr1)/Y1+Y2 R值值越越大大，表表明明相
49、相邻邻两两组组分分分分离离越越好好。一一般般说说，当当R1时时，两两峰峰有有部部分分重重叠叠；当当R=1时时，分分离离程程度度可可达达98%；当当R=1.5时时，分分离离程程度度可可达达99.7%。通通常常用用R=1.5作作为为相相邻邻两两组组分已完全分离的标志。分已完全分离的标志。第四节第四节 色谱定性和定量分析色谱定性和定量分析一一、色谱的定性分析、色谱的定性分析 色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此值，因此保留值可作为一种定性指标。保留值
50、可作为一种定性指标。目前各种色谱定目前各种色谱定性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条性方法都是基于保留值的。但是不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同的保留值，件下，可能具有相似或相同的保留值，即保留值并非专即保留值并非专属的属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析目的的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法则可确定色谱峰所代表的化合物。可确定色谱峰所代表的化合物。（一）利用纯物质对