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1、研究生科研实验教学基地建设研究生科研实验教学基地建设研究生科研实验教学基地建设研究生科研实验教学基地建设基本实验技能培训基本实验技能培训基本实验技能培训基本实验技能培训首都医科大学附属北京朝阳医院首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心基础医学研究中心 梁燕梁燕85231624,主要内容1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项1.1 1.1 基因组基因组DNADNA提取原理提取原理既要将既要将DNA与蛋白质、脂
2、类和糖类等分离，与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持又要保持DNA分子的完整。分子的完整。仪器准备：仪器准备：台式离心机台式离心机、恒温水浴锅恒温水浴锅、紫外分光光度计、紫外分光光度计、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架子（灭菌）、离心管架试剂准备：试剂准备：试剂盒、无水乙醇等试剂盒、无水乙醇等1.2 基因组DNA提取试剂盒试剂盒试剂盒内容试剂盒内容操作步骤操作步骤（重点）（重点）1.向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记；向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记；2.取200ul全血，加入20ul的
3、蛋白酶K溶液，混匀；3.加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。4.加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。5.将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤5的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤6；6.向吸附柱中加500ul的缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；操作步骤操作步骤（重点）（重点）7.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附
4、柱放回收集管；8.向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；9.将吸附柱和收集管再次离心，12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室温放置数分钟；10.将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；11.测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。计算公式：OD260/OD280=1.7-1.9DNA浓度浓度(ug/ul)=OD26050稀释倍数稀释倍数/1000OD260=0.1稀释倍数稀释倍数=250DNA浓
5、度浓度=0.150 250/1000=1.25 ug/ul操作注意事项操作注意事项避免样品反复冻融避免样品反复冻融56水浴摇匀可消除水浴摇匀可消除GB中的沉淀中的沉淀使用台式离心机，室温离心使用台式离心机，室温离心2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项仪器准备：仪器准备：PCRPCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架试剂准备：试剂准备：ddH2O,PCR Buffer，dNTP，引物，引物，PCR聚合酶，聚合酶，DNA模板模板2.1 PCR2.1 PCR体系和
6、循环条件体系和循环条件（重点）（重点）BclI PCRTotal volume25ul*2ddH2O16.5ul33ul10Buffer 2.5ul5uldNTP (25mM)2ul4ulPrimer F(10mM)1ul2ulPrimer R(10mM)1ul2ulEx Taq (1U/ul)1ul2ulSum24ul48ul48/2=24ulTemplate DNA（0.1ug/ul)1ul1ul60，30s72，30s95，30s95，30s（预变性）（预变性）72，30s（后延伸）（后延伸）30cycles2.2 PCR2.2 PCR操作步骤操作步骤（重点）（重点）1.计算好所需扩增的
7、计算好所需扩增的PCR体系；体系；2.打开打开PCR仪预热，设置仪预热，设置PCR循环条件；循环条件；3.准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用；准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用；4.按顺序加样，混匀，离心，分装；按顺序加样，混匀，离心，分装；5.加入模板加入模板DNA，混匀，离心；，混匀，离心；6.放入放入PCR仪，仪，Start。2.3 PCR2.3 PCR操作注意事项操作注意事项避免试剂反复冻融避免试剂反复冻融计算总量，顺序加样计算总量，顺序加样更换吸头，避免污染更换吸头，避免污染3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项3.1 3.1 琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理
8、DNADNA分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；分子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；其移动速度与线性其移动速度与线性DNADNA片段长度成反比。片段长度成反比。配置配置1%1%的胶：称的胶：称1g1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml100ml的的1*TAE1*TAE，微波炉加热至完全融化；，微波炉加热至完全融化；待凝胶温度降至待凝胶温度降至50-6050-60度时，加入度时，加入1ul1ul的的EBEB（10mg/ml)10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-30-6060分
9、钟；分钟；轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE1*TAE，没过，没过加样孔；加样孔；按照按照1ul1ul上样上样Buffer+5ulBuffer+5ul的的DNADNA混合后，点样；每排留混合后，点样；每排留一个孔加一个孔加DNA markerDNA marker；100V100V电泳电泳3030分钟，凝胶成像仪照相。分钟，凝胶成像仪照相。3.2 3.2 琼脂糖凝胶电泳方法琼脂糖凝胶电泳方法（重点）（重点）3.3 3.3 电泳操作注意事项电泳操作注意事项带手套操作带手套操作EB凝胶冷却时间至少凝胶冷却时间至少30分钟分钟凝胶完全融化凝胶完全融化M II-3 II-2 II-1 I-2 I-1 0应用应用BclIBclI/RFLP/RFLP 多态位点进行基因连锁分析多态位点进行基因连锁分析374211163小小 结结1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项作 业实验记录实验记录姓名，日期，试剂批号等姓名，日期，试剂批号等实验设计实验设计 DNA提取步骤提取步骤 PCR体系和循环条件体系和循环条件 配胶和电泳方法配胶和电泳方法