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1、Western Blotting的原理的原理 方法及方法及常见问题分析常见问题分析vvWestern BlottingWestern Blotting的原理的原理vv实验前应准备的试剂及材料实验前应准备的试剂及材料vvWestern BlottingWestern Blotting实验步骤实验步骤vv影响影响Western blottingWestern blotting成功的要素成功的要素vv常见问题分析与对策常见问题分析与对策 南方医科大学中医药学院分子生物学实验室 一、一、概述概述 通过特异性抗体对通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着或生物组织样品
2、进行着色。通过分析着色的位色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的或组织中的表达情况的信息。信息。Western Blotting的原理 1.1.组织或细胞样品蛋白的提取试剂组织或细胞样品蛋白的提取试剂2.2.蛋白定量试剂蛋白定量试剂 3.3.丙烯酰胺凝胶配置试剂丙烯酰胺凝胶配置试剂4.4.转膜缓冲液试剂转膜缓冲液试剂5.5.固相载体（固相载体（PVDFNCPVDFNC尼龙膜）尼龙膜）6.6.封闭液、洗脱液、抗体稀释液封闭液、洗脱液、抗体稀释液7.7.一抗、二抗一抗、二抗8.8.化学显影液化学显影液 二、二、实验前
3、准备的试剂及材料 2.7 一抗二抗的选择一抗二抗的选择 2.7.1 一抗的选择一抗的选择 2.7.2 二抗的选择二抗的选择 二、二、实验前准备的试剂及材料 3.13.1组织或细胞样品蛋白的提取组织或细胞样品蛋白的提取 a a 蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白核蛋白、磷酸化蛋白 线粒体蛋白等。线粒体蛋白等。b b 样品来源分类：单层贴壁细胞、样品来源分类：单层贴壁细胞、悬浮细胞悬浮细胞 少量或微量组织样品少量或微量组织样品 大量组织样品大量组织样品 难裂解组织样品难裂解组织样品 一般组织样品一般组织样品 三、三、Western BlottingW
4、estern Blotting实验步骤实验步骤 3.2蛋白定量蛋白定量 考马斯亮兰法考马斯亮兰法 BCA法法 Lowry法法 BCA蛋白定量法操作：蛋白定量法操作：三、三、Western BlottingWestern Blotting实验步骤实验步骤 孔号孔号012345678蛋白标准溶液（L）0124812162020去离子水（L）20191816128400对应蛋白含量（g）00.51.02.04.06.08.010.？A+B（50：1）200200200200200200200200200振荡30s，37 30分钟，A562nm测定。以蛋白含量（g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲
5、线；计算出蛋白含量。3.33.3凝胶浓度的选择及配置凝胶浓度的选择及配置蛋白分子量蛋白分子量(kDa)凝胶浓度凝胶浓度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008三、三、Western Blotting实验步骤 3.43.4蛋白蛋白Marker Marker 的作用的作用 预染或非预染各种分子量的预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪大小和示踪，有利找准自己的，有利找准自己的目的蛋白。目的蛋白。12%10%8%5%总体积10ml10ml10ml2ml超纯水3.344.61.430%丙烯酰胺43.32.70.33
6、1.5M Tirs2.52.52.50.2510%APS0.10.10.10.0210%SDS0.10.10.10.02TEMED0.0040.0040.0060.0036 3.63.6蛋白样品变性（时间、温度）蛋白样品变性（时间、温度）3.63.6蛋白样品上样（顺序、体积）蛋白样品上样（顺序、体积）3.73.7电泳电泳 三、三、Western Blotting实验步骤？三、三、Western Blotting实验步骤 3.8 3.8 切胶、泡胶、叠胶切胶、泡胶、叠胶 滤纸2张滤纸1张PVDF膜1张滤纸3张 凝胶1块阳极阳极阴极胶、滤纸、膜浸泡位置胶、滤纸、膜浸泡位置3.9 转膜转膜 时滤纸、
7、胶、膜的叠加顺序时滤纸、胶、膜的叠加顺序 三、三、Western BlottingWestern Blotting实验步骤实验步骤 半干转膜的条件：半干转膜的条件：分子量大小分子量大小 电流电流=Sx3Sx3叠加示意图叠加示意图正极负极 3.10 3.10封闭封闭 3.113.11洗脱洗脱 3.12 3.12加一抗加一抗 （抗体名称、来源、浓度、时间）（抗体名称、来源、浓度、时间）孵育孵育 三、三、Western Blotting实验步骤 3.13 3.13 洗脱洗脱 3.14 3.14 加二抗加二抗（抗体名称、来源、浓度、时间）（抗体名称、来源、浓度、时间）3.15 3.15 孵育、洗脱孵育
8、、洗脱 3.16 3.16 加加ECLECL发光液发光液三、三、Western Blotting实验步骤 3.17 3.17 结果的检测及分析结果的检测及分析三、三、Western Blotting实验步骤 结果分析结果分析 例图例图1 1比较均一的高背景比较均一的高背景斑点、发泡式或闪烁式的高背景斑点、发泡式或闪烁式的高背景信号弱或者无信号信号弱或者无信号非特异性条带非特异性条带弥散型条带弥散型条带白色条带、黑点或信号下降太快白色条带、黑点或信号下降太快 常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析三、三、常见问题分析常见问题分析高背景原因：原因：解决办法解决办法抗体浓度太高抗体浓度太高
9、优化优化/降低一抗和二抗浓度降低一抗和二抗浓度抗体孵育温度过高抗体孵育温度过高4 4孵育孵育封闭液不适合封闭液不适合比较尝试不同的封闭液比较尝试不同的封闭液封闭不完全封闭不完全封闭液的选择与优化封闭液的选择与优化增加封闭液中蛋白质浓度增加封闭液中蛋白质浓度优化封闭时间和温度（优化封闭时间和温度（RTRT至少至少1 1小时；小时；44过夜）过夜）抗体与其它蛋白质交叉反应抗体与其它蛋白质交叉反应更换不同的封闭液；更换不同的封闭液；降低二抗浓度降低二抗浓度检测二抗与膜的交叉反应性检测二抗与膜的交叉反应性 高背景原因：原因：解决办法解决办法漂洗不完全漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积增加漂洗时间和缓冲
10、液体积漂洗液中加入漂洗液中加入Tween-20Tween-20；浓度；浓度0.050.05曝光时间太长曝光时间太长缩短曝光时间缩短曝光时间膜的问题膜的问题使用干净镊子；戴手套操作使用干净镊子；戴手套操作换一张新膜换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润用足够的液体，膜始终保持湿润孵育时使用脱色摇床孵育时使用脱色摇床避免膜重叠，互相覆盖避免膜重叠，互相覆盖小心操作，勿毁损膜小心操作，勿毁损膜膜干燥膜干燥保证充分的反应液，避免出现干膜现象保证充分的反应液，避免出现干膜现象缓冲液污染缓冲液污染使用新缓冲液使用新缓冲液过滤缓冲液过滤缓冲液高背景n如图所示:信号弱或者无信号原因：原因：解决办法解决办法转膜
11、不完全转膜不完全1.1.转膜后，染胶以决定转膜效率转膜后，染胶以决定转膜效率2 2.保证转膜时胶与膜充分结合保证转膜时胶与膜充分结合(赶气泡）赶气泡）3 3.滤纸膜胶，电极方向正确装配滤纸膜胶，电极方向正确装配4 4.电转时防止过热（加冰）电转时防止过热（加冰）5 5.使用阳性对照或预染使用阳性对照或预染MarkerMarker6 6.优化转移时间和电流优化转移时间和电流7 7.保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇）保证样品处理时，样品不被破坏（抗原决定簇）蛋白质与膜结合不充分蛋白质与膜结合不充分1.1.小蛋白转印增加电转移缓冲液中甲醇的浓度至小蛋白转印增加电转移缓冲液中甲醇的浓度至20%
12、20%；2.2.大蛋白转印降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至大蛋白转印降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%10%3.3.低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜（低分子蛋白质透过膜；使用小孔径膜（0.22u0.22u）一抗、二抗等不匹配一抗、二抗等不匹配一抗与组织种属相匹配，一抗与二抗或一抗与组织种属相匹配，一抗与二抗或/和底物与酶系统和底物与酶系统之间相匹配。之间相匹配。抗体抗体增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性增加抗体浓度；抗体与抗原结合差；抗体丧失活性抗原不足抗原不足增加上样量增加上样量 信号弱或者无信号信号弱或者无信号抗原被封闭液遮蔽抗原被封闭液遮蔽试用不同的封闭液试用不同的封闭液优化封
13、闭液中蛋白质浓度优化封闭液中蛋白质浓度缩短封闭时间缩短封闭时间缓冲液里有叠氮钠缓冲液里有叠氮钠去掉叠氮钠去掉叠氮钠底物孵育时间太短底物孵育时间太短不少于不少于2 2分钟分钟底物丧失活性底物丧失活性ECLECL发光液的选择及发光也的有效期发光液的选择及发光也的有效期底物与二抗孵育发光检测底物与二抗孵育发光检测保证两种底物成分没有交叉污染保证两种底物成分没有交叉污染膜被剥离过膜被剥离过剥离会导致抗原丢失或变性剥离会导致抗原丢失或变性避免重复检测避免重复检测膜上蛋白质被消化（膜上蛋白质被消化（gelatin)gelatin)封闭物质可能有蛋白质降解活性封闭物质可能有蛋白质降解活性蛋白质在储存过程中降
14、解蛋白质在储存过程中降解重新制备样品重新制备样品信号弱或者无信号信号弱或者无信号n如图所示：多非特异性条带或条带位置不对蛋白表达模式的分化蛋白表达模式的分化使用原始或传代少的细胞株，或平行实验使用原始或传代少的细胞株，或平行实验体内表达的蛋白具有多种修饰形式体内表达的蛋白具有多种修饰形式 查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小正确的大小蛋白样本降解蛋白样本降解新鲜制备，并使用蛋白酶抑制剂新鲜制备，并使用蛋白酶抑制剂一抗浓度过高一抗浓度过高降低抗体浓度，可以减少非特异性条带降低抗体浓度，可以减少非特异性条带二抗浓度过高产生非特异性结合二抗浓度过高产生非
15、特异性结合降低抗体浓度，降低抗体浓度，选择特异性更强二抗选择特异性更强二抗抗体未纯化抗体未纯化单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带带蛋白存在二聚体或多聚体蛋白存在二聚体或多聚体电泳上样前，煮沸电泳上样前，煮沸10 min10 min，增强蛋白质解，增强蛋白质解聚变性聚变性？多非特异性条带或条带位置不对n如图所示:弥散型条带原因：原因：解决办法：解决办法：抗体浓度太高抗体浓度太高降低抗体浓度降低抗体浓度电泳时电压过大电泳时电压过大降低电泳时电压（降低电泳时电压（100v100v）蛋白质上样量太多蛋白质上样量太多降低蛋白质上样量降低蛋白质上样量其他常见问题背景有白色背景有白色/黑色黑色斑点斑点转膜时有气泡或抗体分转膜时有气泡或抗体分布不均布不均尽量去除气泡，抗体孵尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动育时保持摇动抗体与封闭剂结合抗体与封闭剂结合过滤封闭剂（或更换）过滤封闭剂（或更换）暗片背景白条带暗片背景白条带一抗或二抗加入过多一抗或二抗加入过多稀释抗体的浓度稀释抗体的浓度目的条带位置过目的条带位置过低低/过高过高SDS-PAGESDS-PAGE胶浓度选择不胶浓度选择不合适合适调整胶浓度调整胶浓度 “微笑微笑”条带条带迁移过快电泳温度过高迁移过快电泳温度过高降低电泳速度，低温电降低电泳速度，低温电泳（冷室）泳（冷室）其他常见问题n如图所示：