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1、细胞工程主要内容细胞工程主要内容（1）细胞工程的基础知识与基本技术；细胞工程的基础知识与基本技术；植物组织培养；植物组织培养；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；花药及单倍体植株培养；花药及单倍体植株培养；原生质体制备与细胞融合；原生质体制备与细胞融合；人工种子制备；人工种子制备；植物脱病毒技术；植物脱病毒技术；1细胞工程主要内容细胞工程主要内容（2）动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养动物细胞融合动物细胞融合细胞重构与动物克隆细胞重构与动物克隆淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体染色体转移与基因转移染色体转移与基因转移人类干细胞研究人类干细胞研究原核细
2、胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合2参考文献自编自编.细胞工程讲义细胞工程讲义罗立新等罗立新等.细胞工程细胞工程.华南理工大学出版华南理工大学出版社，社，2003李志勇编著李志勇编著.细胞工程细胞工程.科学出版社，科学出版社，20033探究式自主学习计划探究式自主学习计划自愿组成学习小组，自愿组成学习小组，3人左右，选出组长；人左右，选出组长；每组选一个主题，时间约每组选一个主题，时间约10min；各组需准备各组需准备PowerPoint;各组最高可得各组最高可得8分；分；其他同学可提问、补充或更正；其他同学可提问、补充或更正；教师讲评和讨论；教
3、师讲评和讨论；4探究式自主学习安排（已选）探究式自主学习安排（已选）顺序顺序课课题题学习小组学习小组1单倍体植物的诱发和利用单倍体植物的诱发和利用罗应学罗应学2动物细胞融合动物细胞融合高嘉高嘉3植物脱病毒技术植物脱病毒技术周立周立4淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体蒙冰蒙冰5人类干细胞研究人类干细胞研究王恒王恒6细胞重构与动物克隆细胞重构与动物克隆杨欣蔷杨欣蔷785探究式自主学习安排（探究式自主学习安排（2）顺序顺序课课题题学习小组学习小组8动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养9动物细胞融合动物细胞融合10细胞重构与动物克隆细胞重构与动物克隆11染色体转移与基因转移染色体转移
4、与基因转移12人工种子制备人工种子制备13原生质体制备与细胞融合（植物）原生质体制备与细胞融合（植物）14原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合15真菌细胞的原生质体融合真菌细胞的原生质体融合6细胞工程的三个层次细胞工程的三个层次细胞水平：细胞水平：细胞培养细胞培养,细胞融合，整株培细胞融合，整株培养；养；细胞器水平：细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞细胞核，染色体，各细胞器；器；基因水平：基因水平：基因转化；基因转化；7开展细胞工程的意义开展细胞工程的意义研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点；其特点；有利于改变物种的遗传种性，加快选育优
5、良品有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品种的步伐；种的步伐；可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物；织或生物；有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产；有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产；可获得脱毒植物；可获得脱毒植物；8第一章第一章细胞工程发展简史细胞工程发展简史一一.植物细胞工程植物细胞工程1902德国植物学家德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具预言植物细胞具全能性；全能性；1904德国胚胎学家德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成功培养萝卜胚并长成植株；成植株；1922Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺
6、以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根；绿的叶和根；1930-34李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长；胚正常生长；1934美国美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；根尖病毒愈少；9植物细胞工程植物细胞工程1935-36中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长；米离体根生长；1937美国美国White发现发现VitB促进离体根生长，指促进离体根生长，指出出IAA能调控生长；能调控生长；1937美国美国Michel首创用首创用0.5MNaNO3融合两个融合两个植物细胞原生
7、质体；植物细胞原生质体；1941Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚；养曼佗罗幼胚；？Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；例低则生根；10植物细胞工程植物细胞工程1956Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍；万倍；1958Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株；和植株；1953Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养
8、；成功对烟草细胞进行悬浮液体培养；1960英国英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体；用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体；1964印度印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织；以花药培养出单倍体组织；1968Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；11植物细胞工程植物细胞工程1972Carlson用用NaNO3成功融合不同烟草成功融合不同烟草的原生质体；的原生质体；1977Kao（高国南）首创（高国南）首创PEG-高钙高高钙高pH值细胞融合法；值细胞融合法；1978Melchers获获“番茄番茄-马铃薯马铃薯”杂种植物；杂种植物；1985
9、Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、研制出胡萝卜人工种子，美国、日本和法国相继开展日本和法国相继开展人工种子研制；人工种子研制；12二.动物细胞工程1885Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天；取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天；1903Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月；个月；1907美国美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长培养的蛙神经存活数周，且长出轴突；出轴突；1914Tomson创立能在培养基中维持器官小块的创立能在培养基中维持器官小块的方法；方法；？Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏
10、细胞传代使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存次，生存34年，可无限年，可无限生长；生长；13动物细胞工程1940Earle建立可无限传代的小鼠结缔组建立可无限传代的小鼠结缔组织织L系；系；1951Gay建立第一个永生人宫颈癌建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系；细胞系；1958冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合；瘤细胞融合；1960s童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；植，获核质杂种鱼；14动物细胞工程1960Barski成功进行小鼠细胞融合实验；成功进行小鼠细胞融合实验；1965Harris用灭活仙台病毒成功融合不同
11、动物细胞；用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞；1967Weiss发现在人发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失；鼠杂种细胞中，人染色体先丢失；1975Kohler&Milstein创立淋巴细胞杂交技术，获单克创立淋巴细胞杂交技术，获单克隆抗体；隆抗体；1997英国英国Willmut以体细胞成功克隆以体细胞成功克隆“Dolly”羊；羊；1998年，人类胚胎干细胞被首次培养成功；年，人类胚胎干细胞被首次培养成功；1999年，日本医学家宣布，实现人肝细胞在体外增殖；年，日本医学家宣布，实现人肝细胞在体外增殖；15第二章第二章细胞工程的基础知识与基本技术细胞工程的基础知识与基本技术一一.基础知识基础知
12、识二.1.原核细胞：原核细胞：DNA裸露，生长迅速，裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。因受一定限制。三三.2.真核细胞：接近人类需要，但具真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。植物细胞和真菌细胞具细胞壁。16二二.基本操作基本操作1.无菌操作概念与技术无菌室布局、卫生、消毒、超净台17基本操作2.细胞培养细胞培养取样取样灭菌灭菌培养培养传代传代收获收获除菌除菌取样取样3.细胞融合细胞融合原生质体原生质体融合融合筛选筛选4.转基因细胞（个体）转基因细胞（个
13、体）18第三章第三章植物细胞工程植物细胞工程植物组织培养；植物组织培养；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；悬浮细胞培养和次生代谢物生产；花药及单倍体植株培养；花药及单倍体植株培养；原生质体制备与细胞融合；原生质体制备与细胞融合；人工种子制备；人工种子制备；植物脱病毒技术；植物脱病毒技术；主要内容：19第一节第一节植物组织培养植物组织培养在无菌和人工控制营养及环境条件在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。制其生长、发育的技术。全世界通过植物细胞培养再生成植全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过株已超过600种，已使许多
14、具有重要经济种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。商品化生产。20植物组织培养过程植物组织培养过程离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化芽芽根根植植物物体体培养培养21植物组培基本过程植物组培基本过程22配MS培养基1.基本组分：mg/L蔗糖3%,KNO31900,NH4NO31650,CaCl2440,MgSO4370,KH2PO4170,2.微量无机物：Na2EDTA37.3,FeSO427.8,MnSO422.3,ZnSO48.6,H3BO36.2,KI0.83,Na2
15、MoO40.25,CoCl20.025,CuSO40.0253.微量有机物：mg/L肌醇100，腺嘌呤5，甘氨酸2，烟酸0.5,吡咯醇0.5，硫胺素0.1，生物素0.01，激动素(KT)0.0410吲哚乙酸（IAA）1304.Agar10g/L预备阶段预备阶段（1）236-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA）：）：先先加少量加少量0.1mol/L/L的的NaOHNaOH和蒸和蒸馏水稍加热使其溶解；馏水稍加热使其溶解；萘乙酸（萘乙酸（NAANAA）：）：先用少量先用少量95%95%乙醇和少量乙醇和少量0.1mol/L/L的的NaOHNaOH溶解；溶解；24不同植物的最适不同植物的最适pH值值种类最
16、适pH值种类最适pH值杜鹃杜鹃4.04.0月季月季5.85.8越桔越桔4.54.5胡萝卜、胡萝卜、石刁柏石刁柏6.06.0蚕豆蚕豆5.55.5桃桃7.07.0番茄番茄5.75.725预备阶段预备阶段（2）选择合适的外植体外植体大小要适宜；外植体大小要适宜；外植体的部位影响其分化能力和器官分外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型；化的类型；外植体的年龄影响其分化率；外植体的年龄影响其分化率；同一植物不同部位的分化需不同的生长同一植物不同部位的分化需不同的生长素素/激动素比例；激动素比例；不同物种的相同部位外植体分化能力不不同物种的相同部位外植体分化能力不一样；一样；26预备阶段预备阶段（3）
17、除菌 自来水多次漂洗自来水多次漂洗 消毒剂处理消毒剂处理 无菌水反复冲洗无菌水反复冲洗外植体 无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干 切割切割无菌无菌外植体外植体若干块无菌外植体置培养基上若干块无菌外植体置培养基上27常用消毒剂的使用和效果常用消毒剂的使用和效果消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度/%清除清除消毒时间消毒时间/min灭菌效果灭菌效果次氯酸钠次氯酸钠2容易容易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910容易容易530很好很好漂白粉漂白粉饱和溶液饱和溶液容易容易530很好很好升汞升汞0.11较难较难210最好最好酒精酒精7075容易容易0.22好好过氧化氢过氧化氢1012最容易最容易515好好溴水溴水12容易容
18、易210很好很好硝酸银硝酸银1较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中等中等3060较好较好28植物不同器官的消毒和处理植物不同器官的消毒和处理种子种子纯酒精浸纯酒精浸10min，无菌水洗净，次氯酸钙（，无菌水洗净，次氯酸钙（10）浸）浸2030min，无菌水洗，无菌水洗35次，无菌滤纸吸干；次，无菌滤纸吸干；果实果实纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2）浸）浸10min，无菌水，无菌水反复冲洗，剥除种子和内部组织；反复冲洗，剥除种子和内部组织；茎切段茎切段自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2）浸）浸1520min，无菌水洗，无菌水洗3
19、次，无菌滤纸吸干；次，无菌滤纸吸干；叶片叶片自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（0.1）浸）浸1min，或，或次氯酸钠（次氯酸钠（2）浸）浸1520min，无菌水反复冲洗，无，无菌水反复冲洗，无菌滤纸吸干；菌滤纸吸干；29诱导去分化形成愈伤组织诱导去分化形成愈伤组织添加较高浓度的生长素；添加较高浓度的生长素；固体培养；固体培养；液体培养；液体培养；光照培养；光照培养；黑暗培养；黑暗培养；30形成愈伤组织所需的激素形成愈伤组织所需的激素只需生长素类激素，如菊芋的块茎；只需生长素类激素，如菊芋的块茎；只需细胞分裂素激素，如芜菁根；只需细胞分裂素激素，如芜菁根；需上述两类激素
20、，但有不同比例，多需上述两类激素，但有不同比例，多数植物；数植物；还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；31生长素类激素生长素类激素吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）,常用常用110mg/L;吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）,常用常用15mg/L；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常二氯苯氧乙酸），常用用10-510-7mol/L;萘乙酸（萘乙酸（NAA），常用），常用1.0mg/L；32细胞分裂素类激素细胞分裂素类激素激动素（激动素（KT）6-苄氨基嘌呤（苄氨基嘌呤（6-BA）玉米素玉米素先加少量先加少量碱液预溶碱液预溶33继代增殖阶段继代增殖阶段移植扩增；移植扩增；分
21、割继代；分割继代；34光照培养室光照培养室35生根长芽阶段生根长芽阶段生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用；不同配合，对细胞分化起着重要的作用；外植体本身内源激素水平的差异，导致外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；激素量及其比例反应不尽相同；36长芽生根阶段长芽生根阶段37移栽成活阶段移栽成活阶段保湿是关键；保湿是关键；避免强光直射；避免强光直射；温度适宜；温度适宜；3
22、8植物组培的优缺点植物组培的优缺点优点：优点：ABCD缺点：缺点：ABC39手指玫瑰手指玫瑰40第二节第二节植物细胞培养和次生代谢物生产植物细胞培养和次生代谢物生产本方法的历史、现状本方法的历史、现状1956年，年，Routier&Nickell首先提出把植物细胞首先提出把植物细胞当作工业合成天然产物的途径；当作工业合成天然产物的途径；1968年，年，Reinhard,Corduan&Volks经培养生经培养生产出产出“哈尔碱哈尔碱”（harmine);1972年，年，Furuya&Ishii经培养生产出经培养生产出“维斯纳精维斯纳精”（Visnagin);1981年，年，Fujita等经培养
23、生产出等经培养生产出“紫草素紫草素”；1991年，我国培养红豆杉细胞生产年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇紫杉醇”，达，达到到60mg/L；目前世界最大的细胞培养罐达目前世界最大的细胞培养罐达20t；41红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物42细胞培养细胞培养和和原植物原植物的天然产物量的比较的天然产物量的比较产产量量物物种种天然产物天然产物细胞培养细胞培养原原植植物物橘叶鸡眼藤蒽醌900微克/克干重110微克/克干重决明蒽醌鲜重的0.334%种子干重的0.21%长春花蛇根碱干重的1.3%干重的0.26%三角叶薯蓣薯蓣皂苷26mg/克干重20mg/克干块根人参人
24、参皂角苷鲜重的0.38%鲜重的0.33.3%烟草烟碱干重的3.4%干重的25%烟草泛醌0.5mg/克干重16mg/克干叶大红罂粟蒂巴因130mg/克干重140mg/克干叶43从植物培养细胞中获得的各类物质从植物培养细胞中获得的各类物质氨基酸氨基酸核酸核酸蛋白质蛋白质碳水化合物碳水化合物脂类脂类维生素维生素有机酸有机酸抗白血病药抗白血病药抗肿瘤药抗肿瘤药抗病毒药抗病毒药抗微生物药抗微生物药酶酶抑制剂抑制剂色素色素香料香料甜味剂甜味剂鸦片鸦片杀虫剂杀虫剂激素激素强心苷强心苷核苷酸核苷酸橡胶橡胶阿司匹林阿司匹林奎宁奎宁可卡因可卡因第二节植物细胞培养和次生代谢物生产44培养植物细胞制造疫苗培养植物细胞
25、制造疫苗2006年年2月，美国月，美国DowAgroSciences公司公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗；苗；将病原菌抗原决定基因转入植物基因组将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。含有任何动物成份。45第二节植物细胞培养和次生代谢物生产悬浮培养悬浮培养1.成批培养（封闭式培养）成批培养（封闭式培养）优点：易于操作；优点：易于操作；次生代
26、谢物含量高；次生代谢物含量高；缺点：效率低；缺点：效率低；2.半连续和连续培养半连续和连续培养46第二节植物细胞培养和次生代谢物生产固定化细胞培养固定化细胞培养次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性；次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性；v细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于组织化的形成；v细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次化学物质和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；生代谢物的关键；v细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；v细胞固定化有利于回收次生
27、代谢物；细胞固定化有利于回收次生代谢物；47第二节植物细胞培养和次生代谢物生产平床培养系统平床培养系统优点：制作简单；优点：制作简单；能生产较多次生代谢物；能生产较多次生代谢物；缺点：占地面积大；缺点：占地面积大；分化区比例较小；分化区比例较小；02供应受限；供应受限；48包埋法固定细胞将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶凝胶包埋法包埋法和微胶囊法微胶囊法。凝胶包埋法固定化（凝胶包埋法固定化（gelimmobilization)海藻酸盐（海藻酸盐（alginate)-角叉胶（角叉胶（-carrageenan)琼脂糖（琼脂糖（agarose)琼脂（琼脂（a
28、gar)聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（polyacrylamide)壳聚糖（壳聚糖（chitosan)白明胶（白明胶（gelatin)49微胶囊法微胶囊法是利用天然的或合成的高微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球囊，培养基成分和代谢产物等小分子物囊，培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过，细胞不能通过，使囊内成质可以通过，细胞不能通过，使囊内成为一个微小环境。为一个微小环境。50第二节植物细胞培养和次生代谢物生产立柱培养系统立柱培养系统1.细胞固定化细胞固定化琼脂固定细胞琼脂固定细胞51褐藻酸钙固定细胞褐藻酸钙固定细胞无菌大量培养植物细
29、胞无菌大量培养植物细胞等量混合等量混合注入尼龙网注入尼龙网配制配制4%褐藻酸钠，灭菌褐藻酸钠，灭菌氯化钙溶液（氯化钙溶液（2%）浸浴）浸浴褐藻酸钙固定的细胞团褐藻酸钙固定的细胞团第二节植物细胞培养和次生代谢物生产52第二节植物细胞培养和次生代谢物生产立柱培养系统立柱培养系统优点：占地面积小优点：占地面积小次生代谢物产量高次生代谢物产量高缺点：制作较复杂缺点：制作较复杂O2供应受限供应受限53立柱培养系统操作要素：立柱培养系统操作要素：v取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；v控制营养液的成分（包括激素）、浓度及控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供供应；应
30、；v某些种的细胞培养需光照；某些种的细胞培养需光照；v尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；内释出的植物（品种）；第二节植物细胞培养和次生代谢物生产54提高次生代谢物产量的途径提高次生代谢物产量的途径v生物种性：生物种性：1.选择高产的品系或细胞系；选择高产的品系或细胞系；目测法，化学分析法，外因选择法；目测法，化学分析法，外因选择法；2.诱变筛选高产细胞系：诱变筛选高产细胞系：化学法，物理法；化学法，物理法；3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系；通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系；第二节植物细胞培养和次生代谢物生产55提高
31、次生代谢物产量的途径提高次生代谢物产量的途径v培养条件培养条件:1.培养基：培养基：A碳源：常用蔗糖，但应因种摸索；碳源：常用蔗糖，但应因种摸索；B氮源：常用氮源：常用NO3-和和NH4+，（，（或单用或兼用）；或单用或兼用）；C生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生产具极大影响；产具极大影响；D供给目的产物的直接或近直接前体物质；供给目的产物的直接或近直接前体物质；第二节植物细胞培养和次生代谢物生产56提高次生代谢物产量的途径提高次生代谢物产量的途径v培养条件培养条件:2.物理因子：物理
32、因子：A光质和光量（适量光照）；光质和光量（适量光照）；B温度：温度：2530；C通气：底部通气好；通气：底部通气好；DpH值：值：56第二节植物细胞培养和次生代谢物生产57第三节第三节 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合原生质体（原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细胞；去除全部细胞壁的细胞；亚原生质体（亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）；质的原生质体（有核或无核）；微原生质体（微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素经细胞松弛素B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原处理得到的仅含少量胞
33、质及核或染色体的小原生质体；生质体；原生质球（球状体，原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细残存少量细胞壁的原生质体；胞壁的原生质体；几个名词：几个名词：58植物原生质体研究的意义植物原生质体研究的意义有利于进行远缘杂交；有利于进行远缘杂交；有利于引入生物大分子、细胞器等；有利于引入生物大分子、细胞器等；有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；59植物原生质体的制备(1)机械法：机械法：高渗处理高渗处理植物（植物（外植体，愈伤组织，液培细胞外植体，愈伤组织，液培细胞）质壁分离质壁分离机械切割机械切割原生质体（亚原生质体）原生质体（亚原生质体）缺点
34、：难，少，分生组织不宜；缺点：难，少，分生组织不宜；60酶解法酶解法1.酶的购置与纯化酶的购置与纯化市售的纤维素酶一般都是复合酶，含：市售的纤维素酶一般都是复合酶，含：纤维素酶纤维素酶C1；纤维素酶纤维素酶Cx；纤维二糖酶；纤维二糖酶；果胶酶；果胶酶；磷脂酶；磷脂酶；核酸酶；核酸酶；过氧化物酶；过氧化物酶；酚类；酚类；此外，还有蜗牛酶；此外，还有蜗牛酶；植物原生质体的制备(2)最好应纯化最好应纯化61酶解法酶解法2.取材：取材：干净，高活性干净，高活性A幼嫩的根、茎、叶；幼嫩的根、茎、叶；B悬浮培养的细胞和体细胞胚；悬浮培养的细胞和体细胞胚；无需灭菌，最好同步化；无需灭菌，最好同步化；C花粉母
35、细胞和四分体；花粉母细胞和四分体；分生能力强，应使用蜗牛酶；分生能力强，应使用蜗牛酶；植物原生质体的制备(3)62外植体除菌：外植体除菌：外植体外植体肥皂水洗肥皂水洗清水洗清水洗酒精酒精（75%，10s）次氯酸钠（次氯酸钠（3%，15min）无菌水洗无菌水洗34次次无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干植物原生质体的制备(4)63外植体酶解外植体酶解除菌后叶片除菌后叶片撕去下表皮撕去下表皮切块放入反应液切块放入反应液2530不时轻摇不时轻摇反应液转绿反应液转绿24h植物原生质体的制备(5)64外植体酶解外植体酶解v缓冲液：缓冲液：pH值值5.55.8v渗透压稳定剂：糖、甘露醇、山梨醇等渗透压稳定剂：糖、甘露
36、醇、山梨醇等v膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸钾（硫酸钾（0.3%）v表面活性剂：表面活性剂：Tween80v适当时间适当时间v适当温度适当温度植物原生质体的制备(6)65原生质体分离原生质体分离v过滤法过滤法v离心法（低速）离心法（低速）v漂浮法（不同比重）漂浮法（不同比重）植物原生质体的制备(7)66原生质体洗涤原生质体洗涤以新的渗透压稳定剂或培养以新的渗透压稳定剂或培养液轻轻洗涤液轻轻洗涤24次次;植物原生质体的制备(8)67原生质体鉴定原生质体鉴定1.直接镜检：直接镜检：球形，低渗破裂，荧光增白剂球形，低渗破裂，荧光增白剂(UV下细胞壁下细胞壁显
37、绿色荧光）显绿色荧光）2.活力测定：活力测定：v双醋酸荧光素（双醋酸荧光素（FDA）染色法：）染色法：FDA进入细胞，进入细胞，被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能进不能进入死细胞；入死细胞；v台盼蓝染色：台盼蓝不能进入活细胞；台盼蓝染色：台盼蓝不能进入活细胞；v胞质环流观察；胞质环流观察；植物原生质体的制备(9)68植物原生质体的培养基无机成分无机成分:KNO3725;CaCl22H2O685;MgSO4560;NH4NO3288;K2HPO468;Na2EDTA37.3;Fe2SO47H2O27.8;H3BO43.0;MnSO44H2O10.0;Zn
38、SO47H2O2.0;KI0.75;Na2MoO42H2O0.25;CoCl26H2O0.025;CuSO45H2O0.025糖类：糖类：(mg/Lmg/L)葡萄糖68000；蔗糖250；果糖250；核糖250；木糖250；甘露糖250；甘露醇250；鼠李糖250；山梨醇250；纤维二糖250；维生素：维生素：(mg/L)mg/L)维生素C2.0；维生素B11.0；维生素B61.0；氢化胆碱1.0；对氨基苯甲酸0.02；叶酸0.4；生物素0.01；维生素A0.01；维生素D30.01；维生素B120.01；生长调节物：生长调节物：酪蛋白250；肌醇100；椰子汁20ml；NAA1.0；6BA0
39、.5；2,4-D0.2；有机酸：有机酸：柠檬酸40；苹果酸40；反丁烯二酸20；丙酮酸钠20；V-KM培养基培养基(mg/L)69植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（1）固体平皿培养法固体平皿培养法原生质体悬液原生质体悬液2ml小培养皿小培养皿MS培养基配制的培养基配制的1.2%agar2ml（2528，置大皿内（预加湿滤纸）置大皿内（预加湿滤纸）腊带封口腊带封口培养培养100300lux，12hd-1)分化培养基愈伤组织愈伤组织成苗成苗摇匀摇匀冷却冷却70固体平皿培养法固体平皿培养法优点优点：便于定点观察原生质体不易破裂缺点缺点：通气较差原生质体与琼脂混合不易掌握原生质体过于分
40、散植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（1）71液体培养法液体培养法原生质体置液体培养基中培养，不时轻摇，能较快生长。细胞团形成后应移到固体培养基中才能继续生长或诱导分化成苗。缺点缺点：原生质体易受损通气较差操作较麻烦植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（2）72液体浅层培养法（液液体浅层培养法（液-固法）固法）营养琼脂培养基（0.6%）小皿凝固放置无菌滤纸注入3mL原生质体悬浮液放大皿内（垫湿滤纸）封口保温，光照（或不光照）轻摇愈伤组织分化培养基成苗植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（3）73液体浅层培养法（液液体浅层培养法（液-固法）固法）优点：通气好
41、营养均匀生长较快缺点：需定期添加培养基不易更换培养基植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（3）74小块液培法小块液培法原生质体悬浮液琼脂糖（0.8%）切小块置液体培养基中80100rpm，2528愈伤组织移放分化培养基成苗植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（4）混匀倒平皿凝固75小块液培法优点：缺点：植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（4）76固体活性炭培养基固体活性炭培养基琼脂培养基+1%活性炭原生质体悬浮液平皿培养成苗植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（5）混匀凝固优点：优点：缺点缺点：77混合培养（液体或固体培养基）混合培养（液体或固
42、体培养基）将两种原生质体混合培养将两种原生质体混合培养有何意义？植物原生质体再生培养方法植物原生质体再生培养方法（6）78植物原生质体融合回顾植物原生质体融合回顾1909Kuster把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中，见质壁分离的亚原生质体，复原时观察到亚原生质体的融合；1931Plower用针插入原生质体，使质膜和液泡膜融合；1937Michels观察到同种和不同种原生质体的融合；1960Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体；1970Power用NaNO3使燕麦和玉米的原生质体融合；1971Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株；1972Carlson首次经原生质体融合获得种
43、间杂种烟草；1973Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合；1974Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合；1977Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合；1978Melchers获得属间杂种（番茄马铃薯）；1979Senda提出电激法融合原生质体；1987斯维格将电融合与微培养结合；79化学法诱导融合化学法诱导融合（无菌操作）v按一定比例混合双亲原生质体悬液；v吸一份混合液于表面皿上，静置10min；v滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，轻轻摇匀；PEG溶液组成：PEG50%（MW=15606000)glucose0.1mol/LCaCl210.5mmol/LKH2PO40.7mmol/Lp
44、H5.5植物原生质体融合（植物原生质体融合（1）80植物原生质体融合（2）化学法诱导融合化学法诱导融合(续前）v25保温1545min，不时轻摇；v滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；高钙高高钙高pH溶液组成溶液组成：glycine50mmol/LCaCl250mmol/Lglucose300mmol/LpH10.5v1015min后，再滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀；v1015min后，再加12mL原生质体培养液，摇匀；v用20mL原生质体培养液洗5次，间隔5min；v加0.5mL原生质体培养液，微滴培养；81物理法诱导融合物理法诱导融合v微电极法微电极法两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质
45、体表面接触，用512A的电流刺激15毫秒，促成融合。v平行电极法平行电极法相距200m的微电极插入原生质体溶液中，先通入交变电场，使其紧密接触成串珠状；再施以适当电脉冲，原生质体接触区发生可逆击穿而融合；植物原生质体融合（3）82不对等细胞融合不对等细胞融合（灭活一方原生质体）植物原生质体融合（4）83原生质体融合后的产物原生质体融合后的产物1.亲和杂种细胞（难）2.部分亲和的杂种细胞含双方胞质及一方核含双方胞质及一方核和少量它方染色体（细胞周期短或继代次数少的一方，染色体易保留）3.异核质杂种（少）4.嵌合植株84融和体的鉴别融和体的鉴别细胞鉴别细胞鉴别细胞大小色素有无细胞核大小荧光鉴别植株
46、鉴别植株鉴别形态特征染色体显带同功酶法、过氧化物酶法分子杂交法RFLP法RAPD法85杂种细胞筛选杂种细胞筛选显微操作法显微操作法要有：可识别标志显微操作仪能培养单个原生质体的培养基遗传互补法遗传互补法要有具突变标记的品种1.白化互补法2.生长互补法3.抗性互补法4.代谢互补法86西红柿与马铃薯杂交研究进展西红柿与马铃薯杂交研究进展1971年，Power提出设想1978年，Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株1983年，Shepard亦融合成功亟待解决的问题：1.哪些基因和条件决定果实与块茎的形成2.光合作用产物的运输方向与分配3.光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需
47、要1994年,Schoenmakers继续本研究1995年，Wolters还在研究87第四节第四节单倍体植物的诱发与利用单倍体植物的诱发与利用一一.单倍体植物的特点：单倍体植物的特点：株矮，叶、花、果小，生活力弱；高度不育；？88二二.单倍体植物的利用单倍体植物的利用：可加快培育新品种；有利于突变体的选择与利用；？第四节单倍体植物的诱发与利用（2）89三三.诱导产生单倍体植株的途径：诱导产生单倍体植株的途径：(一）自然发生1.孤雌生殖2.孤雄生殖3.无融合生殖第四节单倍体植物的诱发与利用（3）90三三.诱导产生单倍体植株的途径：诱导产生单倍体植株的途径：(二）人工诱导：1.花药培养：1.1选取
48、成熟度适中的花蕾或幼穗选取成熟度适中的花蕾或幼穗；1.2花药预处理花药预处理；1.3选择适当的培养基与培养条件：选择适当的培养基与培养条件：1.3.1只需简单培养基；只需简单培养基；1.3.2培养基尚需添加激素；培养基尚需添加激素；1.3.3培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺；培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺；第四节单倍体植物的诱发与利用（4）911.4 1.4 培养条件培养条件：降低气压；纯N2密闭处理3060min，或掺入O22.55.0%；0.5mol/L甘露醇处理2天；花药平放；适当密植；第四节单倍体植物的诱发与利用（5）921.5花药单倍体植株的形成途径：1.5.1生殖细胞退化
49、，由营养细胞分裂产生；（常见）1.5.2小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞，直接分裂、分化长成；（常见）1.5.3营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚的形成；1.5.4仅由生殖细胞分裂形成；第四节单倍体植物的诱发与利用（6）932.离体花粉培养挤压法分离花粉；自然散开法分离花粉；3.未授粉子房或胚珠的培养4.杂交法获单倍体植株第四节单倍体植物的诱发与利用（7）945.5.单倍体植物的加倍单倍体植物的加倍用秋水仙素（0.20.4%）处理2448h；加倍方式？第四节单倍体植物的诱发与利用（8）95Section 5.Researches on Section 5.Researches on Ar
50、tificial SeedsArtificial Seeds人工种子的研制（人工种子的研制（1 1）人工种子人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其它成分的人工胶囊；分、激素以及其它成分的人工胶囊；人工种子的构成人工种子的构成：胚状体：由组织培养或细胞培养产生；胚状体：由组织培养或细胞培养产生；人工胚乳：营养物质人工胚乳：营养物质+激素激素+农药农药+抗生素抗生素+除草剂等；除草剂等；人工种皮：抗压，保水，透气；人工种皮：抗压，保水，透气；96Characters of artificial seedsCharacters of artificial see