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1、 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB 4789.3 2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 GB 4789.3 2010 I 前 言 本标准代替 GB/T 4789.3-2008食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数。 本标准与 GB/T 4789.3-2008 相比，主要修改如下： 修改
2、了标准的中英文名称； “ 第二法 大肠菌群平板计数法 ” 的平板菌落数的选择范围修改为 “ 15 CFU 150 CFU” ； 删除了 “ 第三法 大肠菌群 PetrifilmTM 测试片法 ” 。 本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB 4789.3-1984、 GB 4789.3-1994、 GB /T 4789.3-2003、 GB /T 4789.3-2008。 GB 4789.3 2010 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 1 范围 本标准规定了食品中大肠菌群（ Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中
3、大肠菌群的计数。 2 术语和定义 2.1 大肠菌群 coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数 most probable number， MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱： 36 1 。 3.2 冰箱： 2 5 。 3.3 恒温水浴箱： 46 1 。 3.4 天平：感量 0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移
4、液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 3.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.11 菌落计数器。 4 培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ Lauryl Sulfate Tryptose， LST）肉汤：见附录 A 中 A.1。 GB 4789.3 2010 2 4.2 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile， BGLB）肉汤：见附录 A 中 A.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar， VRBA）：见附录 A 中 A.3。 4.4 磷
5、酸盐缓冲液：见附录 A 中 A.4。 4.5 无菌生理盐水：见附录 A 中 A.5。 4.6 无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A 中 A.6。 4.7 无菌 1 mol/L HCl：见附录 A 中 A.7。 GB 4789.3 2010 3 第一法 大肠菌群 MPN 计数法 5 检验程序 大肠菌群 MPN 计数的检验程序见图 1。 检 样 25 g(mL)样品 +225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择适宜 3 个连续稀释度的样品匀液，接种 LST 肉汤管 36 1 48h2h 不产气 产 气 BGLB 肉汤 36 1 48 h2 h 不产气 产 气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳
6、性 查 MPN 表 报告结果 图 1 大肠菌群 MPN 计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品 ： 称取 25 g 样 品 ,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 , 8000 r/min 10000 r/min 均质 1 min 2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打 1 min 2 min，制成 1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分
7、混匀，制成 1:10 的样品匀液。 6.1.3 样品匀液的 pH 值应在 6.5 7.5 之间，必要时分别用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 调节。 GB 4789.3 2010 4 6.1.4 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL 磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌 吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用
8、1 支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST）肉汤，每管接种 1mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤），36 1 培养 24 h2 h，观察倒管内是否有气泡产生， 24 h2 h 产气者进行复发酵试验，如未产气则继续 培养至 48 h2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 6.3 复发酵试验 用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1 环 ， 移种于煌绿乳糖胆盐
9、肉 汤 （ BGLB） 管 中 ，36 1 培养 48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4 大肠菌群最可能数（ MPN）的报告 按 6.3 确证的大肠菌群 LST 阳性管数，检索 MPN 表（见附录 B），报告每 g（ mL）样品中大肠菌群的 MPN 值。 第二法 大肠菌群平板计数法 7 检验程序 大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2。 检 样 25 g(mL)样品 +225 mL 稀释液，均质 10 倍系列稀释 选择 2 个 3 个适宜稀释度的样品匀液，接种 VRBA 平板 36 1 18h24h 计数典型和可疑菌落 BGLB 肉汤 36 1 24h48h 报告结果
10、 图 2 大肠菌群平板计数法检验程序 GB 4789.3 2010 5 8 操作步骤 GB 4789.3 2010 6 8.1 样品的稀释 按 6.1 进行。 8.2 平板计数 8.2.1 选 取 2 个 3 个 适 宜的连续稀释度 , 每个 稀 释度接种 2 个 无菌平皿 ， 每皿 1 mL。 同 时取 1 mL 生理盐 水加入无菌平皿作空白对照。 8.2.2 及时将 15 mL 20 mL 冷至 46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA）约倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加 3 mL 4 mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平 板，置于 36 1 培养
11、 18 h 24 h。 8.3 平板菌落数的选择 选取菌落数在 15 CFU 150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。 8.4 证实试验 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内， 36 1 培养 24 h 48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 8.5 大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以 8.3 中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每 g （ mL）样品中大肠菌群
12、数。例： 10-4样品稀释液 1 mL，在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑取 其中 10 个 接 种 BGLB 肉汤管 ， 证实有 6 个阳性管 ， 则该样品的大肠菌群数为 ： 1006/10104/g（ mL）=6.0105 CFU/g（ mL）。 GB 4789.3 2010 7 附录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST）肉汤 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾（ K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水
13、1 000 mL pH 6.80.2 A.1.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。 121 高压 灭菌 15 min。 A.2 煌绿乳糖胆盐（ BGLB）肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉（ oxgall 或 oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 800 mL pH 7.20.1 A.2.2 制法 将蛋白胨 、 乳糖溶于约 500 mL 蒸馏 水 中 ， 加入 牛 胆粉溶液 200 mL（将 20.0 g 脱水牛胆粉溶于 200 mL 蒸馏水中，调节 pH 至
14、 7.0 7.5），用蒸馏水稀释到 975 mL，调节 pH，再加入 0.1%煌绿水溶液13.3 mL， 用蒸馏水补足到 1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管 10 mL。121 高压灭 菌 15 min。 A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（ VRBA） A.3.1 成分 蛋白胨 7.0 g 酵母膏 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 胆盐或 3 号胆盐 1.5 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15 g 18 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.40.1 GB 4789.3 2010 8 A.3.2 制法 将上述成分溶于蒸馏水
15、中，静置几分钟，充分搅拌，调节 pH。煮沸 2 min，将培养基冷却至 45 50 倾注平板。使用前临时制备，不得超过 3 h。 A.4 磷酸盐缓冲液 A.4.1 成分 磷酸二氢钾（ KH2PO4） 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.4.2 制法 贮存液 ： 称取 34.0 g 的磷 酸 二氢钾溶于 500 mL 蒸馏 水 中 ， 用大 约 175 mL 的 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH，用蒸馏水稀释至 1 000 mL 后贮存于冰箱。 稀释液 ： 取贮存液 1.25 mL， 用蒸馏水稀释至 1 000 mL， 分装于适宜容器中 ， 121 高压灭 菌 15 mi
16、n。 A.5 无菌生理盐水 A.5.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.5.2 制法 称取 8.5氯化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中， 121 高压灭菌 15 min。 A.6 1 mol/L NaOH A.6.1 成分 NaOH 40.0 g 蒸馏水 1000 mL A.6.2 制法 称取 40 g 氢氧化钠溶于 1 000 mL 蒸馏水中， 121 高压灭菌 15 min。 A.7 1 mol/L HCl A.7.1 成分 HCl 90 mL 蒸馏水 1 000 mL A.7.2 制法 移取浓盐酸 90 mL，用蒸馏水稀释至 1 000 mL， 121 高压灭菌
17、 15 min。 GB 4789.3 2010 9 附录 B （规范性附录） 大肠菌群最可能数（ MPN）检索表 B.1 大肠菌群最可能数（ MPN）检索表 每 g（ mL）检样中大肠菌群最可能数（ MPN）的检索见表 B.1。 表 B.1 大肠菌群最可能数（ MPN）检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 阳性管数 MPN 95%可信限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 1100 420 - 注 1：本表采用 3 个稀释度 0.1 g(mL)、 0.01 g(mL)和 0.001 g(mL)，每个稀释度接种 3 管。 注 2： 表内所列检样量如改用 l g （ mL） 、 0.1 g(mL)和 0.01 g(mL)时 ， 表内数字应相应降低 10 倍 ； 如改用 0.01 g(mL)、 0.001 g(mL)、 0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高 10 倍，其余类推。