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1、RNA i技术及其应用陈振东1,韦晓新2,吴永官1(1.广西农业科学院蔬菜研究中心,广西南宁530007;2.广西百色国家农业科技园区,广西百色533000)摘要 RNAi主要通过双链RNA(dsRNA)被核酸酶切割成2123 nt的干涉性小的RNA,即 siRNA,由 siRNA介导识别并靶向切割同源性靶 mRNA分子而实现。目前 RNAi技术在基因功能和基因治疗等方面的研究有了广泛的应用,RNA i技术有望成为后基因组时代基因功能分析的有力工具。关键词 RNAi;作用机制;应用中图分类号 S188文献标识码A 文章编号 0517-6611(2008)35-15373-02RNA i Tec
2、hnology and Its Appli cationCHENZhen2 dong et al(Vegetable ResearchCenter,GuangxiAcademy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi530007)Abstract RNA interference(RNA i)refers to the gene silencing phenomenon induced by double2strandedRNA s.Its realization ismainlythrough nuclease incising dsRNA into
3、 21-23 nucleotide,which is a s mall interfering RNA(si RNA),and siRNA mediates to recognizeRNA iand target to homologymRNA.At present,RNA i technologywas widely used in the researchof gene function and gene therapy and otherfields.RNAi technologywas sohopeful as to becomeapowerful tool for genefunct
4、ion analysis in the post2 genomeera.Key wordsRNA i;Mechanism;App lication作者简介 陈振东(1978-),男,广西南宁人,助理研究员,从事蔬菜遗传育种及病虫害防治技术研究。收稿日期 2008210214RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过实验手段向细胞内导入长的双链RNA或者细胞内源性产生一些短片段的双链RNA,这些短片段的双链RNA(double2stand RNA,dsRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因的表达,使细胞出现特定基因缺失的表型siRNA(s m
5、all interference RNA)就是这种短片段双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA,最终使相应的基因沉默。由于这种现象发生在转录后,故又称为转录后基因沉默(post2transcri p tional gene silen2cing,PTGS)1。RNA i技术不仅揭示了细胞内基因沉默的机制,而且有望成为后基因组时代基因功能分析的有力工具,是继酵母杂交系、DNA芯片、基因敲除、反义RNA等技术之后的又一解读基因功能的有效研究手段,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程 2。下面就RNA i的发现过程、作用原理及其应用等进行综述。1RNA i的发现RNA
6、干扰现象最早是在1990年由Jorgensen研究组意外发现的,将编码紫花色素的多拷贝基因转入矮牵牛,并没有产生预期的深紫色花,相反却产生了白花和白紫杂色的矮牵牛花 3。因为不知何故不仅被转入的基因发生沉默,还导致了植物自身的紫花基因的沉默。1992年,Romano和Maci2no也在粗糙链孢霉(N eurospora crassa)中发现,外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达 4;1995年,Guo和Kemphues博士也在线虫中发现了RNA的干扰现象5。因为反义RNA可以和内源的mRNA结合形成双链RNA分子而被降解,Guo和Kemphues试图用反义RNA的方法来研究线虫内源
7、基因par21的功能,但他们却意外地发现作为正对照的导入正义RNA的线虫体内,par21 mRNA也同样被降解了。但就当时来说,这些现象令人迷惑,并且人们开始思考是否还存在其他的调控机理。直到1998年2月,华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Mell o才首次揭开这个悬疑之谜。他们将正义链和反义链的混合物注入线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默5-6。他们证实,Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。Fire和Mell o的这一发现发表在1998年2
8、月19日的Nature杂志上 7。在这篇文章中,Fire和Mell o首次将这种双链RNA引起的基因沉默现象称为RNA干扰。在随后的短短几年中,RNA i现象在真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中被发现。这种存在揭示了RNA i很可能出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入,RNA i的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组研究领域中的有效工具,RNA i也越来越为人们所重视 8-12。2RNA i的作用机制PTGS被认为是一种有dsRNA参与指导的13,以外源和内源mRNA为降解目标的,具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒人侵后,细胞中与转
9、基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象 14-16,它表现为这些基因发生了转录产生了mRNA,但是很快被降解而不能在细胞内积累,最终使相应的基因得不到表达而表现基因沉默。RNA i的作用过程是多步骤、多因素参与的复杂过程,大致经历3个阶段即起始阶段、效益阶段和扩增阶段 17。2.1 起始阶段 由RNA病毒入侵、转座子转录或基因组中反向重复序列转录等所产生的ds RNA分子在细胞内达一定量时,会被一种特异性核酸内切酶所识别。这种酶被认为是核酸酶(Rnase)家族核酸酶(D icer),是一种ATP依赖性内切酶,具有4个开放阅读区18。在基因Rde21编码的蛋白的帮助下dsRNA与D
10、 icer结合,形成酶 2dsRNA复合体,在ATP作用下,D icer先将dsRNA解旋,接着在内切酶的作用下将其切割为2123个核苷酸小片段,其3 2 端为羟基,且有2个安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(35):15373-15374,15383责任编辑 王淼 责任校对 吴晓燕突出的单核苷酸和5 2 端为磷酸基团,这些小片段RNA称为小干涉RNA(s mall interfering RNA,siRNA)19。此结构对于siRNA行使其功能非常关键,剪切位点一般在U处,具特异性。2.2效应阶段 生成的siRNA双链与一些酶和相关因子共同组成R
11、NA介导的沉默复合体(RNA2induced silencing co m2plex,R IS C),具有序列特异性的核酸内切酶活性,能特异性地降解与siRNA同源的靶mRNA,导致特定基因沉默。当ATP存在时,RIS C中依赖ATP的解旋酶在ATP供能下解开siRNA双链,释放出正义RNA链,反义RNA单链作为选择目标的向导,并与靶mRNA的同源序列互补结合,然后由活化的R IS C中的核酸内切酶在互补区的中间距siRNA反义链3 2 末端12 bp处切断靶mRNA序列 20,切割成很多的具有2123 nt的siRNA片段。RIS C犹如一个mRNA降解平台,可与不同的siRNA结合,并在不
12、同的情况下结合不同的调节分子,实现对不同的靶mRNA的切割与降解21。2.3扩增阶段 新生成的siRNA和活性的R IS C又进入以上循环。这种过程被称为随机降解性多聚酶链式反应(ran2do m degradative PCR)22。新生的dsRNA反复合成和降解,不断产生新的siRNA,而使靶mRNA渐进性地减少,表现出基因沉默现象。同时,结合了R IS C的靶mRNA也会被内切酶切割,mRNA链上缺乏poly(A)尾巴和稳定头部的保护,而被快速降解。3RNA i技术的应用3.1 基因功能上的研究 基因功能的研究是一种研究基因功能的新工具,RNA i在细胞中具有抑制或灭活特异的基因的功能,
13、可以产生类似基因“敲除”的效应,是功能基因组研究的有效工具,这一技术比基因敲除技术具有明显投入少、周期短、操作简单等优势,它的应用将为基因功能的研究开辟新途径 23-24。Xiao等、Prasad和V ijoyraghavan利用RNA i分别对水稻O s MADS16、O s MADS2基因功能进行了分析,发现OsMADS16能控制水稻花器官的第二、三轮的发育,O s MADS2基因被抑制的植株,其花器官形态有明显改变 25-26。在烟草中,N ishihara等抑制烟草中CHI的表达,证实CH I基因与花色的形成有关27。A shrafi等用已建立的dsRNA细菌表达文库筛选与脂肪储存有关
14、的基因,发现417个基因与脂肪储存有关,其中有许多脂肪代谢调节基因与哺乳动物中的同源28。在线虫、大鼠的基因功能研究方面均取得理想的效果。3.2植物抗病的研究 RNA i具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动等作用,因此可利用RNA i产生抗病毒的植物,及利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的ds RNA抵抗多种病毒。W aterhouse等首次将马铃薯Y病毒(Potat o virus Y,P VY)的辅助因子蛋白(Helper2co mponent proteinase,HC2Pro)基因分别正向或反向转入马铃薯,结果发现其后代对P VY产生抗性或具有免疫作用 29。在其他病毒的相关研究也获得
15、类似的结果。3.3基因治疗上的研究 基因治疗由于RNA i可以特异性的抑制基因表达,所以可用于基因病、病毒感染或寄生病原性蛋白表达引起的疾病、癌症的治疗,尤其有希望用于抑制癌基因或突变基因引起的癌症的基因治疗之中 30。在抗癌症研究方面,张鹏辉等利用DNA载体 RNA i技术,构建了重组表达质粒pTzu6+l2shRNA2hTERT,并成功导人肝癌细胞株S MMC27721及裸鼠皮下移植瘤,发现siRNA诱导的RNA i明显抑制hTERT基因的表达及肝癌细胞增殖,逆转肝癌细胞的恶性表型 31。在抗病毒的研究方面,也取得较为明显的效果,目前已有利用RNA i技术成功抑制体外培养细胞中的H I V
16、、HCV、HDV、HPV、流感病毒等病毒基因在宿主细胞内表达或复制的研究报告 32。4 展望RNAi有着古老的根源,在进化过程中具有抵抗病毒入侵、抑制转座子活性,是生物天然防御系统的重要组成部分。尽管自RNA i的发现至今仅经历了近10年的时间,RNAi技术在基因功能研究及基因治疗等方面已经取得了许多重要的成果,但对于RNA i技术的作用机制仍需要更进一步的研究,这个机制中,包括R ISC的蛋白成分,R IS C是如何与siRNA结合的,这之间是否产生双链DNA与siRNA结合的三链结构,是否还存在着其他的过程,是否有其他的大分子参与其中,不同的受体细胞中这一机制的差异如何,以及与这一机制有关
17、的基因有哪些,它们是如何联合起来调控这一过程的等等,所有这些问题都是需要进一步深入研究的。虽然面临许多困难,但有理由相信,伴随人类基因组计划实施获得的成果,借助广大科学家们辛勤的耕耘,RNA干扰技术将在基因功能研究、基因治疗、动植物品种改良及其植物抗病研究等方面有广阔的应用前景。参考文献1 TO MAR I Y,ZAMORE P D.Pers pective:machines for RNAi J.GenesDev,2005,19:571-529.2 付博,邵淑丽.RNA干扰的机制与应用 J.高师理科学刊,2004,24(4):49-51.3 NAPOL IC,LE M IEUX C,JORG
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23、nd counterdefenseJ.Science,2001,292:2277-2280.(下转第15383页)47351 安徽农业科学 2008年GH基因信号肽序列不能为大肠杆菌很好地识别5,会严重影响融合蛋白的产量。为获得较高的表达量,该试验在密码子设计时去掉了GH基因的信号肽序列,只表达其成熟肽,得到的融合蛋白产物是不可溶包涵体。这种包涵体未经过正常折叠,不具有天然生长激素蛋白的空间结构,因而不具有促生长作用,需要利用尿素和盐酸胍,经过溶解、复性,即可恢复其生物学活性。然而,如果在表达过程中设法降低蛋白质转录和合成的速度,如降低表达温度和诱导剂剂量、延长表达时间等,可以直接表达出可溶性
24、的融合蛋白6。这样可避免后期包涵体分离、复性的操作。臧晓南等通过优化大肠杆菌表达条件,得到了牙鲆(Paralichthysolivaceus)生长激素成熟肽可溶性的融合蛋白,但表达量比较低,只有细胞蛋白的7.1%9.3%,而 包 涵 体 的 表 达 量 则 可 以 达 到18.3%7。(3)此外,若要获得较高的融合蛋白表达量,载体质粒的选择也十分重要。一般要求表达质粒具有较强的启动子、表达菌株对质粒启动子识别能力强且易于诱导。该研究所使用的原核表达质粒pRSET2A其转录模式为诱导调控型表达,只有在IPTG存在的条件下才表达目的产物。这种转录模式可以有效避免菌体生长前期高表达对菌体生长的不利影
25、响 5。另外,pRSET2A带有专一性T7嗜菌体启动子,启动功能强;大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS含有一个T7 RNA聚合酶基因,能在细菌内合成T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶能专一性识别T7强启动子,且具有比大肠杆菌RNA聚合酶高数倍的转录效率 8,其竞争优势使宿主菌的绝大部分细胞资源都用于表达目的蛋白。杜启艳等使用同样带有T7启动子的原核表达质粒pET228a,在BL21(DE3)表达鲶鱼(Silurus asotusL.)的GH成熟肽,融合蛋白表达量高达细胞总蛋白的50%9。该研究融合蛋白的表达量为细胞总蛋白的36.8%,达到了较好的表达效果,所构建的原核表达体系效率较高
26、,为将来革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。参考文献 1 SEKINE S,M IZUKAM I T,N IS H I T,et a1.Cloning and ex pression of c DNAfor sal mon hor mone inEscherichia coliJ.Proc Natl Acad SciUSA,1985,82:4306-4312.2 AGELLON L B,CHEN T T.Rainbow trout growth hormone:Molecular clo2ning of Cdna and ex pressi on inEscherichia coli
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