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1、第四章第四章 生物制品生产的生物制品生产的 根本技术根本技术主讲教师：赵凯主讲教师：赵凯 博士博士E-mailE-mail：电电 话：话：第一节第一节 菌菌(毒、虫毒、虫)种的选育培养与保藏种的选育培养与保藏 一、生物制品菌一、生物制品菌(毒、虫毒、虫)种的分类种的分类生物制品中使用的菌生物制品中使用的菌(毒、虫毒、虫)种的范围很广种的范围很广泛，包括生产和检定疫苗、毒素、类毒素、泛，包括生产和检定疫苗、毒素、类毒素、抗血清以及诊断用品等的菌抗血清以及诊断用品等的菌(毒、虫毒、虫)种，并种，并随着生物制品种类的增多和生物制品技术的随着生物制品种类的增多和生物制品技术的开展，菌开展，菌(毒、虫毒
2、、虫)种的内容也会不断增加。种的内容也会不断增加。一、按菌一、按菌(毒、虫毒、虫)种的毒力分类种的毒力分类1 1、强毒菌、强毒菌(毒、虫毒、虫)种种 n是指具有强大致病力的菌是指具有强大致病力的菌(毒、虫毒、虫)种，种，一般免疫原性也良好，常用于制造某些灭一般免疫原性也良好，常用于制造某些灭活疫苗，抗血清以及疫苗效力检验。活疫苗，抗血清以及疫苗效力检验。2 2、弱毒菌、弱毒菌(毒、虫毒、虫)种种 n是指对动物无致病力而具有一定免疫原是指对动物无致病力而具有一定免疫原性的菌性的菌(毒、虫毒、虫)种，主要用于制造弱毒活种，主要用于制造弱毒活苗。苗。二、按菌二、按菌(毒、虫毒、虫)种的用途分类种的用
3、途分类1 1、生产用菌、生产用菌(毒毒、虫、虫)种种 n是指是指用于生产生物制品的菌用于生产生物制品的菌(毒毒、虫、虫)种，即指种，即指生产疫苗生产疫苗、抗毒素、类毒素、抗血清及诊断用品、抗毒素、类毒素、抗血清及诊断用品的菌、毒种。的菌、毒种。如生产猪瘟兔化弱毒疫苗用的猪瘟种毒，生产如生产猪瘟兔化弱毒疫苗用的猪瘟种毒，生产破伤风类毒素的破伤风菌种，生产炭疽抗血清的破伤风类毒素的破伤风菌种，生产炭疽抗血清的号炭疽杆菌号炭疽杆菌C40C402222菌种，制造牛型结核菌素的菌种，制造牛型结核菌素的牛型结核杆菌牛型结核杆菌菌种等菌种等二、按菌二、按菌(毒、虫毒、虫)种的用途分类种的用途分类2 2、检定
4、用菌、检定用菌(毒、虫种毒、虫种 是指用于检定生物制品效力等菌是指用于检定生物制品效力等菌(毒、虫毒、虫)种。种。如效力检验中攻毒用的新城疫强毒，猪丹毒强如效力检验中攻毒用的新城疫强毒，猪丹毒强毒菌种等。另外，还包括用于检定诊断血清交毒菌种等。另外，还包括用于检定诊断血清交叉反响的菌毒、虫种。叉反响的菌毒、虫种。3 3、工具用菌毒、虫种、工具用菌毒、虫种是指在生物制品生产中作为工具使用的菌是指在生物制品生产中作为工具使用的菌毒、虫种。如基因工程中表达某些异种抗原毒、虫种。如基因工程中表达某些异种抗原用的宿主大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等。用的宿主大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等。二、生物制品中菌二、
5、生物制品中菌(毒、虫毒、虫)种的条件种的条件菌毒、虫种是决定生物制品质菌毒、虫种是决定生物制品质量的重要因素，悬于培养好的菌毒、量的重要因素，悬于培养好的菌毒、虫种也是生物制品工作中最重要的虫种也是生物制品工作中最重要的一环。好的菌毒、虫种应具备如一环。好的菌毒、虫种应具备如下条件。下条件。一、具有良好的免疫原性一、具有良好的免疫原性由于生物制品主要是免疫制剂，故耍求菌由于生物制品主要是免疫制剂，故耍求菌(毒、虫毒、虫)种应具种应具有良好的免疫原性，使用后能产生坚强的体液免疫和细胞免有良好的免疫原性，使用后能产生坚强的体液免疫和细胞免疫，并持续较长时间，同时对某些菌疫，并持续较长时间，同时对某
6、些菌(毒，虫毒，虫)种而言还应是种而言还应是抗原谱广。抗原谱广。一般来说，动物接种后产生一般来说，动物接种后产生8080以上的保护即为有良好的以上的保护即为有良好的免疫原性。因为机体的免疫反响是一个生物学过程，受到遗免疫原性。因为机体的免疫反响是一个生物学过程，受到遗传、环境等许多因素的影响，不管使用菌传、环境等许多因素的影响，不管使用菌(毒、虫毒、虫)种的免疫种的免疫原性多么好，都不可能一次使免疫动物获得原性多么好，都不可能一次使免疫动物获得100100的保护。的保护。生物诊断用品的菌生物诊断用品的菌(毒、虫毒、虫)种应以少量注入动物体内就能种应以少量注入动物体内就能产生强烈免疫反响，这样才
7、能生产出既特异又灵敏的诊断用产生强烈免疫反响，这样才能生产出既特异又灵敏的诊断用品。品。二、具有可靠的平安性二、具有可靠的平安性生物制品使用的菌生物制品使用的菌(毒、虫毒、虫)种除具有良好的种除具有良好的免疫原性外还应平安。菌免疫原性外还应平安。菌(毒、虫种的平安性毒、虫种的平安性主要与两方面的因素有关，一方面是菌主要与两方面的因素有关，一方面是菌(毒、虫毒、虫)种本身的剩余毒力；另一方面是混有强毒或其种本身的剩余毒力；另一方面是混有强毒或其他病原体。他病原体。剩余毒力是指减毒后的弱毒菌剩余毒力是指减毒后的弱毒菌(毒、虫毒、虫)种仍种仍残存一定的毒力或致病力。如鸡新城疫残存一定的毒力或致病力。
8、如鸡新城疫系弱系弱毒疫苗种毒就保持较强的毒力，对雏鸡接种后毒疫苗种毒就保持较强的毒力，对雏鸡接种后有致病性，而有致病性，而2 2个月龄以上的鸡接种才平安。个月龄以上的鸡接种才平安。二、具有可靠的平安性二、具有可靠的平安性在菌在菌(毒、虫毒、虫)种的选育培养时，尽量降低毒力，种的选育培养时，尽量降低毒力，保持良好的抗原性，使动物接种后既能产生良好的保持良好的抗原性，使动物接种后既能产生良好的免疫，又不致于引起发病或损伤。免疫，又不致于引起发病或损伤。而在实践中，一般免疫原性与毒力呈正相关，免而在实践中，一般免疫原性与毒力呈正相关，免疫原性强毒力也强。如果采用某种方法使毒力降低，疫原性强毒力也强。
9、如果采用某种方法使毒力降低，免疫原性也随之降低。用于生产灭活疫苗的强毒都免疫原性也随之降低。用于生产灭活疫苗的强毒都有很好免疫原性，而用于生产活疫苗的弱毒，免疫有很好免疫原性，而用于生产活疫苗的弱毒，免疫原性都有一定程度下降。这是选育培养菌原性都有一定程度下降。这是选育培养菌(毒、虫毒、虫)种时需要注意和解决的一个矛盾，从某种意义上讲种时需要注意和解决的一个矛盾，从某种意义上讲平安更为重要。平安更为重要。二、具有可靠的平安性二、具有可靠的平安性在菌在菌(毒、虫毒、虫)种的选育培养过程中还要防止种的选育培养过程中还要防止污染强毒和其他病原体，尤其是用于活疫苗生污染强毒和其他病原体，尤其是用于活疫
10、苗生产的菌产的菌(毒、虫毒、虫)种。种。因为在生产活疫苗时，不加任何灭活剂，使因为在生产活疫苗时，不加任何灭活剂，使污染的强毒和病原体得不到应有的处理。污染的强毒和病原体得不到应有的处理。对于毒种来说，控制污染外源病原体是较难对于毒种来说，控制污染外源病原体是较难的。因为用于病毒培养的细胞、鸡胚及动物不的。因为用于病毒培养的细胞、鸡胚及动物不易做到完全无污染。易做到完全无污染。三、具有典型的生物学性状三、具有典型的生物学性状p选育培养的菌选育培养的菌(毒、虫毒、虫)种要有典型的生物学性状，如形种要有典型的生物学性状，如形态、染色、培养特性、生化特性、抗原结构、致病性、宿态、染色、培养特性、生化
11、特性、抗原结构、致病性、宿主适应范围、代谢产物、色素产生以及抵抗力等。主适应范围、代谢产物、色素产生以及抵抗力等。p这些生物学性状是鉴别菌这些生物学性状是鉴别菌(毒、虫毒、虫)种的重要标志，可用种的重要标志，可用以区分其他微生物，进而在生产和检定生物制品时依据这以区分其他微生物，进而在生产和检定生物制品时依据这些性状来控制质量。些性状来控制质量。p如果发现某些性状改变就标志着菌如果发现某些性状改变就标志着菌(毒、虫毒、虫)种发生了变种发生了变异或发生外源污染，应及时废弃或更换，如果是用弱毒或异或发生外源污染，应及时废弃或更换，如果是用弱毒或无毒菌无毒菌(毒、虫毒、虫)种生产生物制品，这些性状也
12、是区别强毒种生产生物制品，这些性状也是区别强毒株的标志，从而保证制品的平安性和免疫原性。株的标志，从而保证制品的平安性和免疫原性。四、具有遗传稳定性和一致性四、具有遗传稳定性和一致性p微生物在传代和生产过程中，由于大量增殖时基因突微生物在传代和生产过程中，由于大量增殖时基因突变而表现出某些特性变异。如形态、生化特性、毒力、变而表现出某些特性变异。如形态、生化特性、毒力、抗原性及药物敏感性的变异。抗原性及药物敏感性的变异。p人工选育培养弱毒菌毒、虫人工选育培养弱毒菌毒、虫)株就是利用毒力变异的株就是利用毒力变异的特性在一定条件下经屡次传代而使毒力减弱的。特性在一定条件下经屡次传代而使毒力减弱的。
13、p然而，选育出的菌然而，选育出的菌(毒、虫毒、虫)种在用于生产时要注意具种在用于生产时要注意具有稳定的遗传特性和保持微生物群体的一致性，尤其是有稳定的遗传特性和保持微生物群体的一致性，尤其是毒力和免疫原性的遗传稳定性，以防止毒力返祖和免疫毒力和免疫原性的遗传稳定性，以防止毒力返祖和免疫原性下降，从而确保生物制品的质量。原性下降，从而确保生物制品的质量。四、具有遗传稳定性和一致性四、具有遗传稳定性和一致性p一般采用限制菌一般采用限制菌(毒、虫毒、虫)种的传代次数和培养条种的传代次数和培养条件来控制变异幅度，并定期进行检定。件来控制变异幅度，并定期进行检定。发现有性发现有性状变化时可通过育种、传代
14、、蚀斑纯化等方法来状变化时可通过育种、传代、蚀斑纯化等方法来恢复性状；如果在微生物群体中发现性状不一致，恢复性状；如果在微生物群体中发现性状不一致，可采用传代和筛选等方法进行纯化，例如，细菌可采用传代和筛选等方法进行纯化，例如，细菌可挑选典型的单个菌落，病毒可挑选蚀斑进行纯可挑选典型的单个菌落，病毒可挑选蚀斑进行纯化。化。p菌菌(毒、虫毒、虫)种在遗传上的稳定性和一致性对生产种在遗传上的稳定性和一致性对生产至关重要。至关重要。五、历史及有关资料清楚完整五、历史及有关资料清楚完整对于菌对于菌(毒、虫毒、虫)种要有明确的来源，种要有明确的来源，别离时动物病情及流行情况，传代及生别离时动物病情及流行
15、情况，传代及生物学和免疫学特性，生产工艺质量检定，物学和免疫学特性，生产工艺质量检定，动物试验等各方面的研究资料和数据都动物试验等各方面的研究资料和数据都应完整。这样的菌应完整。这样的菌(毒、虫毒、虫)种方可用于种方可用于生物制品。生物制品。第一节 细胞生物学研究的内容与现状生物制品用的菌生物制品用的菌(毒、虫毒、虫)种还应该易于培种还应该易于培养和大量繁殖，并能稳定地到达和保持较高养和大量繁殖，并能稳定地到达和保持较高的滴度。的滴度。用于生产类毒素和抗毒素的菌种，应该能用于生产类毒素和抗毒素的菌种，应该能够大量产生外毒素。对于某些生物制品还应够大量产生外毒素。对于某些生物制品还应考虑提取、纯
16、化手段等。考虑提取、纯化手段等。六、其他条件六、其他条件三、菌三、菌(毒、虫毒、虫)种的选育培养方法种的选育培养方法按着菌按着菌(毒、虫毒、虫)种的标准选育培养种的标准选育培养优良的菌优良的菌(毒、虫毒、虫)种是生物制品研究种是生物制品研究和生产的关键。和生产的关键。选育培养方法一般有选育培养方法一般有如下几种。如下几种。一、自然选育培养法一、自然选育培养法人们对生物制品菌人们对生物制品菌(毒、虫毒、虫)种的选育培养最先采用的方法种的选育培养最先采用的方法就属于自然选育培养法。就属于自然选育培养法。远在远在1515世纪，我国民间就用良好的天花患者的枯燥痂皮研世纪，我国民间就用良好的天花患者的枯
17、燥痂皮研成粉末吹鼻免疫。成粉末吹鼻免疫。100100多年前，巴斯德就选用鸡霍乱巴氏杆多年前，巴斯德就选用鸡霍乱巴氏杆菌陈旧培养物制备疫苗，并获得免疫成功。此后又有学者采菌陈旧培养物制备疫苗，并获得免疫成功。此后又有学者采用加热杀死鸡霍乱巴氏杆菌首次制成了死菌疫苗。用加热杀死鸡霍乱巴氏杆菌首次制成了死菌疫苗。自然选育培养法是对自然界中已存在的菌自然选育培养法是对自然界中已存在的菌(毒、虫毒、虫)株进行株进行别离，从中选择适于种用的菌别离，从中选择适于种用的菌(毒、虫毒、虫)株。一般常以感染的株。一般常以感染的动物，媒介昆虫以及污染物等获得别离。动物，媒介昆虫以及污染物等获得别离。一、自然选育培养
18、法一、自然选育培养法别离到菌别离到菌(毒、虫毒、虫)株的毒力，抗原性往往都不同。株的毒力，抗原性往往都不同。某些自然别离的菌某些自然别离的菌(毒、虫毒、虫)株毒力很强，如自然别离的多株毒力很强，如自然别离的多杀性巴氏杆菌等。这些强毒株适于制造灭活菌、诊断抗原和杀性巴氏杆菌等。这些强毒株适于制造灭活菌、诊断抗原和检定用。检定用。有些自然别离菌有些自然别离菌(毒、虫毒、虫)株毒力很弱，抗原性也较好，如株毒力很弱，抗原性也较好，如鸡新城疫鸡新城疫BlBl株弱疫苗，株弱疫苗，L L系弱毒、马立克氏病系弱毒、马立克氏病SB-lSB-l弱毒株等，弱毒株等，这些弱毒株适于制造弱疫苗。这些弱毒株适于制造弱疫苗
19、。在自然弱毒中还包括由异种动物引用过来的菌在自然弱毒中还包括由异种动物引用过来的菌(毒、虫毒、虫)株，株，如用火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病、鸽痘病毒预防鸡痘，如用火鸡疱疹病毒预防鸡马立克氏病、鸽痘病毒预防鸡痘，也有用牛病毒性腹泻也有用牛病毒性腹泻-粘膜病弱毒株预防猪瘟等。这些菌粘膜病弱毒株预防猪瘟等。这些菌(毒、毒、虫虫)株是由于在自然条件下流行或传代过程中适应存在和变株是由于在自然条件下流行或传代过程中适应存在和变异的结果。异的结果。一、自然选育培养法一、自然选育培养法F自然选育培养菌自然选育培养菌(毒、虫毒、虫)种时，首先从别离的菌种时，首先从别离的菌(毒、毒、虫虫)株中选择形态特征、培养
20、特性、理化特性典型的，株中选择形态特征、培养特性、理化特性典型的，并与相应诊断血清出现明显血清学反响的菌并与相应诊断血清出现明显血清学反响的菌(毒、虫毒、虫)株，株，然后再测定其毒力和免疫原性。然后再测定其毒力和免疫原性。F测定时首先用实验动物进行初选，然后再用原宿主动测定时首先用实验动物进行初选，然后再用原宿主动物测定。物测定。F毒力测定一般是先选用敏感的实验动物，鸡胚或细胞毒力测定一般是先选用敏感的实验动物，鸡胚或细胞培养物等，测定菌培养物等，测定菌(毒、虫毒、虫)株的半数致死量株的半数致死量LD50LD50，最小致死量最小致死量MLDMLD，半数感染量，半数感染量ID50ID50或者是半
21、数或者是半数鸡胚致死量鸡胚致死量 CELD50 CELD50，半数鸡胚感染量，半数鸡胚感染量CEID50 CEID50、半数细胞感染量、半数细胞感染量TCID50 TCID50 等。等。一、自然选育培养法一、自然选育培养法n在测定时，还应设生理盐水或培养液阴性对照和同种菌在测定时，还应设生理盐水或培养液阴性对照和同种菌(毒、虫毒、虫)种的阴性对照，以免得出错误结论。种的阴性对照，以免得出错误结论。n如果阴性对照动物发病，那么实验不能成立；如果阴性对照动物发病，那么实验不能成立；n如果阴性对照不发病，那么对结论应慎重。如果阴性对照不发病，那么对结论应慎重。n免疫原性测定是使对菌免疫原性测定是使对
22、菌(毒、虫毒、虫)种免疫敏感的动物产生种免疫敏感的动物产生免疫力，然后再用强毒攻击，如果动物不发病死亡那么免疫力，然后再用强毒攻击，如果动物不发病死亡那么说明有一定的免疫原性。如果别离的菌说明有一定的免疫原性。如果别离的菌(毒、虫毒、虫)株有数株有数种，可分别免疫，然后交叉攻击感染以确定抗原谱。种，可分别免疫，然后交叉攻击感染以确定抗原谱。n作为菌作为菌(毒、虫毒、虫)种应选用的免疫原性好，且抗原谱广，种应选用的免疫原性好，且抗原谱广，能提供交叉保护的菌能提供交叉保护的菌(毒，虫毒，虫)株。株。二、人工选育培养法二、人工选育培养法由于死疫苗免疫效果不理想，而且反响重，由于死疫苗免疫效果不理想，
23、而且反响重，这便促使人们研究和使用弱毒活疫苗免疫。这便促使人们研究和使用弱毒活疫苗免疫。生产弱毒活疫苗所用的菌生产弱毒活疫苗所用的菌(毒、虫毒、虫)种只靠自种只靠自然选育培养是远不能满足要求的，因而开始了然选育培养是远不能满足要求的，因而开始了人工选育培养菌人工选育培养菌(毒、虫毒、虫)种。目前，在生产中种。目前，在生产中用于制造疫苗菌用于制造疫苗菌(毒、虫毒、虫)种多为人工选育培养种多为人工选育培养获得。获得。本法是生物制品菌本法是生物制品菌(毒、虫毒、虫)种选育培养的最种选育培养的最重要、最常用的方法。重要、最常用的方法。二、人工选育培养法二、人工选育培养法人工选育培养法就是别离的菌人工选
24、育培养法就是别离的菌(毒、虫毒、虫)株在培养和传株在培养和传代过程中采用某些理化和生物学方法诱发其发生变异，代过程中采用某些理化和生物学方法诱发其发生变异，使毒力减弱或消失而仍保持一定的免疫原性。使毒力减弱或消失而仍保持一定的免疫原性。有的毒力致弱后毒力稳定，用于制苗的代数不受限制；有的毒力致弱后毒力稳定，用于制苗的代数不受限制；也有的在继代时免疫性亦随之丧失，制苗使用代数较窄。也有的在继代时免疫性亦随之丧失，制苗使用代数较窄。入选的微生物要经过毒力和免疫原性稳定性测定，在入选的微生物要经过毒力和免疫原性稳定性测定，在培养基中连续传代后不改变的，说明稳定性良好且有使培养基中连续传代后不改变的，
25、说明稳定性良好且有使用价值。用价值。人工选育培养菌人工选育培养菌(毒、虫毒、虫)种可具体分以下几种方法。种可具体分以下几种方法。二、人工选育培养法二、人工选育培养法1 1、物理学方法、物理学方法 主要包括以下几个方面。主要包括以下几个方面。1 1温温 度度各种微生物都有其最适宜的生长繁殖温度，各种微生物都有其最适宜的生长繁殖温度，如果改变温度可引起发生变异，以适应环境。如果改变温度可引起发生变异，以适应环境。再通过选择生产性能比较稳定的变异株，如巴再通过选择生产性能比较稳定的变异株，如巴斯德将炭疽杆菌培养于斯德将炭疽杆菌培养于4242育成减毒株，用于育成减毒株，用于预防注射；猪肺疫内蒙古系弱毒
26、株也是经高温预防注射；猪肺疫内蒙古系弱毒株也是经高温培养选育的。培养选育的。二、人工选育培养法二、人工选育培养法2 2射射 线线将微生物暴露于紫外线或将微生物暴露于紫外线或射线、射线、射线下，射线下，大大增强了微生物的突变频率，可从中选出变大大增强了微生物的突变频率，可从中选出变异株。如制造乙型脑炎疫苗的异株。如制造乙型脑炎疫苗的2-82-8弱毒株就是弱毒株就是采用紫外线处理和小鼠皮下传代选育的。仔猪采用紫外线处理和小鼠皮下传代选育的。仔猪副寒副寒C500C500号菌株选育过程中就使用了钴号菌株选育过程中就使用了钴 射射线处理。线处理。二、人工选育培养法二、人工选育培养法2 2、化学方法、化学
27、方法 主要包括以下几个方面。主要包括以下几个方面。1 1改变培养时的气体环境改变培养时的气体环境需氧菌培养在厌氧环境中，或厌氧菌培养在需氧菌培养在厌氧环境中，或厌氧菌培养在有氧环境中，也能够逐渐适应，产生变异株。有氧环境中，也能够逐渐适应，产生变异株。如如SternStern在二氧化碳环境中选育出了无荚膜的在二氧化碳环境中选育出了无荚膜的炭疽杆菌变异株，炭疽杆菌变异株，二、人工选育培养法二、人工选育培养法2 2改变培养基的组成改变培养基的组成在细菌培养基中参加或去掉其中物质可以引在细菌培养基中参加或去掉其中物质可以引起变异，并使毒力下降，成为弱毒株。起变异，并使毒力下降，成为弱毒株。如马流产如
28、马流产C355C355弱毒株是在培养基中参加了醋弱毒株是在培养基中参加了醋酸铊育成的；猪肺疫酸铊育成的；猪肺疫630630弱毒株是在含海欧牌洗弱毒株是在含海欧牌洗涤剂培养基中连续传代育成的；猪丹毒涤剂培养基中连续传代育成的；猪丹毒G4T10G4T10弱弱毒株是在含维黄素的血琼脂上培养选育的；毒株是在含维黄素的血琼脂上培养选育的；WilliamsWilliams应用亚硝酸和羟胺诱变选育了腺病毒应用亚硝酸和羟胺诱变选育了腺病毒株。株。能够引起变异的化学物质种类很多，除上述能够引起变异的化学物质种类很多，除上述外还包括许多碱基化合物、烷基化合物以及吖外还包括许多碱基化合物、烷基化合物以及吖啶类。啶类
29、。二、人工选育培养法二、人工选育培养法3 3、生物学方法、生物学方法 主要包括以下几个方面。主要包括以下几个方面。1 1通过动物机体通过动物机体将强毒菌将强毒菌(毒、虫毒、虫)株通过非易感的动物机体，株通过非易感的动物机体，可以改变强毒株的毒力，使其成为弱毒株。可以改变强毒株的毒力，使其成为弱毒株。如将猪瘟强毒通过兔体传代使其成为猪瘟兔化如将猪瘟强毒通过兔体传代使其成为猪瘟兔化弱毒用于疫苗生产，已在世界享有盛誉；通过鹌弱毒用于疫苗生产，已在世界享有盛誉；通过鹌鹑成功地培育了鸡痘鹌鹑化弱毒；通过豚鼠成功鹑成功地培育了鸡痘鹌鹑化弱毒；通过豚鼠成功地培育了布氏杆菌羊五号弱毒株；通过乳兔成功地培育了布
30、氏杆菌羊五号弱毒株；通过乳兔成功地培养了猪地方性肺炎乳兔化弱毒株等。也可以地培养了猪地方性肺炎乳兔化弱毒株等。也可以通过鸡胚培育弱毒株，如鸡胚致弱的羊痘鸡胚化通过鸡胚培育弱毒株，如鸡胚致弱的羊痘鸡胚化弱毒。弱毒。二、人工选育培养法二、人工选育培养法2 2通过细胞培养物通过细胞培养物将强毒力菌将强毒力菌(毒、虫毒、虫)株通过细胞培养物反复株通过细胞培养物反复传代也可以使其毒力减弱或消失。传代也可以使其毒力减弱或消失。如马传染性贫血驴白细胞弱毒株，山羊痘细如马传染性贫血驴白细胞弱毒株，山羊痘细胞弱毒株，通过猪肾细胞继代的伪狂犬病弱毒胞弱毒株，通过猪肾细胞继代的伪狂犬病弱毒株等。株等。通过上述方法人
31、工选育培养的菌通过上述方法人工选育培养的菌(毒、虫毒、虫)种，种，其形态、生理生化特性可能也会随之改变，但其形态、生理生化特性可能也会随之改变，但最重要的是要保证遗传上稳定的弱的毒力和有最重要的是要保证遗传上稳定的弱的毒力和有良好的免疫原性。良好的免疫原性。三、基因重组选育培养法三、基因重组选育培养法p基因重组技术选育培养菌基因重组技术选育培养菌(毒、虫毒、虫)种是上世纪种是上世纪8080年代开展年代开展起来的一项新技术，是将编码保护性抗原的目的基因导入起来的一项新技术，是将编码保护性抗原的目的基因导入载体中，使之得到表达，产生大量保护性抗原蛋白，并可载体中，使之得到表达，产生大量保护性抗原蛋
32、白，并可用作疫苗。用这种方法生产的疫苗称为基因工程疫苗。用作疫苗。用这种方法生产的疫苗称为基因工程疫苗。p目前用这种方法选育和研制成功的有大肠杆菌目前用这种方法选育和研制成功的有大肠杆菌K88K88、K99K99重重组菌株，用大肠杆菌表达口蹄疫抗原，在牛痘病中表达狂组菌株，用大肠杆菌表达口蹄疫抗原，在牛痘病中表达狂犬病病毒的外表糖蛋白等。犬病病毒的外表糖蛋白等。p这一技术的建立和开展，不仅能够把各种微生物的基因进这一技术的建立和开展，不仅能够把各种微生物的基因进行如愿重组，使没有可用疫苗或虽有疫苗而在生产上存在行如愿重组，使没有可用疫苗或虽有疫苗而在生产上存在很大困难的疾病的免疫预防得到可能的
33、解决，而且将有许很大困难的疾病的免疫预防得到可能的解决，而且将有许多更平安有效的重组基因工程疫苗代替常规疫苗制品。这多更平安有效的重组基因工程疫苗代替常规疫苗制品。这一技术将为疫苗研制开辟广阔的前景。一技术将为疫苗研制开辟广阔的前景。四、菌毒、虫种的保藏四、菌毒、虫种的保藏p微生物一旦被入选为种子，应立即冻干并保存。微生物一旦被入选为种子，应立即冻干并保存。p冻干后的细菌于冻干后的细菌于44的条件下保存；冻干后的病毒在的条件下保存；冻干后的病毒在低于低于-20-20 的条件下保存。这样可以保存多年而形状的条件下保存。这样可以保存多年而形状不改变。不改变。p为防止污染动物内源性细菌和病毒，入选的
34、菌毒、为防止污染动物内源性细菌和病毒，入选的菌毒、虫种不应再通过动物体传代。如果通过动物体传代，虫种不应再通过动物体传代。如果通过动物体传代，别离物必须按照新的菌毒、虫种对待进行全部测别离物必须按照新的菌毒、虫种对待进行全部测定，证明可以使用后，保存备用。定，证明可以使用后，保存备用。p保存的菌毒、虫种使用时，传代后应测定其理保存的菌毒、虫种使用时，传代后应测定其理化性状、毒力和免疫原性，符合标准者方可使用。化性状、毒力和免疫原性，符合标准者方可使用。第二节、生物制品的灭活剂与保护剂第二节、生物制品的灭活剂与保护剂 一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂Inactivation and Inacti
35、vation and InactivatorInactivator凡破坏微生物的生物学活性及血清中补体活性，凡破坏微生物的生物学活性及血清中补体活性，或破坏病原微生物的繁殖能力和致病作用，均称或破坏病原微生物的繁殖能力和致病作用，均称之为之为“灭活。灭活。适当的灭活剂和灭活方法，对微生物抗原性及适当的灭活剂和灭活方法，对微生物抗原性及免疫原性没有影响。免疫原性没有影响。研究灭活生物制品，重要条件是选择适当的灭研究灭活生物制品，重要条件是选择适当的灭活剂和灭活方法。活剂和灭活方法。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂一、物理学方法灭活一、物理学方法灭活一般常用加热杀菌、超声波裂解细胞、一般常用加热杀
36、菌、超声波裂解细胞、射线照射杀死微生物体或消除其毒性。射线照射杀死微生物体或消除其毒性。采用此类灭活方法应注意，加热处理采用此类灭活方法应注意，加热处理以放水浴间接升温为好；超声波裂解应以放水浴间接升温为好；超声波裂解应放冰浴中间断进行；放冰浴中间断进行；60Co60Co照射处理，应照射处理，应根据被照射物的容量大小选择照射物与根据被照射物的容量大小选择照射物与钴源的距离和剂量。钴源的距离和剂量。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂n据试验用据试验用l0000mLl0000mL大玻瓶装大玻瓶装6000mL6000mL的血清或血液，当吸的血清或血液，当吸收收60Co60Co量达量达200200万万r
37、ad/rad/时能完全杀死芽孢杆菌，时能完全杀死芽孢杆菌，150150万万rad/rad/时可使非芽孢菌完全灭活。照射后的血清或裂解红时可使非芽孢菌完全灭活。照射后的血清或裂解红细胞全血的质量不受影响，经测定细胞全血的质量不受影响，经测定1717种氨基酸含量与非种氨基酸含量与非照射的血清无差异。照射的血清无差异。n对病毒的灭活试验结果为：含鸡新城疫病毒的鸡胚尿囊对病毒的灭活试验结果为：含鸡新城疫病毒的鸡胚尿囊液，吸收液，吸收60Co60Co剂量达剂量达5050万万rad/rad/时完全灭活，猪瘟病毒强时完全灭活，猪瘟病毒强毒吸收量到达毒吸收量到达300300万万rad/rad/时完全失去致病力
38、。被时完全失去致病力。被60Co60Co照射照射处理的血清，用于细胞培养与未照射的血清均产毒效果处理的血清，用于细胞培养与未照射的血清均产毒效果良好；被照射处理的裂解全血，不影响牛出败菌及禽霍良好；被照射处理的裂解全血，不影响牛出败菌及禽霍乱菌的生长，制出的菌苗效力良好。乱菌的生长，制出的菌苗效力良好。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂二、化学药剂灭活二、化学药剂灭活 制备生物制品，在制备生物制品，在2020世纪初世纪初LowensteinLowenstein和和EislerEisler19111911就开始用甲醛减毒制备就开始用甲醛减毒制备破伤风类毒素；破伤风类毒素；19241924年年Pun
39、toniPuntoni以甲醛或苯酚制成犬以甲醛或苯酚制成犬瘟热疫苗；瘟热疫苗；19251925年年CastaBoyerCastaBoyer和和PlaudiPlaudi等用甲醛灭等用甲醛灭活制备猪丹毒菌苗等。活制备猪丹毒菌苗等。随后许多学者还试用氯仿、甲苯、胺叶随后许多学者还试用氯仿、甲苯、胺叶油等灭活剂制牛瘟脏器苗。到了油等灭活剂制牛瘟脏器苗。到了2020世纪的世纪的3030年代，年代，DorsetDorset等用结晶紫制猪瘟疫苗成等用结晶紫制猪瘟疫苗成功。功。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂数十年来，除主要用甲醛灭活剂外，在生产口蹄疫灭数十年来，除主要用甲醛灭活剂外，在生产口蹄疫灭活苗过程中
40、，不断选出了新的灭活剂，如活苗过程中，不断选出了新的灭活剂，如19571957年年UbetiniUbetini等报道用等报道用-丙酰内脂；丙酰内脂；19591959年年FranklinFranklin和和WelkeiWelkei等试用等试用羟胺；羟胺；19641964年年MartinsenMartinsen用缩水甘油醛等。用缩水甘油醛等。但是，无论选用何种灭活剂，都应注意以较低温度和但是，无论选用何种灭活剂，都应注意以较低温度和最低剂量为原那么，同时应注意溶液的最低剂量为原那么，同时应注意溶液的pHpH值，以近于中值，以近于中性为宜。性为宜。此外被灭液的浓度如含菌或含蛋白量高，应适当增加此外被
41、灭液的浓度如含菌或含蛋白量高，应适当增加灭活剂剂量或适当稀释灭活剂，否那么易造成灭活不完灭活剂剂量或适当稀释灭活剂，否那么易造成灭活不完全。全。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂有些灭活剂还需在灭活一定时间后，加灭活有些灭活剂还需在灭活一定时间后，加灭活作用阻断剂，以免继续灭活而损害抗原性。作用阻断剂，以免继续灭活而损害抗原性。总之，化学灭活剂的灭活作用，一般是随剂总之，化学灭活剂的灭活作用，一般是随剂量增大，温度升高，灭活效率递增。灭活剂量量增大，温度升高，灭活效率递增。灭活剂量大小与灭活时间成反比。并且在选用灭活剂时，大小与灭活时间成反比。并且在选用灭活剂时，应以能保证疫苗平安与效力，以低剂
42、量和较低应以能保证疫苗平安与效力，以低剂量和较低温度短时间处理为好。温度短时间处理为好。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂三、影响灭活剂灭活的因素三、影响灭活剂灭活的因素1 1、被灭活物质的种类和特性、被灭活物质的种类和特性不同种类的被灭活物质对各种灭活剂的不同种类的被灭活物质对各种灭活剂的敏感性是不完全一样的。敏感性是不完全一样的。被灭液的浓度如含菌或含蛋白量高，应被灭液的浓度如含菌或含蛋白量高，应适当增加灭活剂剂量或适当稀释灭活剂，适当增加灭活剂剂量或适当稀释灭活剂，否那么易造成灭活不完全。否那么易造成灭活不完全。如多数病毒对甲醛灭活敏感，使用时浓如多数病毒对甲醛灭活敏感，使用时浓度较低，灭
43、火时间也较短，一般只需加度较低，灭火时间也较短，一般只需加0.1%0.1%灭活不超过灭活不超过2 2天。天。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂2 2、灭活剂的种类和特性、灭活剂的种类和特性不同种类的灭活剂适用的灭活范围不同不同种类的灭活剂适用的灭活范围不同，如甲醛适用于多种细菌、病毒和毒素的如甲醛适用于多种细菌、病毒和毒素的灭活，但对口蹄疫病毒的灭活效果不理灭活，但对口蹄疫病毒的灭活效果不理想；而乙烯亚胺对口蹄疫病毒的灭活效想；而乙烯亚胺对口蹄疫病毒的灭活效果远远优于甲醛。果远远优于甲醛。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂3 3、灭活剂的浓度和剂量、灭活剂的浓度和剂量灭活的速度和效果在一定范围内与
44、灭活剂的灭活的速度和效果在一定范围内与灭活剂的浓度和剂量成正比，浓度和剂量越大，灭活浓度和剂量成正比，浓度和剂量越大，灭活效果越确实，所以灭活时间也越短。效果越确实，所以灭活时间也越短。但许多灭活剂都有一定的毒害作用，浓度高，但许多灭活剂都有一定的毒害作用，浓度高，剂量大，反而会破坏抗原性，而且易引起疫剂量大，反而会破坏抗原性，而且易引起疫苗接种部位的组织损伤，甚至坏死，甲醛即苗接种部位的组织损伤，甚至坏死，甲醛即是如此。是如此。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂4 4、灭活时间和灭活温度、灭活时间和灭活温度一般来说，随灭活时间的延长，灭活效一般来说，随灭活时间的延长，灭活效愈加确实，但不是越长
45、越好，如乙烯亚胺愈加确实，但不是越长越好，如乙烯亚胺灭活结束后就对抗原呈现破坏作用，所以灭活结束后就对抗原呈现破坏作用，所以到达灭活时间后及时中止灭活。到达灭活时间后及时中止灭活。灭活的温度一般选择灭活的温度一般选择3737，温度升高可，温度升高可以加快灭活速度。但温度过高对抗原损害以加快灭活速度。但温度过高对抗原损害严重。严重。曾有学者研究，口蹄疫病毒在曾有学者研究，口蹄疫病毒在3030灭活灭活时对抗原损害低。时对抗原损害低。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂5 5、有机物质对灭活的影响、有机物质对灭活的影响有机物质中主要是蛋白质对灭活有一有机物质中主要是蛋白质对灭活有一定的影响，如果杂质蛋白
46、质含量高那么定的影响，如果杂质蛋白质含量高那么对细菌、病毒以及毒素呈一定的保护作对细菌、病毒以及毒素呈一定的保护作用，不利于灭活剂的灭活。所以灭活前用，不利于灭活剂的灭活。所以灭活前应采用适当方法如离心、过滤等除去杂应采用适当方法如离心、过滤等除去杂蛋白，以提高灭活效果。蛋白，以提高灭活效果。一、灭活与灭活剂一、灭活与灭活剂四、常用的化学灭活剂四、常用的化学灭活剂1 1、甲醛、甲醛是最常用、使用最广泛的灭活剂。是最常用、使用最广泛的灭活剂。用于制造菌类疫苗和类毒素的灭活，浓用于制造菌类疫苗和类毒素的灭活，浓度一般为度一般为0.1%0.1%0.8%0.8%；而用于病毒类疫苗；而用于病毒类疫苗的灭
47、活浓度常为的灭活浓度常为0.05%0.05%0.2%0.2%。疫苗灭活结束时应参加过量的焦亚硫酸疫苗灭活结束时应参加过量的焦亚硫酸钠中止反响。钠中止反响。第一节 细胞生物学研究的内容与现状生物制品的冻干，除抗毒素、血液制品和诊断用制生物制品的冻干，除抗毒素、血液制品和诊断用制品外，都需要加有保护剂？以便使生物制品在冻干过品外，都需要加有保护剂？以便使生物制品在冻干过程中保持最低限度的死亡。而且在保存时耐高温，保程中保持最低限度的死亡。而且在保存时耐高温，保存期延长。存期延长。冻干是活疫苗等生物制品保存的最可靠而普遍使用冻干是活疫苗等生物制品保存的最可靠而普遍使用的方法，但冻干过程会使活疫苗等受
48、到不同程度的损的方法，但冻干过程会使活疫苗等受到不同程度的损伤。为了尽量减少这些损伤，冻干时要参加适当的保伤。为了尽量减少这些损伤，冻干时要参加适当的保护剂，所以在生物制品生产中冻干保护剂的应用十分护剂，所以在生物制品生产中冻干保护剂的应用十分重要。重要。二、保护剂二、保护剂保护剂的种类保护剂的种类1 1、小分子物质、小分子物质这类保护剂包括葡萄糖、蔗糖、乳糖，山这类保护剂包括葡萄糖、蔗糖、乳糖，山梨醇、木糖醇，梨醇、木糖醇，DL-DL-苏氨酸、谷氨酸钠、乳苏氨酸、谷氨酸钠、乳糖酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸等中性、糖酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸等中性、酸性小分子物质。酸性小分子物质。这些小分子
49、物质可以起到直接的保护作用。这些小分子物质可以起到直接的保护作用。参加低分子物质可以形成均匀悬液，使微生参加低分子物质可以形成均匀悬液，使微生物尽量保持存活状态，同时能起到水分缓解物尽量保持存活状态，同时能起到水分缓解作用，从而保持了较高的存活率。而且也有作用，从而保持了较高的存活率。而且也有防止制品中的蛋白变性和促进高分子物质的防止制品中的蛋白变性和促进高分子物质的保护作用。保护作用。保护剂的种类保护剂的种类2 2、高分子物质、高分子物质 这一类保护剂这一类保护剂包括包括脱脂乳、血清、脱纤血、羊水、脱脂乳、血清、脱纤血、羊水、白蛋白、明胶、各种蛋白胨内膏、酵母浸膏、糊白蛋白、明胶、各种蛋白胨
50、内膏、酵母浸膏、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、琼脂、藻胶钠、聚乙精、阿拉伯胶、右旋糖酐、琼脂、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮等高分子物质及其分解物。烯吡咯烷酮等高分子物质及其分解物。高分子物质可以起到防止小分子保护剂的氨基酸高分子物质可以起到防止小分子保护剂的氨基酸炭化和氧化，促进冻干过程的升华和提高冻干制炭化和氧化，促进冻干过程的升华和提高冻干制品溶解度的作用。品溶解度的作用。保护剂的种类保护剂的种类3 3、抗氧化剂、抗氧化剂主要有抗坏血酸钠、硫脲半胱氨酸、主要有抗坏血酸钠、硫脲半胱氨酸、亚硫酸钠、碘化钾和钼酸铵等。亚硫酸钠、碘化钾和钼酸铵等。这类物质可这类物质可起到抗氧化和酶化作用。起到抗氧化和酶化作