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1、公开课分解尿素的细菌分解纤维公开课分解尿素的细菌分解纤维素的微生物的分离素的微生物的分离一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶脲酶脲酶 +H+H2 2OO+CO+CO2 22NH2NH3 3 3 3、课题目的、课题
2、目的从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：PCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的时要根据它对生存环境的要求，到要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多，淘汰了绝大多数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶多
3、聚酶链式反应链式反应是一种在是一种在体外将少量体外将少量DNADNA大大量复制量复制(PCR)(PCR)的技术，此项技术要求使用的技术，此项技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，点，包括营养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的的生长生长结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板
4、稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制其他微生物生长。，同时抑制其他微生物生长。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属
5、于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成只有能合成脲酶脲酶的微生的微生物才能分解尿素，以尿物才能分解尿素，以尿素作为氮源。素作为氮源。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类其他种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培
6、养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是找规律：找规律：1：判断某个培养基是否具有选择作用时，：判断某个培养基是否具有选择作用时，应设立应设立_培养基进行对照。培养基进行对照。2：判断所使用的培养基是否被杂菌污染：判断所使用的培养基是否被杂菌污染时，应设立时，应设立_培养基进行空培养基进行空白对照？白对照？基基础础不接该菌种的不
7、接该菌种的1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板(血细胞计数板血细胞计数板），在显微镜下，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。计算一定容积里样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单一个单细胞细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个菌落代表原先的一
8、个单细胞。一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的
9、重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不不一一致致，意意味味着着操操作作有有误误，需需要要重新实验重新实验。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平板中个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106
10、的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）设置对照（三）设置对照判断培养基判断培养基的制备是否合格（有无被杂菌污染）的制备是否合格（有无被杂菌污染）：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是主要目的是排除排除实验组中实验组中非测试因素非测试因素对实验对实验结果的影响，
11、提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混混入入了了其其他他的的含含氮物质氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可
12、以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近
13、中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3 3 cmcm左左右右，再再取取样样，将将样样品品装装入入事事先先准准备备好好的的信封中。信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。用前都要灭菌。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在
14、稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（二二）样品的稀释样品的稀释（三）（三）.取样
15、涂布取样涂布实验时要对培养皿作好标记。注明实验时要对培养皿作好标记。注明培养培养基类型基类型、培养时间培养时间、稀释度稀释度。还少了什么吗？还少了什么吗？未接种的选择培养基未接种的选择培养基接种的完全培养基接种的完全培养基（四）（四）.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养以防止因培养
16、以防止因培养以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：细菌：细菌：3030303037373737培养培养培养培养1 1 1 12d2d2d2d 放线菌：放线菌：放线菌：放线菌：2525252528282828培养培养培养培养5 5 5 57d7d7d7d 霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：2525252528282828的温度下培养的温度下培养的温度下培养的温
17、度下培养3 3 3 34d4d4d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、稀释度等。注明培养基种类、培养日期、稀释度等。三三三三 规划时
18、间规划时间规划时间规划时间 三、三、四四.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，通过对照实验，若培养物有杂菌污染若培养物有杂菌污染，菌落，菌落数偏高；数偏高；若培养若培养基没有发挥选择作用基没有发挥选择作用，则菌落，则菌落形态多样，菌落数偏高。形态多样，菌落数偏高。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个菌落的个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释同一稀释倍数的三个重复的菌落数倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差较大，表示实验不精确。如果得到了如果得到了如
19、果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功则说明稀释操作比较成功则说明稀释操作比较成功则说明稀释操作比较成功1.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指升高，指示剂将示剂将变红变红，说明该细菌能够分解尿素。，说明该细菌能够分解尿素。五五.课外延伸课外延伸CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶脲酶脲酶+H+H2
20、 2OO+CO+CO2 22NH2NH3 3公开课分解尿素的细菌分解纤维素的微生物的分离纤维素是地球上含量最丰富纤维素是地球上含量最丰富的的多糖类多糖类物质，植物每年产物质，植物每年产生的纤维素超过生的纤维素超过7070亿吨；分亿吨；分布植物的根、茎、叶中；布植物的根、茎、叶中；纤维素生物燃料：纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源一、基础知识一、基础知识1.1.纤维素纤维素纤维素是一种由纤维素是一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高高分子分子化合物，是含量最丰富的化合物，是含量最丰富的多糖多糖类物质。类物质。土壤中某些微生物能够产生土壤中某些微生物能够产生纤维素酶
21、纤维素酶,把把纤维素分解为葡萄糖纤维素分解为葡萄糖，后再利用，后再利用。2.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少包至少包括三种组分括三种组分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素一、基础知识一、基础知识 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，纤维素是地球上含量最
22、丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。不会大量积累。在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。能力。人类可应用分解纤维素的微生物将秸人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服
23、装面料等。服装面料等。3 3、纤维素的分解、纤维素的分解请用一个简单的实验来验证此问题请用一个简单的实验来验证此问题纤维素酶水解滤纸实验纤维素酶水解滤纸实验1U表示表示1个酶活力单位，是指在温度为个酶活力单位，是指在温度为25，其他反应条件，如，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在等，均为最适的情况下，在1min内转化内转化1mmol的底物所需的的底物所需的酶量。酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶所作用和催化的化合物。试管AB滤纸条1cmx6cm1cmx6cm缓冲液10ml11ml纤维素酶1ml/振动1h1h现象分解不分解纤维素酶的作用对照实验（2 2）纤维素分解菌的筛选）纤
24、维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，但不能和水解后的纤维二糖和葡萄但不能和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应糖发生这种反应。当纤维素被当纤维素被_分解后，分解后，红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈实
25、验原理实验原理 即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素
26、分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A.刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌(三三)、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么什么样的样的环境环境取样取样?培养的目的培养的目的?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落?鉴别培养基鉴别培养
27、基的特点的特点?如何鉴别如何鉴别?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法对比课题对比课题3 3与课题与课题2 2实验流程，实验流程，说说它们的不同之处：说说它们的不同之处：课题课题2 2土壤取样，直接稀释。土壤取样，直接稀释。课题课题3 3土壤取样，选择培养，土壤取样，选择培养，增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。1、纤维素分解菌选择培养基、纤维素
28、分解菌选择培养基属于属于_（固体、液体）培（固体、液体）培养基，原因是养基，原因是_【资料二资料二】选择培养选择培养阅读资料二阅读资料二“选择培养选择培养”，回答以下几问题：，回答以下几问题：液体液体没有添加琼脂没有添加琼脂2、该培养基对微生物、该培养基对微生物_（具有，不具有）选（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择择作用。如果具有，其选择机制是机制是_ 具有具有 能分解纤维素的微生物可能分解纤维素的微生物可利用利用纤维素作为碳源而纤维素作为碳源而大量繁殖；大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制其他微生物繁殖被抑制分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中
29、操作步骤操作步骤生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。境。原因原因 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？应该埋进土壤多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约1
30、0cm左右的腐殖土壤中。左右的腐殖土壤中。提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤或者将纤维素改为葡萄糖。维素改为葡萄糖。A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）
31、是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选择培养基配方配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量因此，只有
32、以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。繁殖。旁栏思考题旁栏思考题为什么选择培养能为什么选择培养能够够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适应适应适应适应这种营这种营这种营这种营养条件的微生物得到养条件的微生物得到养条件的微生物得到养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些，而那些，而那些不适应不适应不适应不适应这种这种这种这种营养条件的微生物的繁殖被营养条件的微生物的繁殖被营养条件的微生物的繁殖被营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制抑制抑
33、制，因此可以起到，因此可以起到，因此可以起到，因此可以起到“浓缩浓缩浓缩浓缩”的作用。的作用。的作用。的作用。指微生物的种类少了，而指微生物的种类少了，而某些微生物的数量多了某些微生物的数量多了比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在纤维将细菌涂布在纤维素粉做主要碳源的素粉做主要碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培
34、养按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养基上基上（1 1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-N
35、a 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法刚果红染色法挑选产生透明圈的菌落，
36、一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。纤维素的菌落。方法一：方法一：方法二：方法二：步步骤骤培养基经涂布培养培养基经涂布培养先先长出菌长出菌落落再再覆盖覆盖1mg/mL的的CR溶溶液液(1015min后后)倒去倒去CR溶溶液液加入加入1mol/L的的NaCl溶液溶液15min后倒掉后倒掉NaCl溶液溶液出现透明圈出现透明圈配置配置10mg/mL的的CR溶液溶液灭菌灭菌按照按照1mLCR溶液溶液/200mL培养培养基的比例基的比例混匀混匀倒平板倒平板接种后接种后培养培养出现透明圈出现透明圈优优点点显示出的颜色基本上是纤显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用维素分解菌的作用操
37、作简便，不存在菌落的混杂问操作简便，不存在菌落的混杂问题题缺缺点点操作繁琐，加入刚果红会操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂使菌落之间发生混杂由于产生淀粉酶的微生物也形由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性成透明圈，所以可能产生假阳性反应。反应。有些微生物具有降解色素的能有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。菌不易区分。两种刚果红染色法的比较两种刚果红染色法的比较：比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类
38、培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透
39、明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能底物，但分
40、解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！当然分解纤维素的能就强！在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑取的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在在30300 0C C 37370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养公开课分
41、解尿素的细菌分公开课分解尿素的细菌分解纤维素的微生物的分离解纤维素的微生物的分离1.1.培养基的制作是否合格培养基的制作是否合格对照的培养基在培养过程中没有菌落生长对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。则说明培养基制作合格。公开课分解尿素的细菌分公开课分解尿素的细菌分解纤维素的微生物的分离解纤维素的微生物的分离2.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到
42、产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。3.分离的结果是否一致分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。同的分离结果。五、课题延伸五、课题延伸 本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤但是这只是分离纯化的第
43、一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。3 31 1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵发酵产纤维素酶产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有实验，纤维素酶的发酵方法有 液体液体 发酵和发酵和 固体固体 发酵。发酵。3 32 2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的的 葡萄糖葡萄糖 含量进行定量测定。含量进行定量测定。分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养扩大扩大培养培养鉴别鉴别培养培养富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量刚果红刚果红染色鉴别染色鉴别挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落课堂总结课堂总结本课题知识小结本课题知识小结: