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1、上海交通大学医学院博士学位论文新型免疫调节剂艾拉莫德对M R L l p r 小鼠类狼疮样疾病治疗作用及对其B 细胞分化功能影响的研究I g u r a t i m o d，an o v e li m m u n o m o d u l a t o r，a m e l i o r a t e dl u p u s l i k ed i s e a s ei nM R L I p rm i c ew i t hr e d r e s s e dBc e l ld i f f e r e n t i a t i o n研究生姓名严青然学号0 11 7 2 1 9 1 3 7指导教师鲍春德教授导师组
2、成员沈南研究员吕良敬主任医师张巍副主任医师黄新芳副研究员扶琼主治医师学科(专业)研究方向关键词申请学位级别资助基金项目答辩日期培养单位内科学(风湿病学)系统性红斑狼疮发病机理及治疗研究艾拉莫德，B 细胞分化，系统性红斑狼疮，M R L I p r 小鼠博士国家自然科学基金面上项目(8 1 3 7 3 2 0 7)上海交通大学医学院博士创新基金(B X J 2 0 1 2 2 1)2 0 1 4 年4 月2 2 日上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科万方数据上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外
3、，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：渺日期：b【丫年L P 月【。日1 1万方数据上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密0，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密(请在以上方
4、框内打c、，)学位论文作者签名：日期：)小V 年叶月l b 日I l l指导教师签名：日期加f 噼归僧万方数据上海交通大学医学院l l 级博士学位论文摘要新型免疫调节剂艾拉莫德对M R L I p r 小鼠类狼疮样疾病治疗作用及对其B 细胞分化功能影响的研究摘要背景和目的艾拉莫德是一种新型小分子免疫调节剂，现在的研究己证明此药具有多种免疫调节功能，包括：能够抑制滑膜细胞T N F a 及单核细胞N F r d 3 通路、增加单核细胞膜稳定性、抑制大鼠关节C I A 发生、下调I L 1 7、I L 1、I L 一6、I F N 1，等多种炎症因子、抑制I L 1 7 通路等。在本课题组和国外研
5、究者分别完成的R A 临床试验中，艾拉莫德显示出和M T X 相当的疗效及安全性。前期基础和临床研究均提示艾拉莫德对体液免疫可能存在抑制作用。体外实验发现艾拉莫德能够抑制人和小鼠B 细胞的免疫球蛋白产生、免疫重建实验发现艾拉莫德可抑制R A 患者滑膜组织免疫球蛋白的产生；临床试验也发现艾拉莫德组R A 患者血清免疫球蛋白和类风湿因子水平出现下降。鉴于R A 和S L E 具有包括自身抗体在内的多种共同发病机制，我们推测艾拉莫德对S L E 可能亦存在治疗作用。M R L I p r 小鼠是一种经典的自身抗体介导的类红斑狼疮疾病模型。它们由于M R L 品系小鼠基因背景和淋巴细胞凋亡障碍的共同作
6、用而发病，在生命后期可出现免疫性肾炎、淋巴器官肿大、关节炎、皮损等多种改变，体内出现丰富自身抗体。小鼠外周淋巴细胞出现多重失衡：浆细胞增多，正常T、B 细胞比例因B 2 2 0+T 细胞累积而降低，滤泡B 细胞减少而边缘区B 细胞增多，未成熟B 细胞增多，1万方数据摘要上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文等等。为进一步验证我们对艾拉莫德治疗S L E 的猜想，本研究选择M R L I p r 小鼠，系统观察了艾拉莫德对其的治疗作用，并初步探讨了这个药物在此模型中可能的作用机理。材料和方法选择雌性M R L l p r 小鼠，分别随机给药艾拉莫得、空白载体溶液作为安慰剂或环磷酰胺作为阳性对照
7、。选择不携带勿r 基因的野生型雌性B A L B c 小鼠为背景对照。采用B C A 法定期定量检测小鼠尿蛋白浓度，放免法定期检测血清抗d s D N A 抗体的水平，E L I S A 法检测血清补体C 3 及免疫球蛋白各亚型水平，血细胞分析仪及全自动生化仪定期检测给药小鼠的全血细胞计数及肝肾功能。小鼠肾脏标本进行H&E 染色，由肾脏病理专家盲法读片，半定量评估肾小球累及及肾小血管累及情况。免疫组化对小鼠肾脏I g G 及C D 2 0 染色。分离小鼠脾脏淋巴细胞，流式检测其中B 细胞各亚群及浆细胞比例。脾脏淋巴细胞的B A F F、I L 6、I L 2 1、I L 1 7 A 表达水平采
8、用实时定量荧光P C R 检测，血清B A F F 水平采用E L I S A 法检测。小鼠脾细胞进行a n n e x i nV P I 染色，流式鉴定其中凋亡细胞比例。采集健康人外周血总B 细胞，体外F(a b)2a n t i I g M、I L 一2 1、I L 4 及C D 4 0 L 联合刺激使其增殖，并进行B r d U 及7-A A D 染色，流式检测细胞周期，体外观察艾拉莫得对正常人B 细胞增殖及凋亡的影响。结果万方数据上海交通大学医学院l l 级博士学位论文摘要艾拉莫德可明显缓解M R L l p r 小鼠类狼疮样疾病病情。小鼠经艾拉莫德治疗后蛋白尿发生时间和水平均显著低于
9、安慰剂组，肾脏病理显示免疫性肾炎病变轻于安慰剂组，盲法评定的。肾小球损伤及血管周围炎症积分差异具有统计学差异。艾拉莫德组小鼠抗d s D N A抗体水平显著低于安慰剂组，低补体血症、高免疫球蛋白血也同时得到明显缓解。免疫组化显示艾拉莫德组小鼠肾脏I g G 免疫复合物沉积显著少于安慰剂组，半定量吸光度计算显示两组具有显著统计学差异。以上结果同时证实了艾拉莫德对小鼠体液免疫的抑制作用。我们进一步发现艾拉莫德对M R L l p r 小鼠外周淋巴细胞具有多种调节作用。外周异常B 2 2 0+T 细胞及浆细胞比例经艾拉莫德治疗后下降，而外周总B 细胞比例出现恢复，趋向于正常B A L B c 小鼠水
10、平；同时作为靶器官的肾组织中C D 2 0+B 细胞的浸润在艾拉莫德治疗后显著减少。艾拉莫德组小鼠脾脏浆细胞数量显著少于安慰剂组，与血清免疫球蛋白检测结果相呼应。小鼠脾脏内异常升高的生发中心、边缘区B 细胞和异常降低的滤泡B 细胞亚群比例经过艾拉莫得治疗后均得到部分纠正：艾拉莫德组脾脏内异常增多的未成熟过度型B 细胞比例也显著低于安慰剂组：而环磷酰胺上述效应并不明显。M R L l p r 小鼠脾细胞及血清中促进B 细胞活化的多种细胞因子，包括B A F F、I L 6、I L 2 1、I L 1 7 A 水平在艾拉莫德给药后出现明显下降，与环磷酰胺效果相近。体内及体外艾拉莫德处理后的淋巴细胞
11、凋亡及增殖情况与安慰剂组相比，均无统计学差异，提示艾拉莫德对细胞增殖及凋亡无显著影响。长期给药(2 0 周)过程中未观察到艾拉莫德对M R L l p r 小鼠存在明显毒副作用。万方数据摘要上海交通大学医学院l l 级博士学位论文结论艾拉莫德可缓解M R L l p r 小鼠类狼疮样疾病，其机制可能通过非抗增殖的方式纠正M R L l p r 小鼠异常的B 细胞分化功能发挥作用。本研究的结果提示艾拉莫德可能是一种潜在的狼疮治疗新药。关键词艾拉莫德，B 细胞分化，系统性红斑狼疮，M R L I p r 小鼠万方数据上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文摘要I g u r a t i m o d
12、，an o v e li m m u n o m o d u l a t o r，a m e l i o r a t e dl u p u s-l i k ed i s e a s ei nM R L l p rm i c ew i t hr e d r e s s e dBc e l ld i f l f e r e n t i a t i o nO b j e c t i v eI g u r a t i m o di sas m a l lm o l e c u l a ri m m u n o m o d u l a t o r yd r u ga n dh a sb e e na p
13、 p r o v e df o rt r e a t i n gr h e u m a t o i da r t h r i t i s P r e v i o u sw o r kr e v e a l e di t si n h i b i t o r ye f f e c t so nh u m o r a li m m u n i t y T h i ss t u d yi sp e r f o r m e dt oi n v e s t i g a t ee f f e c t so fi g u r a t i m o do na na n t i b o d y m e d i
14、a t e dd i s e a s ea n di t sp o s s i b l em e c h a n i s m M e t h o d sF e m a l eMR L l p rm i c ew e r et r e a t e dw i t hi g u r a t i m o d，v e h i c l es o l u t i o no rc y c l o p h o s p h a m i d e T h e i rs e r u ma n t i d o u b l es t r a n dD N Aa n t i b o d yw a sm e a s u r e
15、 dw i t hr a d i o i m m u n o a s s a y K i d n e yI g Ga n dC D 2 0w e r es t a i n e dw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dk i d n e yi n j u r yw a sb l i n d l ys c o r e db yar e n a lp a t h o l o g i s t S p l e n i cl y m p h o c y t ea n dBc e l ls u b s e tp h e n o t y p ew
16、 a sa n a l y z e dw i t hf l o w c y t o m e t r y L y m p h o c y t ea p o p t o s i sw e r ea n a l y z e dw i t ha n n e x i nV P Is t a i n i n gi nv i v oa n dw i t hB r d Us t a i n i n gi nv i t r ot h r o u g hf l o w c y t o m e t r y R e s u l t sM R L l p rm i c et r e a t e dw i t hi g
17、u r a t i m o ds h o w e dm i l d e rs i g n so fn e p h r i t i sa n da r t h r i t i s，a sw e l la sd i s e a s ea c t i v i t ym a r k e r si ns e r a，c o m p a r e dt ov e h i c l es o l u t i o nc o n t r o lg r o u p T h e i ra b n o r m a lB 2 2 0+Tc e l la n dp l a s m ac e l li ns p l e e n
18、d r o p p e dd o w na f t e ri g u r a t i m o dt r e a t m e n ty e tt h e i rt o t a lBc e l lp o p u l a t i o n sw e r er e c o v e r e d T h e i rs k e w e dr a t i o so fg e r m i n a lc e n t e r，m a r g i n a lz o n e，f o l l i c u l a ra n dt r a n s i t i o n a lBc e l l sp a r t i a l l y
19、r e b a l a n c e du p o ni g u r a t i m o do t h e rt h a n5万方数据摘要上海交通大学医学院l l 级博士学位论文c y c l o p h o s p h a m i d et r e a t m e n t L e v e l so fc y t o k i n e st h a tp r o m o t eBc e l la c t i v a t i o na n dp l a s m ac e l lm a i n t a i n i n gw e r ed e c r e a s e db yi g u r a t i
20、m o d I g u r a t i m o dh a dn os i g n i f i c a n te f f e c t so nc e l lp r o l i f e r a t i o no ra p o p t o s i s N oo v e r ts i d ee f f e c t sw e r eo b s e r v e d C o n c l u s i o nI g u r a t i m o dc o u l da m e l i o r a t el u p u s l i k ed i s e a s ei nM R L I p rm i c ep r o
21、 b a b l yt h r o u g hr e d r e s s i n ga b n o r m a lBc e l ld i f f e r e n t i a t i o ni nan o n a n t i p r o l i f e r a t i v em a n n e r O u rd a t as u g g e s tap o t e n t i a lt h e r a p e u t i cr o l eo fi g u r a t i m o di nl u p u s K e y w o r d sI g u r a t i m o d，Bc e l ld
22、i f f e r e t i a t i o n，s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s，M R L l p rm i c e6万方数据上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文目录文字目录中英文缩略词对照正文第一部分艾拉莫德对M R L I p r 小鼠类狼疮样疾病的治疗效应研究引言材料与方法结果1 艾拉莫得可显著缓解M R L I p r 小鼠免疫性肾炎2 艾拉莫德可显著改善M R L l p r 小鼠类狼疮样疾病免疫学活动指标3 未观察到艾拉莫德显现明显毒副作用讨论，J、结第二部分艾拉莫得对M R L l p r 小鼠的B 细胞
23、效应研究弓I 言材料与方法结果1 艾拉莫德可纠正M R L l p r 小鼠异常的外周淋巴细胞组成比例2 艾拉莫德可纠正M R L I p r 小鼠异常的B 细胞亚群格局10O63 艾拉莫德可显著降低M R L l p r 小鼠多种与B 细胞活化相关的细胞因子水平4 艾拉莫得对淋巴细胞增殖及凋亡无明显影响讨 仓J、结全文总结待提高之处参考文献附录1 伊马替尼：一种潜在的抗纤维化药物(综述)2 AN o v e lS m a l lM o l e c u l a rA n t i-r h e u m a t i cD r u g，T 一6 1 4，A m e l i o r a t e sL u
24、 p u s l i k eD i s e a s ei nM R L I p rM i c eb yS u p p r e s s i n gBC e l lF u n c t i o n s(p o s t e rf o rA C Ra n n u a lm e e t i n g)3 I n h i b i t i o no f M i c r o R N A-1 5 5A m e l i o r a t e dE x p e r i m e n t a lF i b r o s i sb yS u p p r e s s i n gmn乃BMMM勰弛弘弱卯”郇弱铂甜：3卯鹋的加蹈，万方
25、数据目录上海交通大学医学院l l 级博士学位论文W ma n dA k tP a t h w a y s(o r a lp r e s e n t a t i o nf o rA C Ra n n u a lm e e t i n g)8 5学术论文和科研成果目录r apt04 8 7致谢8 88万方数据上海交通大学医学院1l 级博士学位论文目录图表目录图1 艾拉莫德结构式图2 艾拉莫德对M R L I p r 小鼠治疗作用的研究方案图3 艾拉莫德可改善M R L l p r 小鼠类狼疮样疾病图4 艾拉莫德可在病理上改善M R L I p r 小鼠免疫性肾炎图5 艾拉莫德可降低M R L l
26、p r 小鼠血清免疫学活动指标图6 艾拉莫德可降低M R L l p r 小鼠靶器官中的免疫复合物沉积图7 艾拉莫德可减少靶器官肾组织中的B 细胞浸润图8 未观察到艾拉莫德对M R L I p r 小鼠存在明显毒副作用图9 艾拉莫德对C O X 1 和C O X 2 的结合活性的动力学检测结果图1 0 艾拉莫德对C I A 大鼠的抗I I 型胶原抗体的生成有调节作用图1 1F o B 细胞与M z B 细胞分化路径图1 2M z B 细胞在小鼠自身免疫中的重要作用图1 3 脾细胞流式分析步骤图1 4R e a l t i m eP C R 反应程序图1 5 艾拉莫德可轻度缩小M R L l p
27、 r 小鼠脾脏及淋巴结大小图1 6 艾拉莫德可纠正M R L I p r 小鼠外周B 细胞数量、降低抑制浆细胞分化图1 7 艾拉莫德可减少M R L I p r 小鼠浆细胞数量图1 8 艾拉莫德可显著降低M R L l p r 小鼠血清免疫球蛋白水平图1 9 艾拉莫德可纠正M R L I p r 小鼠脾脏异常的生发中心(G C)、滤泡边缘区(F o M z)B 细胞组成格局图2 0 艾拉莫德可减少M R L I p r 小鼠未成熟B 细胞比例图2 1 艾拉莫德可降低M R L I p r 小鼠B 细胞活化相关的细胞因子水平图2 2 艾拉莫德对淋巴细胞增殖及凋亡无明显影响表1C e l e c
28、o x i b 对C O X 1 和C O X 2 的抑制效应表2 艾拉莫德对C O X 1 和C O X 2 的抑制效应表3 艾拉莫德可降低R A 患者血清免疫球蛋白及类风湿因子水平表4 逆转录反应体系表5 实时定量P C R 引物序列表6 实时定量P C R 反应体系9B掩巧拍凹如”弛”卯们舵卯鼹钓印仉铊舛弘舛弘钉记记万方数据缩略词对照上海交通大学医学院I l 级博士学位论文英文缩写7 一A A DA C RA S CA L TA N AA N C AB A F FB C AB c l 6B C RB l i m p-1B r d UC DC I AC M CC O X中英文缩略词对照(按
29、英文缩略词字母顺序排序)英文全称7-a m i n o a c t i n o m y c i nDA m e r i c a nC o l l e g eo fR h e u m a t o l o g ya n t i b o d ys e c r e t i n gc e i l sa l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s ea n t in u c l e a ra n f i b o d ya n t i n e u t r o p h i lc y t o p l a s m i ca n t i b o d i e sBc e l la
30、 c t i v a t i n gf a c t o rb i c i n c h o n i n i ca c i dB-c e Ul y m p h o m a6p r o t e i nBc e l lr e c e p t o rB-l y m p h o c y t e-i n d u c e dm a t u r a t i o np r o t e i n15-b r o m o 一2 一d e o x y U r i d i n ec l u s t e ro f d i f f e r e n t i a t i o nc o l l a g e ni n d u c e
31、da r t h r i t i sc a b o x ym e t h y lc e l l u l o s eC y d o x y g e n a s eC p G O D NC p Go l i g o d e o x y n u c l e o t i d e sC rC y cD A Bd d H：OD E P CD M A R DD M S od s D N AE A E1 0C r e a I l l n ec y c l o p h o s p h a m i d ed i a m i n o b e n z i d i n ed o u b l e d i s t i l
32、l e dw a t e rd i e t h y p y r o c a r b o n a t ed i s e a s e m o d i f y i n ga n t i r h e u m a t i cd r u g sd i m e t h y ls u l f o x i d ed o u b l es t r a n d e dD N Ae x p e r i m e n t a la u t o i m m u n e中文名称7 一氨基放线菌素D美国风湿病学会抗体分泌细胞丙氨酸氨基转移酶抗核抗体抗中性粒细胞胞浆抗体B 细胞活化因子二辛可宁酸n aB 细胞受体n a5 一溴脱
33、氧尿嘧啶核苷白细胞分化抗原胶原诱导关节炎羧甲基纤维素环氧化酶胞嘧啶鸟嗓呤二核苷酸的寡核苷酸链肌酐环磷酰胺二氨基联苯胺双蒸水焦碳酸二乙酯改善病情抗风湿药二甲基亚砜双链D N A实验性变态反应性脑脊髓炎万方数据E D T AE I AE L I S AF A C SF B SF oB 细胞G CB 细胞H E 染色H R PI F NI gI H CI L 一1 7 AI L 一2 1I L 6I O DM H CM T XM zB 细胞N K T 细胞P A X 5p D CP B SP C RP IQ RR AR A N K LS C I D 小鼠S L ES P Fe n c e p h a
34、 l o m y e l i t i se t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i de n z y m ei m m u n o a s s a ye n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yf l u o r e s c e n c e a c t i v a t e dc e l ls o r t i n gf e t a Ib o v i n es e r u mf o l l i c u l a rBc e l lg e r m i n a lc e
35、n t e rBc e l lh e m a t o x y l i n e o s i ns t a i m n gh o r s er a d i s hp e r o x i d a s ei n t e r f e r o nt m m u n o g l o b u l i ni m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi n t e r l e u k i n 一1 7 Ai n t e r l e u k i n 一2 1i n t e r l e u k i n 一6i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s
36、 i t ym a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e xm e t h o t r e x a t em a r g i n a lz o n eBc e l ln a t u r a lk i l l e rTc e l lp a i r e db o xp r o t e i n5p l s m a t o i dd e n t r i t i cc e l lp h o s p h a t eB u f f e r e dS a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t
37、i o np r o p i d i u mi o d i d eq u a r t i l er a n g er h e u m a t o i da r t h r i t i sr e c e p t o ra c t i v a t o rf o rn u c l e a rf a c t o r 一1 cBl i g a n ds e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c ym o u s es y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u ss p e c i f i
38、cp a t h o g e nf r e e乙二胺四乙酸酶免疫分析法酶联免疫吸附实验流式细胞术胎牛血清滤泡B 细胞生发中心B 细胞伊红一苏木素染色辣根过氧化物酶干扰素免疫球蛋白免疫组化白介素1 7 A白介素2 1白介素6积分吸光度主要组织相容复合物甲氨蝶呤边缘区B 细胞自然杀伤T 细胞n a浆细胞样树突状细胞磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应碘化丙啶四分位数间距类风湿关节炎核因子1(B 受体活化因子配体重症联合免疫缺陷小鼠系统性红斑狼疮无特定病原体1 1万方数据缩略词对照上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文S P RT lB 细胞T zB 细胞T f hT L RT M B1 2s u r f
39、a c ep l a s m ar e s o n a n c et r a n s i t i o n a lt y p e1Bc e l lt r a n s i t i o n a lt y p e2Bc e l lf o l l i c u l a rTh e l p e rt o l l l i k er e c e p t o rt e t r a m e t h y l b e n z i d i n e表面等离子共振技术过渡1 型B 细胞过渡2 型B 细胞滤泡T 辅助细胞T o l l 样受体四甲基联苯胺万方数据上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文第一部分引言第一部分艾拉莫
40、德对M R L I p r 小鼠类狼疮样疾病的治疗效应研究引言系统性红斑狼疮(s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s，S L E)被认为是所有自身免疫病的原型病。它以多克隆高度活化的自身反应性T、B 细胞及丰富的自身抗体产生为特征(1)，可累积肾、皮肤、肺、神经、关节等多系统，重者可造成患者重要脏器失功甚至死亡。我国的S L E 发病率约为1 1 0 0 0，推测患者总数超过1 0 0 万(2)。目前治疗S L E 的主流药物可分两大类：糖皮质激素和免疫抑制剂，前者为S L E 的基础用药，而后者通常为广谱免疫抑制剂或细胞毒药物。尽管
41、近2 0 年内狼疮患者的生存率已有显著提高(3)，但目前的治疗仍以控制病情为主，且中度以上活动及复杂病例的疗效仍欠理想。与此同时，这两类药物都存在多重副作用，如肝肾损害、代谢紊乱、骨髓抑制等。其中由于强力免疫抑制治疗导致的感染，仍是S L E 患者的重要死因之一(3)。图1 艾拉莫德结构式F i g u r e1 S t r u c t u r eo fi g u r a t i m o d化学合成小分子药物艾拉莫德(T 6 1 4)有可能成为新的S L E 治疗候选药物。它的化学名称为3 一甲酰胺基7 甲磺酰胺基一6 苯氧基一4 H 一1 一苯丙吡喃一4 一酮(C 1 7 H 1 4 N 2
42、 0 6 S，图1)。万方数据第一部分引言上海交通大学医学院l l 级博士学位论文目前己发现艾拉莫德具有多重免疫调节和抗炎作用。早期的国外研究者发现艾拉莫德能够抑制滑膜细胞T N F a 及单核细胞N F r d 3 通路(4)，并能增加单核细胞膜稳定性(5)。在实验性变态反应性脑脊髓炎(e x p e r i m e n t a la u t o i m m u n ee n c e p h a l o m y e l i t i s，E A E)模型中，艾拉莫德尚能抑制髓鞘碱性蛋白特异的自身反应T 细胞功能(6)。本课题组在前期的胶原诱导关节炎模型(c o l l a g e ni n d
43、 u c e da r t h r i t i s，C I A)及体外实验中，证明艾拉莫德显著抑制大鼠关节炎发生、并具有明显骨保护作用，并下调I L 1 7、I L 一1、I L 一6、I F N 一1，等炎症因子(7)。南京医科大学药学院的新近研究进一步明了艾拉莫德对I L 1 7 信号通路和小鼠C I A 有显著抑制作用(8)。在临床应用方面，在本课题组与国外研究者分别完成的艾拉莫德治疗类风湿关节炎(r h e u m a t o i da r t h r i t i s，R A)I I I I 期临床试验中，艾拉莫德显示出良好的耐受性，并与R A 金标准治疗药物甲氨蝶呤基本等效(9 1
44、2)，并具有独特的骨保护作用，是一种新型的改善病情抗风湿药(d i s e a s e m o d i f y i n ga n t i r h e u m a t i cd r u g s，D M A R D)。S L E 与R A 有许多共同的发病机理。而在上述己发现的艾拉莫德的作用机制中，有多项正是S L E 发病中的重要环节：自身反应性B 细胞产生的自身抗体；自身反应T 细胞通过共刺激分子激活B 细胞(1)；多种细胞因子，如B 细胞激活因子(1 3)(Bc e l la c t i v a t i n gf a c t o r，B A F F)、I L 一6、I L 一1 7(1 4)
45、等，在S L E 发病中有重要信号放大作用，并能促使相关免疫细胞绕过传统途径活化，造成病理性免疫损伤。由此我们猜测，艾拉莫德在治疗R A 的同时，对S L E 可能也有治疗作用。为考察艾拉莫德对S L E 究竟存在治疗作用与否，本研究选择了经典的自发性狼疮鼠M R L l p r 为模型，观察了艾拉莫德对其类狼疮样疾病的疗效。M R L 品系小鼠的基因背景会导致其在生命晚期出现肾炎等自身免疫病变，但程度较轻；而f p 厂基因突变可影响邻近的F a s 基因功能(1 5)，使小鼠自身反应性的淋巴细胞凋亡功能受损，导致小鼠在生命周期后期自淋巴器官肿大、淋巴细胞高度累积。作用于M R L 背景的勿r
46、 基因可大大提前和加速M R L 小鼠自身免疫病的发生和发展，其免疫性肾炎、血清丰富的自身抗体、关节炎症、皮肤损伤等表现类似人类S L E，被认为是经典S L E 动物模型之一(1 6)。】4万方数据上海交通大学医学院ll 级博士学位论文第一部分材料与方法本研究中，我们随机给予M R L I p r 小鼠艾拉莫德或空白载体溶液(安慰剂对照)。给药过程中我们观察了小鼠的肾脏、关节、血清自身抗体、免疫学标记物等多重维度，以系统评价小鼠的类狼疮样疾病活动度。1 仪器和试剂1 1 主要实验仪器C e n t r i f u g e5 8 0 1R 离心机C e n t r i f u g e5 4 1
47、 7R 低温高速离心机超净台M i l l Q 超纯水仪S A N Y O-7 0 超低温冰箱高温压力灭菌锅I K A 漩涡混匀机Q T 1 漩涡混匀机N 0 2 1 2 0 M A X 2 1 9 电子天平全自动生化分析仪A D V I A1 8 0 0U R I T 2 9 0 0 全自动血液分析仪R M 2 2 3 5 切片机共聚焦显微镜L e i c aT C SS P 5O l y m b u s 倒置相差显微镜N G l l 5 0 H 自动包埋机M i c r o p l a t es h a k e r6 8 0 酶标仪显微手术镊显微手术剪一次性使用无菌注射器(I m l)一次
48、性使用无菌注射器(5 m 1)一次性使用无菌注射器(2 0 m 1)医用干棉球湿盒材料与方法E p p e n d o r f 公司E p p e n d o r f 公司上海净化设备厂M i l l i p o r e 公司S a n y o 公司S t u r d yi n d u s t r i a l 公司安捷伦科技公司琪特分析仪公司N A V I G A T O R 公司德国西门子公司优利特公司德国L e i c a 公司德国L e i c a 公司O l y m b u s 公司德国L e i c a 公司B i o R a dL a b o r a t o r i e s 公司B
49、 i o R a dL a b o r a t o r i e s 公司上海医疗器械有限公司手术器械厂上海医疗器械有限公司手术器械厂上海康德莱企业发展有限公司上海康德莱企业发展有限公司上海康德莱企业发展有限公司上海医药公司海门市爱苯德实验器材公司1 5万方数据第一部分材料与方法上海交通大学医学院1 1 级博士学位论文载玻片盖玻片免疫组化笔冻存管E p 管，无菌离心管微量加样器T i p 头(大，中，小)医用(E D T A)抗凝管0-1 5 0 游标卡尺1 2 实验所用试剂艾拉莫德(原研药)羧甲基纤维素(C M C)注射用环磷酰胺抗核抗体(A N A)检测试剂盒羊抗小鼠I g G(H+L)柠檬
50、酸缓冲液(p H=6 o)3 0 过氧化氢P i e r c e 7 MB C AP r o t e i nA s s a yK i t羊抗小鼠I g G-F I T CD A B 显色试剂盒苏木素快速硬化封片剂羊血清小鼠l g G lE L I S A 试剂盒小鼠I g G 2 a E L I S A 试剂盒小鼠l 9 0 2 bE L I S A 试剂盒小鼠l 9 0 3E L I S A 试剂盒小鼠l g M E L I S A 试剂盒小鼠I g A E L I S A 试剂盒小鼠补体C 3E L I S A 试剂盒1 6美国P r e m i e r e 公司美国P r e m i e