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1、 精液常规检测的标准化方法探讨精液常规检测的标准化方法探讨北京医院检验科北京医院检验科 单战海单战海 根据世界卫生组织根据世界卫生组织(WHO)1、2调查调查1万对不育夫妇中可万对不育夫妇中可能男性导致不育的因素占能男性导致不育的因素占33%,女性不育的因素占女性不育的因素占25%,双方双方共同因素占共同因素占20%,双方找不到原因者占双方找不到原因者占15%。换句话说，不。换句话说，不育因男方的原因占育因男方的原因占55%以上。在排除了男性的精索静脉曲以上。在排除了男性的精索静脉曲张、睾丸的异常、精道阻塞、生殖系炎症、内分泌及染色张、睾丸的异常、精道阻塞、生殖系炎症、内分泌及染色体异常等疾病
2、后，精液常规检查成了判断男性是否具有生体异常等疾病后，精液常规检查成了判断男性是否具有生育能力的唯一指标，所以正确的实验室诊断非常重要。育能力的唯一指标，所以正确的实验室诊断非常重要。在我国90%以上的实验室精液常规的检查是普通显微镜的直接镜检法,这种方法人为的因素差别很大，不同的实验室及同一实验室不同的人在镜检同一标本时都会有不同的结论。轻者给临床造成了误诊，重者给患者造成了巨大的经济或精神损失。下面是我实验室去年接受地方医院的一些特殊病例研究结果：材料和方法材料和方法 一、标本来源1患者a(顶体蛋白缺少患者）：精子活动率95%、畸形精子2%、精子计数180 x 109/L、半小时液化。2.
3、患者b(精原细胞的误诊）：白细胞满视野/Hp、偶见精子。病人称已用过多种抗生素治疗均未见效。3患者c(长尾精子的误诊)：精子活动率98%、畸形精子3%、精子计数210*109/L、半小时液化。二、标本的收集根据传统的精液检查方法,采取手淫法留取标本,将标本留入灭菌干燥容器内,在30分钟内送到化验室并注意保温.留取每个病人禁欲3-5天后的精液做为实验组。在留取病人标本的当日,同时约定已生育过的25岁35岁正常男性10人，留取精液为对照组。三、研究方法 1普通图片镜检法 患者a组：待精液液化后涂片在高倍镜下把视野调暗观察,发现精子的头部略圆.涌动速度较慢.于是做如下实验.将生育组10人（1号10号
4、），即对照组与患者1的精液同时涂片，盖上盖玻片放在阴凉处，待精子自然死亡而盖玻片内的精液又未完全干涸时，每人随机测量100个精子，用目镜测微器测量精子的大小。根据文献6判定标准如下，正常精子头部呈卵圆形，长约35m,宽23m,中段(体部)78m。尾部伸长45m。头部前2/3处为顶体。测量结果见表1。患者b组：Clermont(1963年)认为，在光镜下可区分三种精源细胞，即A型（Ad为黑色型，Ap为灰色型）和B型。根据核的构造可分：1）黑色型（Ad）：具有圆盘状的核，其中有浓染的染色物质何中心形成空泡。泡浆呈PAS阳性，核呈嗜碱性；2）灰（浅）色型（Ap）：具卵圆形或椭圆盘状的核，着色浅，染色
5、颗粒和1-2个核膜相连，具核小体。胞浆PAS阴性；3）B型：具有球形的核，有粗大的浓染颗粒。待精液液化后,在高倍镜下观察,注意把视野调暗。白细胞的判定标准是细胞中呈均匀的点状，而精源细胞除点状结构外还有其他结构，同样我们将实验组与对照组的10份精液标本(一.十)在同一条件下用高倍镜将每份标本测定30个视野(A1A30)，结果见表5与表6.患者c组：待精液液化后涂片，发现精子的泳动速度较慢，原地打转者居多。待精精子自然死亡后，用目镜测微器测量精子的大小，根据文献，正常精子头部呈卵圆形，长约35m,宽23m,中段(体部)78m。尾部伸长45m。同样我将对照组10份精液标本（一.十）与实验组在同一条
6、件下测定，每个标本我们选定30个精子(A1A30)进行检测，测定统计结果见表9。2瑞氏吉氏染色法 患者a组：待精液液化后,依血片推片法,将精液推成薄片,吹干后放95%乙醇中固定1小时,取出吹干,用瑞氏吉氏染色液(瑞氏染液与吉氏染液10:1混合)，在加等量的蒸馏水，混匀染色20分钟，染色后用自来水冲片，把染片置于95%乙醇中浸25秒，脱掉片膜上的浮色，干燥后用光学树脂封片，置油镜下镜检，在片膜的尾部计数100个精子，根据文献精子头部前2/3处为顶体，呈浅红色，核位于顶体基部呈紫红色，核内可见空泡。尾部呈紫红色。用目镜测微器测量精子的大小，结果发现头部呈圆形,尾部略长。同样我将对照组10份精液标本
7、（1号10号）与实验组在同一条件下测定，每个标本随机测量100个精子，测量结果见表2。患者b组：待精液液化后，用瑞氏吉氏染色法进行相同的检测9,我们将实验组与对照组的10份精液标本(一.十)在同一条件下用高倍镜将每份标本测定30个视野(A1A30)，结果见表5与表6.患者c组：待精液液化后，用瑞氏-吉氏染液处理标本，用目镜测微器测量精子的大小，测量结果发现，精子的尾部变化较大，整个精子的形态偏长。我们将对照组与试验组按上述方法测定，统计结果见表9。3过氧化酶染色法 白细胞浆中出现蓝色或蓝色至兰黑色颗粒，而精源细胞无此反应。我们将患者b组的对照组10人与试验组在同一条件下处理，随机测定30个视野
8、。结果见表5与表6.利用细胞中的过氧化酶将过氧化氢中的氧释放出来,使联苯胺氧化成氧化联苯胺,后者和亚硝基铁氢化钠合成蓝色颗粒,沉着于细胞内。如常法涂片，自然干燥。滴加第一液（联苯胺0.3克、碱性复红0.1克、95%乙醇100毫升）染色约1分钟，再加等量的第二液（3%过氧化氢0.3毫升、蒸馏水25毫升）与上液混均，染色约5分钟，用水冲洗，用95%的酒精脱色，至使红色退去为止，并用水冲洗，待干后用瑞氏染液复染，用水冲洗，待干后镜检。4 荧光显微镜法 7690-Xu荧光染液是天津医科大学细胞室研制的，用于流式细胞分析的荧光试剂。它的着色原理是对失去活性的人体蛋白着色，根据这一原理对精子、精原细胞及白
9、细胞进行染色分析。依据本方法我们将患者b组的对照组10人与试验组在同一条件下处理,随机测定30个视野(A1A30)的白细胞个数,结果见表5与表6。根据同样的原理我们将患者c组的对照组10人与试验组在同一条件下处理按上述方法测定,统计结果见表9.5其他两种辅助诊断方法 鞭打频率测定：根据文献测定7，待精液液化后制片，在相差暗视野显微镜下，用高倍物镜选择精子密度分散较好的视野，测定一个精子尾部来回摆动（即鞭打）50次用秒表计时，测10个精子获X1，X2.X10为鞭打次数的时间,按下式计算频率:精子尾鞭打频率=100/X1-10=Hz(Hz为每秒钟尾鞭打的次数)我们将患者a组的对照组（1号10号）与
10、实验组在同一条件下测定，每个标本随机选定10个精子作为测量对象，他们分别为(g1g10),测定计算结果见表3.精子泳动速度测定：待精液液化后，大约在1小时内，置一小滴精液于载物片上，盖以22*22毫米的清洁盖片，放相差显微镜下，找出精子，观察精子泳动状况，在室温（24）下，开启秒表计时，求其在150微米中所用的时间，计测10个精子，得X1，X2，.X10的精子泳动速度值。精子泳动速度=1500m/X1-10=m/sec 即测得一个精子的平均速度 我们将患者a组的对照组（1号10号）与实验组在同一条件下测定，每个标本随机选定10个精子作为测量对象,他们分别为(g1g10),测定计算结果见表4.结
11、结 果果 患者a组 通过表1与表2的实验数据可以看出,对照组10例用普通显微镜法和瑞吉氏染色法无显著差异(P0.05)，但是测定组却有极显著差异(P0.01)。通过.鞭打频率测定，生育组7.780.71HZ,不育组5.890.81 HZ,两组t检验t=7.91,P0.001,具极显著差异。精子泳动速度测定，生育组25.702.62m/sec,不育组18.652.32m/sec,两组t检验t=8.19,P0.05,各组间差异无显著性。而实验组却发生了较大的变化（表7与表8）。在测定白细胞时，通过中位数检验试验组普通镜检法与瑞氏-吉氏染色法、过氧化酶染色法及荧光显微镜法有显著性差异（p0.05)。
12、试验组间普通镜检法与瑞氏-吉氏染色法及荧光显微镜法有显著性差异。瑞氏-吉氏染色法与荧光显微镜法无显著性差异。讨讨 论论 精液常规分析是判断男性生育能力的有效手段,随着男科临床与基础研究的不断发展，精液分析的方法也在不断的更新。传统的鉴别精子形态的方法一般都采用普通显微镜法、相差显微镜法、HE染色、改良巴士染色及瑞-姬式染色，以上方法人为因素差别很大，不同人操作得出的结论有所不同，并且染色方法及染色时间难以掌握，受病人服药、自身免疫等因素影响较大。各实验室精液常规检查大多采用新鲜精液直接镜检判定结果10、11，这种方法人为误差更大，同一标本不同的人或在不同的实验室会得出不同的结论。在临床应用中尚
13、缺乏一种人为误差较小，便于普遍推广使用的新方法。排除人为干扰给临床以准确的诊断是摆在每个医学工作者面前的一个重大课题。所有文献显示，到目前为止，我们还没有找到一种切实可行的在全国范围内顺利推广的标准方法应用于临床。笔者在研究中发现，过去传统教课书中的生育能力的判定标准及正常范围都有待于进一步考证。近10年来，随着环境的污染及人们饮食结构的变换，生育能力的检查尤其是男性学科的发展成了更重要的课题摆在我们面前。就传统的方法而言，精液常规究竟检查到什么程度，给出什么样的确诊指标及应用什么样的方法都没有详细的参照依据，各地方医院只是根据自己的实际条件做一些简单的工作。例如：简单的图片检查。这些检查轻则造成临床误诊，重则给病人及家属造成严重的经济和精神上的损失。所以，各地方医院不要以一次检查或单一的试验方法为依据轻易给临床以诊断数据。