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1、第五章第五章PCR技术原理技术原理定义：定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内DNA复制的复制的方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩某个特殊区域扩增出来的技术。增出来的技术。nPCR技术技术:PCR概念的提出概念的提出n1983，Kary Mullis引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高
2、温。Heat-stable polymerase is vital to the ease of the processthermusaquaticusTaqDNA多聚酶多聚酶的发现的发现1988年年Saiki等从温泉等从温泉（Hotspring）中分离）中分离的一株水生嗜热杆菌的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。此酶具有以下特点此酶具有以下特点：耐高温，耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增大大提高了扩
3、增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度长度(2.0Kb)。酶命名为酶命名为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被。此酶的发现使被PCR广泛应用。广泛应用。在在1989年，年，Science将将PCR中的中的TaqDNA多聚酶命多聚酶命名为当年的风云分子名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)1 1 1 1、PCRPCRPCRPCR技术的基本原理技术的基本原理技术的基本原理技术的基本原理在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中在微量离心管中,加入适量的加入适量的加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液,微量的微量的微量的微量的模板模板模
4、板模板DNADNADNADNA,四种脱氧四种脱氧四种脱氧四种脱氧单核苷酸单核苷酸单核苷酸单核苷酸,耐热性耐热性耐热性耐热性多聚酶多聚酶多聚酶多聚酶,一对合成一对合成一对合成一对合成DNADNADNADNA的的的的引物引物引物引物,通过通过通过通过高温变性、高温变性、高温变性、高温变性、低温退火低温退火低温退火低温退火和和和和中温延伸中温延伸中温延伸中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循每一次循每一次循每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍环使特异区段的基因拷贝数放大一倍
5、环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过一般样品是经过一般样品是经过一般样品是经过30303030次循环次循环次循环次循环,最终最终最终最终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的扩增了特异区段的扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNADNADNA带。带。带。带。一、一、一、一、PCRPCRPCRPCR技术的基本原理和工作方式技术的基本原理和工作方式技术的基本原理和工作方式技术的基本原理和工作方式94949494变性变性变性变性 50-6550-65退火退火退火退火72延伸延伸延伸延伸2.PCR反应过程反应过程：20-402
6、0-40个个个个PCRPCR循环循环循环循环1个个PCR循环循环PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火模板：单链或双链模板：单链或双链DNA引物：引物：16-30bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的DNA聚合酶聚合酶底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+Mg2+：DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂3.PCR基本要素基本要素4.PCR反应
7、程序反应程序949630-3预变性（使模板预变性（使模板DNA充分变性）充分变性）9430变性变性50-6030-1复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72n(按按1扩增扩增1kb计算）延伸计算）延伸723-7总的延伸（使产物延伸完整）总的延伸（使产物延伸完整）4-10保存保存 25-35个循环个循环1）复性和延伸复性和延伸温度温度 复性的温度是复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60之间。具体的温度主要由引物的之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定值决定（低于（低于Tm值值2-3）。）。延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数
8、设定为72。如果复性的温度很高，。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法法PCR。2）反应）反应时间时间 变性一般使用变性一般使用30秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的G+C含量较高，或含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有复性时间有30秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用用1分分钟来保证充足的时间。钟来保证充足的时间。3）循环）循环次数次数循环次数主要与模板的起始数量有关，
9、循环数通常为循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为2535次。次。平台效应（平台效应（plateaueffect）：）：PCR扩增过程后期出现扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和和DNA聚合聚合酶的稳定性或活性降低酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不竞争作用，扩增产物自身复
10、性，高浓度扩增产物变性不彻底。彻底。4）PCR反应液的配制反应液的配制最后加入最后加入DNA聚合酶。聚合酶。早期的早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。性扩增的问题。总体积总体积总体积总体积 50-100 50-100 l l缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 dNTPdNTP（底物）（底物）（底物）（底物）引物引物引物引物 模板模板模板模板 DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 5 5 5 5、反应体
11、系、反应体系、反应体系、反应体系 缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的PHPH值和值和值和值和DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂10mM10mMTrisHClTrisHCl（pH8.3-9.0pH8.3-9.0），），），），1.5mM1.5mMMgCl2，50mMK+dNTPdNTP（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的 44种种种种 dNTPdNTP（即即即即 dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP和和和和dGTPdGTP），），），），终浓度一般为终浓度一
12、般为终浓度一般为终浓度一般为 200mM200mM（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），（即饱和浓度），dNTPdNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。引物：引物：引物：引物：1 1M/LM/L 引物设计的一般原则引物设计的一般原则长度：至少长度：至少16bp，通常为，通常为18-30bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链温度：两个引物之
13、间的Tm值差异最好在值差异最好在2-5。对于小于对于小于20个碱基的引物其个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。）。对于对于14-70个核苷酸的引物可用个核苷酸的引物可用以下公式计算。以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数目，表示引物的核苷酸数目，K+表示单价离子即钾离子的浓度表示单价离子即钾离子的浓度避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3端）。端）。G+C含量：尽量控制在含量：尽量控制在40%至至60%
14、之间，之间，4种碱基的分布应种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在在3末末端的重复排列。端的重复排列。引物的引物的3末端最好是末端最好是G或或C，但不要，但不要GC连排。连排。模板：模板：模板：模板：单、双链单、双链单、双链单、双链DNADNA均可。均可。均可。均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过模板浓度过模板浓度过模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。高会导致反应的非特异性增加。高会导致
15、反应的非特异性增加。DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶：最常用的是最常用的是最常用的是最常用的是TaqTaqDNADNA聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度7575。PfuPfu DNADNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-53-5外切外切外切外切活性的活性的活性的活性的 PCRPCR酶，目前为止酶，目前为止酶，目前为止酶，目前为止错配率最低错配率最低错配率最低错配率最低的高温的高温的高温的高温DNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。酶量增加使反应特异
16、性下降酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。6.PCR6.PCR6.PCR6.PCR技术的特点技术的特点技术的特点技术的特点1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍2 2）特异性）特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的反应结果的关键。关键。引物设计的最大原则是最大限度地
17、提高扩增效率和特异性；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。同时尽可能减少非特异性扩增。引物引物3 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行 PCRPCRPCRPCR扩增法扩增法扩增法扩增法,只需要只需要只需要只需要数小时数小时数小时数小时,就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出就可以用电泳法检出1g1g1g1g基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。通通通通常常常常的的的的DNA DNA DNA D
18、NA 扩扩扩扩增增增增法法法法是是是是分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆法法法法,首首首首先先先先要要要要构构构构建建建建含含含含有有有有目目目目的的的的的的的的基基基基因因因因的的的的载载载载体体体体,然然然然后后后后将将将将它它它它导导导导入入入入细细细细胞胞胞胞后后后后进进进进行行行行扩扩扩扩增增增增,还还还还要要要要用用用用同同同同位位位位索索索索探探探探针针针针进进进进行行行行筛筛筛筛选选选选;这这这这种种种种方方方方法法法法,要要要要经经经经过过过过DNADNADNADNA内内内内切切切切、连连连连接接接接、转转转转化化化化和和和和培培培培养养养养等等等等相相相相关关关关的的的的过程
19、过程过程过程,操作复杂操作复杂操作复杂操作复杂,一般需要一般需要一般需要一般需要数周数周数周数周时间。时间。时间。时间。4 4 4 4）用途广泛）用途广泛）用途广泛）用途广泛生命学科生命学科生命学科生命学科医学工程医学工程医学工程医学工程遗传工程遗传工程遗传工程遗传工程疾病诊断疾病诊断疾病诊断疾病诊断法医学法医学法医学法医学考古学考古学考古学考古学1.长片段长片段DNA的的PCR扩增扩增常规常规PCR长度为长度为2kb以下。以下。长片段长片段PCR扩增存在的问题：扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板）高温会损坏模板DNA和
20、和PCR产物产物（3）高温下其他二价离子的存在会促进）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解的裂解（4）长片段）长片段DNA分子的变性比短片段困难，分子的变性比短片段困难，DNA聚合聚合酶与模板酶与模板DNA的趋近和接合变得困难的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度挥，从而限制产物的长度二、二、PCR的类型的类型n改进：改进：(1)改进缓冲体系改进缓冲体系(2)采用混合采用混合DNA聚合酶聚合酶主体使用扩增效率高，延伸能力强的主体使用扩增效率高，延伸能力强的TaqTaqDNADNA聚聚聚聚合酶
21、；少量使用具有合酶；少量使用具有合酶；少量使用具有合酶；少量使用具有3 3 5 5 外切酶活性的高温外切酶活性的高温外切酶活性的高温外切酶活性的高温DNADNA聚聚聚聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。2.PCR扩增未知扩增未知DNA片段片段1).染色体步查（移）（染色体步查（移）（chromosomewalking）：）：是指从生物基因组或基因组文库中的是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出已知序列出发发，逐步获得，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方的方法和
22、过程。法和过程。2).反向反向PCR(inversePCR)一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。扩增原理：扩增原理：已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶步骤：步骤：首先首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再再将酶切后的将酶切后的DNA片段连接成环状分子，片段连接成环状分子，最后最后根据已知片段两端的序列设计引物，根据已知片段两端的序列设计引物，PCR扩增邻近的扩增邻近的DNA片段。片段。3).利利用接头用接头的的PCR步骤：步骤
23、：(1)基因组基因组DNADNA的限制性内切酶酶切，的限制性内切酶酶切，（2 2）接头与限制性内切酶片段的连接，）接头与限制性内切酶片段的连接，（3 3）已知序列侧翼未知序列的）已知序列侧翼未知序列的PCRPCR扩增（利用分别扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。根据已知序列和接头序列设计的引物）。4).（1）热不对称交错）热不对称交错PCRTAIL-PCR的基本原理的基本原理：利用目标序列旁的已知序列设计利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物个嵌套的特异性引物（简称（简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和），用它们分别和1个具有低个具有低Tm值的值的短的随机简并引物
24、（短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约，约14bp）相组合，根据）相组合，根据引物的长短引物的长短和和特异性的差异特异性的差异设计设计不对称不对称的温度循环的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。，通过分级反应来扩增特异引物。第一次反应包括第一次反应包括5次高特异性、次高特异性、1次低特异、次低特异、10次较低特异性反应次较低特异性反应和和12个热不对称的超级循环。个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使次高特异性反应，使sp1与已知的与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应次低特异性的反应
25、使简并引物结合到较多的目标序列上；使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。次超级循环。第二次反应则将第一级反应的产物稀释第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过倍作为模板，通过10次次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，反应或热不对称超
26、级循环，通过上述通过上述3次次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。反应可获得与已知序列邻近的目标序列。sp1，sp2，sp3随机引物随机引物 高浓度引物低浓度引物（2）不对称）不对称PCR 3.3.与反转录相关的与反转录相关的PCR扩增扩增RT-PCR（reversetranscriptase-PCR,RT-PCR):又称反转录又称反转录PCR,是以反转录的是以反转录的cDNA作模板所进行的作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析。可对基因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR扩增AAAnAAAAnA逆转录酶逆转录酶反转录反转录TTTnTcDNA第一链第一链mRN
27、A1）cDNA末端的快速扩增（末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5RACE：GSP3设计引物，合成cDNA第一链AAAAA.AAAAnPoly(A)尾TTTTT.TTTT5APAAAAA.AAAAnTTTTT.TTTT5用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链TTTTT.TTTT5-TTTTT.TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3RACE特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增2)差异显示差异显示PCR:(Differentialdisplayreversetranscriptase-PCR,DDRT-PCR)使用使用3端的锚
28、定引物端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，），通过反转录过程，可以将整个可以将整个mRNA群体在群体在cDNA水平上，分成大致相等水平上，分成大致相等但序列结构不同的但序列结构不同的12亚份群体，亚份群体，这一过程叫差异显示反转录这一过程叫差异显示反转录(DDRT).锚定引物的通式是锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有共有12种种oligo(dT)12MN引物。引物。4.PCR产生产生DNA指纹指纹1）多重）多重PCR(multiplexPCR)：设计多对引物，在同一个设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时反应体系中，同时扩增一份扩增
29、一份DNA样本中几个不同靶区域的样本中几个不同靶区域的DNA片断，片断，这一过程称之为多重这一过程称之为多重PCR.使用使用随机选择随机选择的核苷酸作为的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在反应体系中的引物，在较低较低的复性温度的复性温度下下(36)进行进行PCR。由于非特异性引物与模板上的。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上产物。经凝胶电泳可以将上述多个述多个PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩反应产
30、物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性增多态性DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)2）随机扩增多态性（）随机扩增多态性（randomampificationpolymorphicDNA,RAPD）是针对基因组是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立扩增而建立DNA指纹的技术。指纹的技术。1）基因组）基因组DNA的限制性内切酶酶切，的限制性内切酶酶切，2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切DNA片段的连接，片段的连接，3）（含有接头序列和酶切位点序列
31、及延伸序列的）引物对连接）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作产物作PCR扩增。扩增。3）扩增片断长度多态性）扩增片断长度多态性（AFLP,amplifiedfragmentlengthpolymorphism）GAATTCCAATTGTTAAAATTGAATTCTAATGCAATTTAATGAATTCMNVMNVAATT核心 酶切 延伸序列 位点 序列7.实时定量实时定量PCR(real-timePCR)常规常规PCR技术：技术：对对PCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析定量定量PCR技术：技术：对对PCR扩增反应中扩增反应中每一个循
32、环的产物每一个循环的产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析（1）原理：）原理：通过特定设计的通过特定设计的PCR仪器来仪器来实时检测实时检测PCR扩扩增过程中每一轮循环产物的累积数量增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量定量PCR。域值域值：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的对应的荧光强度荧光强度设定为域值。设定为域值。Ct值值：荧光信号达到域值所对应的循环次数称为：荧光信号达到域值所对应的循环次数称为Ct值。值。定量曲线定量曲线可以检测
33、扩增产物的纯度可以检测扩增产物的纯度溶解曲线溶解曲线SYBR荧光染料（荧光染料（SYBRgreen)TaqMan探针探针发夹型杂交探针发夹型杂交探针（2）荧光标记方式）荧光标记方式TaqMan探针探针工作原理工作原理三、三、PCRPCR产物的克隆产物的克隆1添加限制性酶切位点添加限制性酶切位点1）通过引物设计引入酶切位点）通过引物设计引入酶切位点2）酶切位点酶切位点应加在引物的应加在引物的5端端3）添加的酶切位点在扩增的）添加的酶切位点在扩增的DNA片断内部存在片断内部存在4）由于添加的酶切位点位于）由于添加的酶切位点位于DNA片断的末端，因片断的末端，因此必须考虑末端长度对切割的影响。此必须考虑末端长度对切割的影响。E HE H2A/T克隆克隆1）PCR产物：产物：主要适用于主要适用于TaqDNA聚合酶扩增产物。聚合酶扩增产物。Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片片断的断的3末端添加一个核苷酸，通常为末端添加一个核苷酸，通常为A。55A33A2）T-载体载体载体特点：将普通的克隆载体切成线状，并使之载体特点：将普通的克隆载体切成线状，并使之3末端含有一个突出碱基末端含有一个突出碱基T.3 3平端克隆平端克隆 连接效率较低连接效率较低 T4DNA连接酶连接酶特殊的载体特殊的载体