细胞工程7胚胎干细胞培养.ppt

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1、CELLENGINEERING细胞工程细胞工程第一章第一章 绪论绪论 4 4个学时个学时第二章第二章 实验室配置及基本技术实验室配置及基本技术 2 2个学时个学时第三章第三章 植物细胞工程的理论基础植物细胞工程的理论基础 4 4个学时个学时第四章第四章 植物组织器官培养技术植物组织器官培养技术 6 6个学时个学时第五章第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产植物细胞培养及次生代谢产物生产 3 3个学时个学时第六章第六章 原生质体培养和体细胞杂交原生质体培养和体细胞杂交 3 3个学时个学时第七章第七章 人工种子及植物种质资源保存人工种子及植物种质资源保存 2 2个学时个学时 第八章胚胎干细胞培养第

2、八章胚胎干细胞培养 2 2个学时个学时 第九章动物细胞培养第九章动物细胞培养 4 4个学时个学时第十章动物细胞融合与单克隆抗体第十章动物细胞融合与单克隆抗体 4 4个学时个学时第十一章动物组织与胚胎工程第十一章动物组织与胚胎工程 1 1个学时个学时第十二章试管动物与克隆动物第十二章试管动物与克隆动物 1 1个学时个学时课程初步安排：课程初步安排：3636学时学时第七章第七章 胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养v干细胞是什么干细胞是什么vES/EGES/EG细胞的培养及建系技术细胞的培养及建系技术vES/EGES/EG细胞的体外诱导分化细胞的体外诱导分化v诱导分化细胞的永生化诱导分化细胞的永生化vES

3、/EGES/EG细胞技术学在医学中的应用细胞技术学在医学中的应用vES/EGES/EG细胞技术学面临的问题和研究趋势细胞技术学面临的问题和研究趋势 一、干细胞一、干细胞（stem cellsstem cells）是什么是什么 具有无限的或延长的自我更新能力的细胞具有无限的或延长的自我更新能力的细胞 能产生至少一种类型的高度分化的细胞能产生至少一种类型的高度分化的细胞l 从具有的分化潜能上讲：从具有的分化潜能上讲：-专能干细胞专能干细胞-多能干细胞多能干细胞-全能干细胞全能干细胞l 从组织发生即来源上讲：从组织发生即来源上讲：-胚胎性干细胞胚胎性干细胞 -成体干细胞成体干细胞/组织干细胞组织干细

4、胞v胚胎性干细胞胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。-来自早期胚胎：胚胎干细胞（来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESembryonic stem cells,ES）-来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（来自

5、胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonic embryonic germ cells,EGgerm cells,EG）-来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonalembryonal carcinoma carcinoma cells,ECcells,EC）19811981年，年，EvensEvens和和MartinMartin分别成功的分离和体外培养了小鼠分别成功的分离和体外培养了小鼠 的胚胎干细胞；的胚胎干细胞；19951995年，年，ThomsonThomson等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎等人分离建立了第一株灵长类动物的胚胎 干

6、细胞；干细胞；19981998年，年，ThomsonThomson等建立了第一株人类胚胎干细胞；等建立了第一株人类胚胎干细胞；19981998年，年，ShamblottShamblott等建立了第一株人类生殖干细胞；等建立了第一株人类生殖干细胞；20022002年年3 3月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用月，美国麻省理工学院科学家宣布，他们首次利用 人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在 治疗心血管疾病等领域的应用潜力；治疗心血管疾病等领域的应用潜力；目前已有报导，目前已有报导，ESES细胞在离体适当条件下分化为心肌细

7、胞，细胞在离体适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。胰岛细胞及血管内皮细胞，肝细胞等。v成体干细胞（成体干细胞（adult stem cells,ASadult stem cells,AS），也叫作组织干细胞，也叫作组织干细胞（tissue stem cellstissue stem cells）是指一群分布在成体组织中处于尚是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统

8、的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。-造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。-骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。等不同分化细胞。二、二、ES/EGES/EG细胞的培养建系技术细胞的培养建系技术

9、 分离囊胚的内细胞群分离囊胚的内细胞群与成纤维细胞共培养，与成纤维细胞共培养，ESES细胞非分化增殖细胞非分化增殖分离胚胎生殖腺细胞分离胚胎生殖腺细胞胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化定向诱导分化功能细胞功能细胞1 1、ESES/EGEG细胞的来源细胞的来源(1)(1)发育良好的囊胚，从中分离发育良好的囊胚，从中分离ICMICM，进一步分离培养进一步分离培养ESES细胞细胞(2)(2)从胚胎生殖腺中分离出从胚胎生殖腺中分离出EGEG细胞细胞 (3)(3)从畸胎瘤中分离出从畸胎瘤中分离出ECEC细胞细胞(4)(4)治疗性克隆即体细胞核转移（治疗性克隆即体细胞核转移（SCNTSCNT）途

10、径分离培养）途径分离培养ESES细胞细胞 2 2、ES/EGES/EG细胞的分化抑制培养细胞的分化抑制培养l 目前常用的细胞分化抑制物主要有三种目前常用的细胞分化抑制物主要有三种:-饲养层细胞饲养层细胞(feeder layer)(feeder layer)-特殊细胞的条件培养液特殊细胞的条件培养液(conditioned medium),(conditioned medium),如如BRL(BuffaloBRL(Buffalo rat liver)rat liver)细胞条件培养液细胞条件培养液-分化抑制因子分化抑制因子(differentiation inhibitory factor,(

11、differentiation inhibitory factor,DIF),DIF),如白血病抑制因子如白血病抑制因子(leukemia(leukemia inhitoryinhitory factor,LIFfactor,LIF)l饲养层细胞培养法：饲养层细胞培养法：常用的饲养层细胞有下列两种：常用的饲养层细胞有下列两种：（1 1）MEFMEF细胞细胞(mouse embryonic fibroblast)(mouse embryonic fibroblast)，取自各种品，取自各种品系小鼠的系小鼠的12dpc12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规

12、分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。胞培养为单层散布的成纤维细胞。（2 2）STOSTO细胞细胞，来自，来自SIMSIM小鼠小鼠(S)(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)(T)和和乌本苷乌本苷(O)(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子(stem cell(stem cell factor,SCFfactor,SCF)以及白血病抑制因子以及白血病抑制因子(leukemia(leukemia inhibitory inhibitory factor,LIFfactor,LIF)。l无饲养层培养法：无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一

13、定程度上使饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EGES/EG细胞培养显得较繁杂。细胞培养显得较繁杂。近来以近来以添加添加LIFLIF生长因子生长因子或或某些特定细胞的条件培养液某些特定细胞的条件培养液至含至含FCSFCS的的正常培养液，借此替代饲养层细胞：正常培养液，借此替代饲养层细胞：（1 1）直接在）直接在ESES细胞基础培养液中加入重组细胞基础培养液中加入重组LIFLIF（2 2）BuffaloBuffalo大鼠肝细胞条件培养液大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)(BRL-CM)（3 3）2 23 3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)(RH-CM)3

14、3、ES/EGES/EG细胞系的特性和鉴定细胞系的特性和鉴定（1 1）形态学特征）形态学特征（2 2）发育全能性和分化潜能鉴定）发育全能性和分化潜能鉴定（3 3）嵌合体动物）嵌合体动物（1 1）形态学特征）形态学特征l 体外培养小鼠体外培养小鼠ES/EGES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强。此界限不清楚，粘连性强。l

15、人人ESES与与EGEG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EGES/EG也有所也有所不同。单层培养时，人体不同。单层培养时，人体ESES细胞呈扁平状群落，且细胞界限细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。清楚。（2 2）发育全能性和分化潜能鉴定）发育全能性和分化潜能鉴定 小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外胚胎性干细胞，具有特有的表达标志以及在体内外的分化特点。的分化特点。干细胞标记干细胞标记鼠类鼠类EC鼠类鼠类ES鼠类鼠类EG人类人类EC人类人类ES人类人类EGSSEA-1

16、+-+SSEA-3 -+SSEA-4 -+TRA-1-60 -+TRA-1-80 -+AKP +Oct-4Oct-4 +？+小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱小鼠与人类多能干细胞标记蛋白表达谱 lSSEAsSSEAs(stage-specific embryonic antigen):(stage-specific embryonic antigen):时期专一性胚胎时期专一性胚胎抗原抗原lTRA-1-60TRA-1-60、TRA-1-81:TRA-1-81:肿瘤排斥抗原肿瘤排斥抗原lAKPAKP：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的：碱性磷酸酶在小鼠及灵长类的ESES细胞中活性较高，在已分化细胞中活性

17、较高，在已分化细胞中活性明显降低；细胞中活性明显降低；lOct-4Oct-4:是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能是生殖系专一性转录因子。作为和胚胎发育全能/多能性多能性相关的转录因子，相关的转录因子，Oct-4Oct-4通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因通过多种调控机制激活或抑制不同靶基因的转录，在细胞的全能的转录，在细胞的全能/多能性及未分化状态的调控和维持中发挥多能性及未分化状态的调控和维持中发挥重要作用。重要作用。l端粒酶端粒酶(telomerase):(telomerase):一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末一类核糖核蛋白，与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和控制细胞寿

18、命有关。人端的端粒长度和控制细胞寿命有关。人ESES细胞的端粒酶活性高，而细胞的端粒酶活性高，而分化细胞一般难以检测到；分化细胞一般难以检测到；l胚胎干细胞的特异性表达标志：胚胎干细胞的特异性表达标志：l ES/EGES/EG细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的细胞在体外被刺激分化为各种类型细胞是其最基本的 属性属性;l ES/EG ES/EG细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、细胞接种于同一品系的小鼠或免疫缺陷小鼠腹股沟、眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成眼窝、腹腔等可以形成由内胚层、中胚层和外胚层细胞构成 的畸胎瘤。的畸胎瘤。l胚胎干细胞的体内、外分化

19、特点：胚胎干细胞的体内、外分化特点：l 组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的组织和器官的细胞由含有两个或两个以上基因型构建而成的完整个体称为嵌合体动物完整个体称为嵌合体动物（chimaerachimaera）。把。把ES/EGES/EG细胞注入胚细胞注入胚泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主泡或与桑椹胚聚集，使其与正常胚胎结合在一起，并参与宿主胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系胚胎发育，可形成嵌合体动物的各种组织和器官，包含生殖系l 嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是嵌合体动物可通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定或是取器

20、官组织进行同功酶检测取器官组织进行同功酶检测(3)(3)嵌合体动物嵌合体动物 三、三、ES/EGES/EG细胞的体外诱导分化细胞的体外诱导分化1 1、基本原理、基本原理l 细胞诱导细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；的现象；l ESES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同；l 在体胚胎的细

21、胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力的反应能力(competence)(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；素的限制；l ESES细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式细胞体外诱导分化实验中，所用诱导物质繁多，诱导模式 不尽相同，按其作用机理大致分为两类：不尽相同，按其作用机理大致分为两类：-使被诱导细胞可逆性轻度损伤，导致神经细胞分化使被诱导细胞可逆性轻度损伤，

22、导致神经细胞分化 无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物等-诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化诱导物通过其与被诱导细胞表面的受体结合而诱导细胞分化 类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等类固醇激素、维甲酸衍生物、多肽生长因子等 同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。被诱导细胞本身

23、的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。l ESES细胞体外诱导分化途径可分为：细胞体外诱导分化途径可分为：-谱系分化谱系分化（lineage differentiationlineage differentiation），有利于认识组织），有利于认识组织 谱系细胞分化机理和全过程谱系细胞分化机理和全过程。ES ES细胞细胞 谱系祖细胞谱系祖细胞 谱系定型细胞谱系定型细胞 终末分化细胞终末分化细胞-定向分化定向分化（committed committed differeniationdiffereniation），需设法控制导向），需设法控制导向 产生单一类型的分化细胞。产生单一类型的分化细胞

24、。对对ESES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因、细胞分化因子 结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径结合报告基因和诱导条件选择等手段，探索定向诱导分化途径2 2、ESES细胞体外诱导分化的基本方法细胞体外诱导分化的基本方法l单层单层ESES细胞细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞lESES细胞拟胚体细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较 单一单一,具体方法有：具体方法有：（1 1）软琼脂培养软琼脂培养 （2 2）悬滴培养悬滴培养

25、制备制备ESES单细胞悬浮液单细胞悬浮液培养皿盖上接种培养皿盖上接种20ul/20ul/滴，直径滴，直径10cm10cm的培养皿盖的培养皿盖盖上带有悬浮细胞小滴的盖子盖上带有悬浮细胞小滴的盖子培养皿内加培养皿内加PBSPBS培养皿边缘用膜封培养皿边缘用膜封 置置3737，5CO 2培养箱培养培养箱培养3d3d后，转移拟胚体至含后，转移拟胚体至含细胞分化诱导剂的培养细胞分化诱导剂的培养皿或微孔板进一步培养皿或微孔板进一步培养然后然后,移放入铺有移放入铺有0.1%0.1%白明胶的培养皿或微孔白明胶的培养皿或微孔板内在培养液中再培养板内在培养液中再培养可被诱导分化为不同类型细胞可被诱导分化为不同类型

26、细胞 ES ES细胞体外悬滴培养细胞体外悬滴培养3 3、ESES细胞体外诱导分化举例细胞体外诱导分化举例 造血细胞造血细胞 内皮细胞与血管内皮细胞与血管 神经细胞神经细胞 脂肪细胞脂肪细胞 心肌和其他肌肉细胞心肌和其他肌肉细胞 软骨细胞软骨细胞 胰岛细胞胰岛细胞l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞：血岛样的结构并分化产生各种造血系统的细胞：用胰蛋白酶消化小鼠用胰蛋白酶消化小鼠ESES细胞拟胚体成单个细胞，经细胞拟胚体成单个细胞，经干细胞干细胞因子因子(SCF)(SCF)、血小板生成

27、素血小板生成素(TPO)(TPO)和和条件培养液条件培养液处理，诱导其定处理，诱导其定向分化为造血干细胞；向分化为造血干细胞；用原代用原代骨髓基质细胞骨髓基质细胞作饲养层和作饲养层和SCFSCF及及IL-6IL-6细胞因子细胞因子处理处理 可进一步使可进一步使ESES细胞来源的造血干细胞分化为细胞来源的造血干细胞分化为B B淋巴细胞系。淋巴细胞系。造血细胞造血细胞内皮细胞与血管内皮细胞与血管l小鼠小鼠ESES细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊细胞拟胚体在体外可以分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现：血岛样的结构，其中也有内皮细胞出现：利用经利用经转化生长因子

28、转化生长因子1(TGF-1(TGF-1)1)基因转染基因转染的小鼠的小鼠ESES细胞细胞在含在含RARA培养液培养液中经悬滴培养形成拟胚体；中经悬滴培养形成拟胚体；再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管再继续贴壁培养，发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。样结构。将将外源重组外源重组TGF-TGF-1 1添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞添加至培养液，同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。组成的血管样结构。心肌和其它肌肉细胞心肌和其它肌肉细胞l 悬浮或悬滴培养的小鼠悬浮或悬滴培养的小鼠ESES细胞拟胚体在细胞拟胚体在RARA诱导条件下贴壁诱导条件下贴壁生长数天，常出现某些分化细

29、胞集落具有节律性自发收缩的生长数天，常出现某些分化细胞集落具有节律性自发收缩的现象，显然是肌细胞：现象，显然是肌细胞：DMSODMSO诱导诱导ESES细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等细胞拟胚体可以形成心肌、平滑肌和骨骼肌等多种类型肌细胞，多种类型肌细胞，用肌肉专一性的调节因子用肌肉专一性的调节因子MyoDMyoD基因转染基因转染ESES细胞并结合细胞并结合DMSODMSO诱导处理，额外表达诱导处理，额外表达MyoDMyoD基因的基因的ESES细胞主要分化为骨骼肌且细胞主要分化为骨骼肌且常融合成肌管。常融合成肌管。vESES细胞定向诱导分化是至今仍未解决、正在探索细胞定向诱导分化是至今仍

30、未解决、正在探索中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对中的问题。根据国外少数报道和国内的经验，对ESES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或是有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件有关细胞分化因子等遗传操作，并结合诱导条件选择等手段，是一条可能的探索选择等手段，是一条可能的探索ESES细胞定向诱导细胞定向诱导分化的途径。分化的途径。四、四、ES/EGES/EG细胞诱导分化细胞的永生化细胞诱导分化细胞的永生化 寻找建立寻找建立ES/EGES/EG细胞诱导产生的分化细胞永生化细胞诱导产生的分化细胞永生化途径是目前途径是目前ES/EGES/EG细胞研

31、究领域待解决的问题。细胞研究领域待解决的问题。五、五、ES/EGES/EG培养与诱导分化的意义培养与诱导分化的意义哺乳类发育的体外模型哺乳类发育的体外模型人体的基因和细胞治疗人体的基因和细胞治疗组织工程的种子细胞来源组织工程的种子细胞来源l哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；lESES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然的信号具有应答能力。虽然ESES细胞体

32、外分化途径和机制与细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；演变较理想的实验体系；l许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人已允许将人ESES细胞类似于小鼠细胞类似于小鼠ESES细胞体外实验一样，用于细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。哺乳类发育的体外模型哺乳

33、类发育的体外模型 人体的基因和细胞治疗人体的基因和细胞治疗 这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，或输入病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细胞治疗。又称细胞治疗。l目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入 突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导入基因的整合 和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因

34、产生的 效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞 在体外不易稳定地被转染和增殖传代；在体外不易稳定地被转染和增殖传代；lESES细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍 能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量 靶细胞来源的主要问题。靶细胞来源的主要问题。定向诱导分化，选择定向诱导分化，选择治疗因子基因表达治疗因子基因表达 人人ES细胞细胞 基因操作基因操作（克服免疫学障碍）（克服免疫学障碍）多种多种MHC组

35、合组合 的的ES细胞库细胞库 组织谱系干细胞组织谱系干细胞（如造血干细胞）（如造血干细胞）功能性分化细胞功能性分化细胞（如神经细胞）（如神经细胞）移植移植移植移植 不同类型疾病的宿主不同类型疾病的宿主 基因组被改造基因组被改造 的的ES细胞细胞异源性基因表达异源性基因表达 基因修饰基因修饰 基因敲除、敲入基因敲除、敲入定向诱导分化定向诱导分化选择选择 组织谱系干细胞或组织谱系干细胞或功能性分化细胞功能性分化细胞移植移植图图2-2-1 用于基因和细胞治疗的人用于基因和细胞治疗的人ES细胞工程示意图细胞工程示意图基本策略基本策略1 1基本策略基本策略2 2欲接受细胞治疗患者的欲接受细胞治疗患者的

36、体细胞核体细胞核导入导入去核卵细胞去核卵细胞体外发育体外发育 胚泡期胚泡期专用专用ES细胞细胞 特化细胞特化细胞分分离离培培养养体外诱导分化体外诱导分化 回回输输细胞治疗的临床应用前景细胞治疗的临床应用前景l神经系统疾病神经系统疾病l骨和软骨疾病骨和软骨疾病l血液病血液病l肝病肝病l神经系统疾病神经系统疾病 根据小鼠根据小鼠ES/EGES/EG细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种细胞研究资料，由于各种类型神经细胞因某种原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起原因死亡而成熟神经细胞又不能分裂、补充和替代死亡细胞引起的神经系统疾病如的神经系统疾病如ParkinsonParkin

37、sons s疾病，疾病，AlzheimerAlzheimers s病、多发性病、多发性硬化症等，有望通过人硬化症等，有望通过人ES/EGES/EG细胞进行细胞治疗。细胞进行细胞治疗。新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠新近，产生多巴胺的神经细胞已能从小鼠ESES细胞衍生而来，细胞衍生而来，为细胞治疗为细胞治疗ParkinsonParkinsons s病的病的ESES细胞来源问题提供实验依据。细胞来源问题提供实验依据。l骨和软骨疾病骨和软骨疾病ES/EGES/EG细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入细胞可能在体外被诱导为骨和软骨，这些细胞被导入骨关节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折、

38、手术而引起骨关节炎患者的关节软骨损伤区域，或因骨折、手术而引起的较大骨隙中，这类从的较大骨隙中，这类从ESES细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植细胞衍生的骨和软骨细胞在被移植部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。部位自我修复的优点远远超过现行的组织移植。l血液病血液病ESES和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有和造血干细胞研究有助于产生供细胞移植用的、不含有 镰刀状血球突变的血细胞。镰刀状血球突变的血细胞。l肝病肝病利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。利用肝干细胞移植治疗肝病取得了重要进展。组织工程的种子细胞来源组织工程的种子细胞来源 人体人体ESES细胞技术学的发生和发展，有

39、望解决细胞技术学的发生和发展，有望解决目前组织或器官修复中的难题。目前组织或器官修复中的难题。l 设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织设想是选择与人体细胞兼容性较好的生物材料，按缺损组织或器官的要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使或器官的要求设计制成模型或支架放在体外培养系统中，使ESES细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，细胞或其定向诱导分化细胞沿着模型或支架不断地生长扩增，构建成新的组织或器官。但构建成新的组织或器官。但ESES细胞定向分化和构成组织和器官细胞定向分化和构成组织和器官中细胞类型的复杂性等诸多问题尚待解决；中细胞类型的复杂性等诸多问题

40、尚待解决；l 目前工作是着重于从成年或幼年器官和组织的碎片中分离、目前工作是着重于从成年或幼年器官和组织的碎片中分离、培养和扩增某一类型的组织干细胞，经过体外培养扩增有可能培养和扩增某一类型的组织干细胞，经过体外培养扩增有可能作为组织工程的种子细胞来源。例如，从骨髓分离和扩增间质作为组织工程的种子细胞来源。例如，从骨髓分离和扩增间质干细胞干细胞(mesenchymalmesenchymal stem stem cell,MSCcell,MSC)，用作骨折愈合、肌腱，用作骨折愈合、肌腱韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程的种子细胞。韧带修复、肌肉再生和造血重建等组织工程的种子细胞。六、六、ES

41、ES细胞研究面临的问题和研究趋势细胞研究面临的问题和研究趋势-如何解决用于人类胚胎干细胞研究的胚胎来源问题？如何解决用于人类胚胎干细胞研究的胚胎来源问题？-如何分离、纯化干细胞？如何分离、纯化干细胞？-如何保持体外培养胚胎干细胞的全能性，并控制定向诱导分化？如何保持体外培养胚胎干细胞的全能性，并控制定向诱导分化？-如何使如何使ESES细胞诱导分化产生的分化细胞永生化？细胞诱导分化产生的分化细胞永生化？-分化后的细胞是否有致瘤性？分化后的细胞是否有致瘤性？-如何使干细胞在体外发育成完整的器官？如何使干细胞在体外发育成完整的器官？-如何克服分化细胞移植后仍有可能发生的免疫排斥？如何克服分化细胞移植

42、后仍有可能发生的免疫排斥？-有关伦理道德和法律以及商业应用等问题有关伦理道德和法律以及商业应用等问题-改善改善ESES细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得细胞的体外培养条件，建立更有效、更简便的获得 ESES细胞的方法；细胞的方法；-定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病治疗并解决定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病治疗并解决 免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题；免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题；-成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较：成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较：成体干细胞能否替代胚胎干细胞？成体干细胞能否替代胚胎干细胞？嵌合体一词的英文是嵌合体一词的英文

43、是chimerachimera，源于希腊神话，是指狮子头、，源于希腊神话，是指狮子头、山羊身和蛇尾的雌性怪物。有关嵌合体神话在各国文化中都有山羊身和蛇尾的雌性怪物。有关嵌合体神话在各国文化中都有嵌合体的科学概念则是，任何由两个或两个以上遗传上不同嵌合体的科学概念则是，任何由两个或两个以上遗传上不同的组织构成的机体。它可以是任何不同物种的混合，但目前的组织构成的机体。它可以是任何不同物种的混合，但目前较关注的是动物与人的嵌合体。较关注的是动物与人的嵌合体。嵌合体与杂合体（嵌合体与杂合体（hybridhybrid）不同。杂合体是）不同。杂合体是由来自不同物种的两个配子形成一个合子。由来自不同物种的

44、两个配子形成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一合子。最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植入最近美国政府封杀了斯坦福大学的一项向小鼠大脑植入人类神经干细胞的研究，引起了国际学界和公众的关注。这人类神经干细胞的研究，引起了国际学界和公众的关注。这项研究是当前干细胞研究前沿的一个重要方面，涉及到一个项研究是当前干细胞研究前沿的一个重要方面，涉及到一个机体拥有两种不同物种的细胞或组织，这种嵌合体研究引起机体拥有两种不同物种的细胞或组织，这种嵌合体研究引起许多新颖的伦理问题，激发了对这类研究应该采取什么行动许多新颖的伦理问题，激发了对这类研究应该采取什

45、么行动的伦理争论。的伦理争论。第一是为了建立动物模型第一是为了建立动物模型。例如世界上首次克隆牛的华裔美籍科学家杨向中创造了兔子的例如世界上首次克隆牛的华裔美籍科学家杨向中创造了兔子的人类心脏病模型，可以表达人类引致心脏病的基因；而原来用大鼠人类心脏病模型，可以表达人类引致心脏病的基因；而原来用大鼠建立的模型不能表达人的基因，用大鼠模型试验的药物对人体无用建立的模型不能表达人的基因，用大鼠模型试验的药物对人体无用为什么要创建嵌合体呢？为什么要创建嵌合体呢？干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组织？干细胞移植到病人体内后如何行为？它们如何分化、移动和形成新组织？在人身上试验

46、不道德，应首先在动物身上研究。将人类干细胞注射入动物在人身上试验不道德，应首先在动物身上研究。将人类干细胞注射入动物体内，引起两方面的问题：体内，引起两方面的问题：一是在生殖方面，如果将人胚胎干细胞注射入动物胎儿，尤其在很早一是在生殖方面，如果将人胚胎干细胞注射入动物胎儿，尤其在很早期，它们很可能移动到发育机体的生殖系产生人类的精子和卵。如果这两期，它们很可能移动到发育机体的生殖系产生人类的精子和卵。如果这两个嵌合体交配，一个人类精子使一个人类卵受精，结果在一个动物子宫生个嵌合体交配，一个人类精子使一个人类卵受精，结果在一个动物子宫生长出一个人类胚胎。如果这种动物（例如嵌合体小鼠）产生的人类精

47、子和长出一个人类胚胎。如果这种动物（例如嵌合体小鼠）产生的人类精子和卵，用体外受精方法产生一个孩子，他或她的父母是一对小鼠？这对孩子卵，用体外受精方法产生一个孩子，他或她的父母是一对小鼠？这对孩子将是非常尴尬的。将是非常尴尬的。二是在脑方面。如果二是在脑方面。如果WeissmanWeissman设想的有设想的有100%100%人类神经细胞的小鼠有一人类神经细胞的小鼠有一天站起来说：天站起来说：“嗨，我是米老鼠！嗨，我是米老鼠！”那时我们对它该怎么办？这种可能似那时我们对它该怎么办？这种可能似乎不大。理由是意识肯定不发生在细胞层次，鼠脑又不到人脑大小的千分乎不大。理由是意识肯定不发生在细胞层次，

48、鼠脑又不到人脑大小的千分之一。但如果将人类干细胞注射入黑猩猩胚胎内，拥有之一。但如果将人类干细胞注射入黑猩猩胚胎内，拥有 100%100%人类神经细人类神经细胞的黑猩猩是否会发育生长出具有某种人性的功能，就很难说了。胞的黑猩猩是否会发育生长出具有某种人性的功能，就很难说了。第二是为了进行干细胞研究第二是为了进行干细胞研究。人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层 消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰 内细胞群内细胞群 中胚层中胚层 结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层 体表结构；神经系统体表结构；神经系统