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1、第 30 卷第 3 期2010 年 3 月环境科学学报Acta Scientiae CircumstantiaeVol.30，No.3Mar.，2010作者简介:李娜(1986)女，E-mail:278290483 ;*通讯作者(责任作者)，E-mail:btyzhang Biography:LI Na(1986)，female，E-mail:278290483 ;*Corresponding author，E-mail:btyzhang 李娜，林晓珊，张毅.2010.PCR-DGGE 技术分析倒置 A2/O 工艺处理染织废水中的微生物区系 J.环境科学学报，30(3):490 496Li N
2、，Lin X S，Zhang Y.2010.Microbial community structure analysis in activated sludge of dyeing-weaving wastewater treated with anoxic-anaerobic-aerobic process by PCR-DGGE J.Acta Scientiae Circumstantiae，30(3):490 496PCR-DGGE 技术分析倒置 A2/O 工艺处理染织废水中的微生物区系李娜，林晓珊，张毅*华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006收稿日期:2009-06-25修
3、回日期:2009-10-26录用日期:2009-12-31摘要:基于 16S rDNA 的 PCR-DGGE(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis)技术研究了倒置 A2/O(anoxic-anaerobic-aerobic)工艺处理染织废水过程中的微生物群落结构.从兼氧、厌氧和好氧区共取 6 个不同处理阶段的样品，测量了不同处理阶段样品的 COD、pH、NH+4-N、H2S、总磷(TP)、污泥含量(TS)、色度及其脱除率，并分析了这些指标的变化规律.结果显示，COD 在处理后期降到了145 mg L1
4、，NH+4-N 的脱除率可达到 85%，硫化氢的去除率达到了 90%以上，磷的脱除率可达 80%以上，TS 处于逐渐升高的趋势，色度的脱除率达到65%.DGGE 图谱显示，好氧处理阶段的微生物多样性明显比兼氧处理和厌氧处理的阶段的要丰富.关键词:倒置 A2/O;染织废水;活性污泥;PCR-DGGE;微生物区系文章编号:0253-2468(2010)03-490-07中图分类号:X703文献标识码:AMicrobial community structure analysis in activated sludge of dyeing-weavingwastewater treated with
5、 anoxic-anaerobic-aerobic process by PCR-DGGELI Na，LIN Xiaoshan，ZHANG Yi*College of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006Received 25 June 2009;received in revised form 26 October 2009;accepted 31 December 2009Abstract:The microbial community structure in
6、 activated sludge of dyeing-weaving wastewater，treated by an anoxic-anaerobic-aerobic process，wasstudied by nested polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)based on 16S rDNA sequences.Activated sludgesamples were collected from anoxic、anaerobic and aerobic condition
7、s at 6 different treatment periods and COD、pH、NH+4-N、H2S、TP、TS(tatal solids)、color and their removal rates at different times were monitored.The results showed that the value of COD decreased to 145 mgL1;the removalefficiencies of NH+4-N，H2S and P were above 85%，90%and 80%respectively;while TS basic
8、ally increased and the color removal rate was about65%.The DGGE map showed that the microbial community was more abundant in the aerobic treatment periods than in the anaerobic and anoxictreatment periods.Keywords:inverted A2/O;dyeing-weaving wastewater;activated sludge;PCR-DGGE;microbial community1
9、引言(Introduction)目前，废水的处理多采用生物方法.生物处理废水工艺中微生物群落结构多样性的分析对研究生化反应机理、污染物降解和转化途径具有非常重要的意义，而活性污泥是污水生物处理系统的功能主体.因此，对活性污泥微生态进行研究，对实现系统运行的科学调控、提高废水处理效果具有十分重要的价值.PCR-DGGE 技术主要用来分析各种样品中微生物的多态性及优势菌群，且自从 Muzyer 等(1993)首次将 PCR-DGGE 应用于微生物生态学研究，并证实这种技术在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性，PCR-DGGE 技术在研究生物群落结构变化方面的应用越来越广泛
10、(Pepe et al.，2003;Guerrini et al.，2003).近年来，PCR-DGGE 技术也逐渐被用来分析活性污泥中微生物多样性(David et al.，2003;Timothy et al.，2002;Dar et al.，2005;刘新春等，2005).纺织印染废水含染料较多，生化性能较差，处理难度较大，染料等有机组分在好氧条件下很难被破坏，但可以在厌氧条件下被水解酸化，分解为较3 期李娜等:PCR-DGGE 技术分析倒置 A2/O 工艺处理染织废水中的微生物区系易被好氧微生物分解的小分子物质.而传统污水处理厂多采用 A2/O(厌氧-缺氧-好氧)工艺，整个流程复杂且改
11、造难度较大.倒置 A2/O(兼氧-厌氧-好氧)工艺，即废水先经过缺氧池的缺氧处理，然后进入厌氧池进行厌氧处理，最后在好氧池进行好氧处理.相较而言，倒置 A2/O 工艺仅要求污泥回流，不需设硝化液内回流，非常适合传统污水处理厂的脱氮除磷(张国昌等，2006)，且处理效果明显好于传统的 A2/O 工艺.之前虽有对 A2/O 工艺中污泥样品的微生物种群结构的研究(马美玲等，2008)，但有关倒置 A2/O 工艺中微生物群落结构变化规律的研究还几乎未见报道.因此，本文在前期研究的基础上利用 PCR-DGGE 技术研究倒置 A2/O 工艺不同运行阶段的微生物种群结构和 COD、pH、NH+4-N、H2S
12、、TP、TS、色度等参数的数值变化，以期为全面了解倒置 A2/O 工艺中生物降解特性及进一步对微生物进行过程控制提供参考.2材料和方法(Materials and methods)2.1材料来源与预处理活性污泥的材料取自江门市某染织废水处理厂，处理工艺采用倒置 A2/O 工艺.污泥样品分别取自处理工艺中的缺氧区(2 个处理阶段，总处理时间分别为 12 和 24h)、厌氧区(1 个处理阶段，总处理时间为 40h)和好氧区(3 个处理阶段，总处理时间分别为 54、68 和 82h)的 6 个不同处理阶段.在下面的研究中将这 6 个阶段的样品分别简称为:兼氧12h、兼氧 24h、厌氧 40h、好氧
13、54h、好氧 68h 和好氧82h，样品于 4冰箱保存备用.实验测定 6 个不同阶段样品的 COD、pH、NH+4-N、TP、TS、H2S、色度等数据，并与未经处理的废水指标对比，进行不同阶段间的比较分析.色度的测定采用稀释倍数法，以光学纯水为标准.2.2DNA 的提取与纯化参考 CTAB-蛋白酶 K 方法(刘有胜等 2007)并略作改动后进行 DNA 提取，其中，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇混合液(体积比为 25241)抽提两次，用异丙醇抽提得到粗提 DNA，然后去除大量的腐殖质等 PCR 抑 制 剂 成 分，对 粗 提 DNA 进 行 纯 化(Moreira，1998).质量分数 1%琼脂糖
14、凝胶电泳粗提DNA 产物和纯化后的 DNA 产物.2.3PCR 扩增采用嵌套式 PCR，第一套引物为细菌 16SrDNA的通用引物(Shan et al.，2008):8f(AGA GTT TGATCC TGG CTC AG)和 1406r(ACG GGC GGT GTGTAC AAG)，50L 的 PCR 体 系:引 物 0.5L(25pmol L1)，dNTP 4L，PCR buffer 5L，纯化后DNA 模板 1L，Taq 酶 0.25L，无菌水补到 50L.Touchdown PCR 操作参数为:95预变性5min;95变性 1min，65 退火 1min，之后每个循环降低0.5，共
15、 20 个循环，72延伸 1min;然后再以 95变性 1min，55 退火 1min，72 延伸 1min 进行 10个循环;最后 72伸长 8min.第二套扩增引物是 16SrDNA 的 V3 区通用引物(邢德峰等，2006):GC341f(CGC CCG CCG CGCCCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCCGCCT)和518r(ATT ACC GCG GCT GCT GG)，50L的 PCR 体系:引物 0.5L(25pmolL1)，dNTP4L，PCR buffer 5L，第一套 PCR 产物 1L，Taq 酶0.25L，无菌水补到 50L.Touchd
16、own PCR 操作参数为:95 预变性 5min;95 变性 1min，65 退火45s，之后每个循环降低 0.5，共 20 个循环，72延伸1min;然后再以95变性1min，55退火45s，72延伸1min 进行10 个循环;最后72伸长8min.2.4DGGE 及相似性(CS)分析采 用 BIO-RAD 公 司 的 The Dcode UniversalMutation Detection System 对 PCR 产物进行分离.根据 PCR 产物的大小选择10%的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度范围为 30%70%，其中，变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增.电泳 6 个不同处理阶段样品的
17、16SrDNA 的 V3 区产物，除了兼氧 12h 阶段的样品加了1 个进样孔外，其他 5 个阶段的样品(兼氧24h、厌氧 40h、好氧 54h、好氧 68h 和好氧 82h)都做了 1 个平行.电泳条件:60、100 V 运行 9h，染色选择银染，固定液(100mL 无水乙醇、5mL 冰醋酸、895mL 蒸馏水)固定8min，染色液(固定液加 AgNO3，质量分数为 2%)染色 18min，显影液(30%NaOH50mL，0.75%四硼酸钠 5mL，甲醛 3.75mL，蒸馏水定容到500mL)中振荡显影一直到背景呈深茶色，条带呈黑色为止.用 BIO-RAD 凝胶成像系统拍照观察，所得图像用
18、BIO-RAD 的 Quantity One 软件进行分析.为了解种群在倒置 A2/O 处理工艺中的动态变化，对 DGGE 条带图谱进行统计分析，着重讨论各时刻细菌种群的丰富度和相似性.不同时刻样品的细菌种群丰富度值，即 Ri=Li/LT，其中，Ri为第 i 泳道的细菌种群丰富度值;Li为第 i 泳道上的条带数;194环境科学学报30 卷LT为图谱中的总条带数(同一位置的条带只算 1条).通过比较相似性系数(Cs)来分析倒置 A2/O 处理工艺不同阶段 DGGE 图谱的相似性，类似的研究也有很多(Gillan et al.，1998;Murray，1996;傅以钢等，2005)，一般 Cs值变
19、化范围为 0 100%，其计算公式如下所示:Cs=2 j/(a+b)100%(1)式中，a、b 分别代表两个不同处理阶段样品中DGGE 图谱中各自的条带数目，j 为这两个处理阶段样品中共有的条带数目.3结果(Results)3.1不同阶段样品各指标的变化规律原废水中 COD 为 687 mgL1，氨氮为 110.11mgL1，TP 为 10.979 mgL1，H2S 为 23.791mg L1.经过处理的 6 个阶段的 COD、氨氮、TP、H2S、pH、TS、色度及其脱色率的数值变化趋势如图1 所示.从图 1a 可以看出，COD 呈明显的下降趋势，兼氧处理 12h 时 COD 为 587 mg
20、L1，到好氧处理82h 时降到了145 mg L1;NH+4-N 在好氧82h 时降到了 13.875 mg L1，在厌氧阶段氨氮降解的最快;该工艺的脱硫、脱磷效果也较好，染织废水中磷和H2S 的含量本来就不是很高，经过处理后可分别降到 2.783 mg L1和 1.326 mg L1.原废水的 pH 为7.87，从处理过程中 pH、TS 的变化曲线(图 1b)可看出，兼氧 12h 时 pH=8.74，经过厌氧处理后降到7.47，刚开始进入好氧处理时 pH 升高到 7.93，经过好氧处理 pH 基本稳定在 7.68 左右;TS(污泥含量)随着处理的进行逐渐升高，到好氧处理 82h 时升到了22
21、.479%，相应地污泥的含水量下降，从而大大减少了污泥处理的成本.原废水的色度为358 倍，兼氧12h时色度降到334 倍，从兼氧 24h 到厌氧 40h 时色度下降了58 倍，是整个处理过程中下降最快的阶段，好氧处理3 个阶段色度下降的幅度比较平均(图1c).图 1不同阶段样品各指标的变化规律Fig.1Variation of samples in different periods of each index3.2DNA 提取及其纯化6 个不同处理阶段污泥样品细菌基因组粗提结果和用 Moreira 方法纯化得到的 DNA 电泳图片如图2 所示.由图2a可知，粗提DNA基因组的大小在图 2污
22、泥样品的 DNA 粗提与纯化结果(a.粗提，b.纯化，M:DNA/Hind)Fig.2Crude extracted and purified DNA of activated sludge samples(a.crude extract，b.purified，M:DNA/Hind)2943 期李娜等:PCR-DGGE 技术分析倒置 A2/O 工艺处理染织废水中的微生物区系23kb 左右，但拖尾比较严重，含有的杂质太多，浓度和纯度都不高.纯化后得到的细菌基因组 DNA 条带亮度和纯度明显提高，除了样品 6(好氧 82h)前面有较明显的拖尾外，其他样品拖尾很轻，表明纯化结果较成功(图 2b).3
23、.3PCR 扩增6 个不同处理阶段污泥样品细菌 DNA 的16SrDNA 扩增结果和 16SrDNA 的 V3 区扩增结果如图 3.从图 3 中可以看出，扩增结果得到了纯度和浓度比较高的目的片段，16SrDNA 扩增片段大小在1400bp 左右，V3 区扩增产物略小于 250bp.图 3PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳图谱(a.16SrDNA，b.V3 区，M:Marker DL2000)Fig.3PCR products after agarose gel electrophoresis(a.16S rDNA，b.Region V3，M:Marker DL2000)图 4不同处理阶段污泥样品的
24、DGGE 图谱Fig.4DGGE pattern of different sludge samples3.4DGGE 图谱及 CS 分析6 个不同处理阶段样品 DNA 的 16SrDNA 的 V3区扩增产物 DGGE 电泳结果如图 4 所示.由图 4 可知，6 个阶段的微生物菌群都很丰富，共检测到 45条不同的条带，并且后 5 个处理阶段样品 2 个平行样的条带基本上是一一对应的，说明 DGGE 的重现性很高.软件进行分析时只选择其中一个平行样进行分析，即选择第 1、3、5、7、9、11 这 6 个泳道为代表，其对应 DGGE 图谱中标记的 L1(兼氧 12h)、L3(兼氧24h)、L5(厌
25、氧40h)、L7(好氧54h)、L9(好氧68h)、L11(好氧 82h).用 Quantity One 软件对这 6个条带进行分析，得到了以 L1 为标准的 DGGE 条图 5DGGE 图谱的条带分布和强度示意图(1.L1;2.L3;3.L5;4.L7;5.L9;6.L11)Fig.5Map of band distribution and relative luminance of theDGGE map(1.L1;2.L3;3.L5;4.L7;5.L9;6.L11)带强度示意图(图 5)，图下侧百分数表示以 L1 为标准，其他几个条带与 L1 的相似性.由图5 可知，泳道394环境科学学
26、报30 卷中条带粗细不一，对应其在 DGGE 胶上的密度大小不同，密度大则条带比较粗黑;密度小则条带比较细;电泳条带越多，说明细菌种群越多(Muyzer，1998b);条带信号越强，表示该条带代表的相应细菌数量越多.从图 5 还可以看出，兼氧处理 12h 时有29 条带，兼氧处理 24h 时有 28 条带，厌氧处理 40h时有 24 条带，好氧处理 54h 时有 32 条带，好氧处理68h 时有 43 条带，好氧处理 82h 时有 39 条带.每个阶段的微生物丰富度见表 1.由表 1 可知，好氧处理中间阶段微生物最丰富，厌氧阶段相对不丰富.表 1倒置 A2/O 各阶段细菌群落丰富度值(R)Ta
27、ble 1Richness value(R)of bacterial community in inverted A2/Oin different periods处理阶段条带数RL1290.644L3280.622L5240.533L7320.711L9430.956L11390.867DGGE 图谱各样品间的相似性如表 2 所示，整体上看，各样品间的相似性都不是很高，只有兼氧24h(L3)和厌氧 40h(L5)两个样品的相似性达到了80.2%，其它样品都低于 70%.根据 DGGE 图谱(图4)用 complete linkage 算法对 6 个电泳样品泳道图谱进行细菌群落相似性程度聚类分析
28、，结果如图 6所示.由图 6 可知，兼氧 24h(L3)和厌氧 40h(L5)两个阶段的微生物群落相似性最高，与相似矩阵(表2)中的结果一样，可能是因为这两个阶段都没有大的阶段性变化，有大量相同的菌群在发挥作用.图 6不同处理阶段污泥样品中的细菌群落相似性聚类分析Fig.6Tree representing the genetic similarity of the bacterialcommunity in different sludge samples表 2倒置 A2/O 各阶段细菌种群相似系数(Cs)Table 2Comparability index of bacterial pop
29、ulation in inverted A2/0 indifferent periodsL1L3L5L7L9L11L1100.0%66.4%69.4%48.0%48.7%46.1%L366.4%100.0%80.2%39.4%45.4%39.1%L569.4%80.2%100.0%41.3%45.5%37.7%L748.0%39.4%41.3%100.0%55.9%55.5%L948.7%45.4%45.5%55.9%100.0%67.7%L1146.1%39.1%37.7%55.5%67.7%100.0%4讨论(Discussion)4.1倒置 A2/O 工艺效果分析由图 1 可知，在倒置
30、A2/O 工艺处理染织废水过程中，处理后期(好氧处理 82h)COD 降到了 145mg L1，其中，厌氧 40h 到好氧 54h 阶段 COD 降低比较缓慢，可能是因为该处理阶段由兼氧到厌氧的转变使污泥中微生物种群也发生了较大的变化;好氧处理 54h 到好氧 68h 阶段 COD 降低的最快，说明该阶段有大量去除有机物的优势菌群存在，并且可能是好氧菌群.氨氮经过厌氧处理由兼氧 24h 时的75.77 mg L1降为厌氧 40h 的 47.901 mgL1，是整个处理过程中降低最快的，说明厌氧处理阶段存在大量降解氨氮的优势菌群，经过整个处理过程氨氮脱除率达到了 85%以上.同时，H2S 的脱除
31、率达到了 90%以上.从图 1 还可知，降解 H2S 的优势菌群大量存在于兼氧处理 24h 阶段.磷的去除率达到80%以上，好氧处理 54h 阶段 TP 数值降低幅度较大，该阶段应该存在大量降解磷的优势菌群;TS 一直呈上升趋势，厌氧处理阶段 TS 升高幅度最大，相对应的含水量在该阶段降低的最快，该阶段菌群的共同脱水作用效果优于其他几个阶段.pH 的变化幅度不大，随着处理时间的延长，pH 稳定在 7.68 附近，处理染织废水污泥中的微生物菌群适合的 pH在 7.5 9.0 之间.从色度及其脱除率的变化曲线可知，色度呈逐渐下降的趋势，并且在厌氧处理阶段下降幅度最大，主要是因为厌氧条件的水解作用降
32、解了较多的染料，整个处理过程色度的脱除率可达65%.由此可见，倒置 A2/O 处理工艺具有很好的降解 COD、脱氮、脱磷和脱硫化氢效果，即缺氧、厌氧、好氧 3 种不同的环境条件和不同种属微生物菌群的有机配合，同时具有去除有机物并脱氮除磷的功能(Diez et al.，2001).4943 期李娜等:PCR-DGGE 技术分析倒置 A2/O 工艺处理染织废水中的微生物区系4.2DGGE 图谱和 Cs值分析从 DGGE 图谱(图 4)以及不同阶段微生物群落丰富度值(表 1)可以看出，整个处理过程中，微生物群落结构较为丰富，在好氧处理中间阶段(68h)微生物群落最丰富，丰富度值达到了 0.956，厌
33、氧处理阶段微生物群落结构相对不丰富.在微生物群落结构的演替过程中，各个群落都存在特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征种属.同时，从兼氧处理到好氧处理过程中 6 个不同处理阶段也存在共同带，即一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥作用，是一些生态幅比较广泛的种属.从相似矩阵(表 2)以及聚类分析图谱 6 可知，厌氧处理 40h阶段的微生物群落和其前面兼氧处理 24h 阶段的微生物群落相似性比较高，达到了 80.2%，可能是由于这两个阶段的处理方法由兼氧到厌氧没有发生明显的变化，使里面的微生物菌群大部分相同，尽管也有新的菌种出现并发挥作用;好氧处理的后
34、 2个阶段(68h 和 82h)，微生物群落相似性也比较高，可达 67.7%;其余阶段的微生物相似性较低，其中，厌氧处理阶段和好氧处理阶段中的微生物群落相似性都很低.在从兼氧到好氧处理整个处理过程中，不相邻的阶段由于处理方式发生了较大的变化，使得菌群结构演替比较明显，因此，不相邻处理阶段中微生物群落相似性比较低.5结论(Conclusions)1)倒置 A2/O 处理工艺氨氮脱除率达到了85%以上，H2S 的脱除率达到了 90%以上，磷的去除率达到 80%以上，说明倒置 A2/O 处理工艺具有较好的脱氮、脱磷和脱硫效果;处理工艺前后 TS 上升了17.6%，到处理后期升到了 22.479%;C
35、OD 最终降低为 145 mg L1;色度在处理后期降到了 124 倍，色度脱除率达到了 65%;整个处理过程中 pH 则在9 7 之间变化，最后稳定在 7.68 左右.2)DGGE 图谱和微生物群落丰富度结果显示，工艺运行不同时期的微生物种群都很丰富，好氧处理中间阶段微生物种群最丰富，厌氧处理时微生物种群的丰富度相对较低.倒置 A2/O 工艺中不同区域都有一些各自的特征条带，也有较多电泳位置相同的条带，从相似矩阵表以及聚类分析图谱可知，在连续处理阶段中，邻近处理阶段的微生物菌群相似性相对较高，其它阶段的微生物相似性较低，尤其是厌氧处理阶段和好氧处理阶段中微生物种群相似性普遍偏低.责任作者简介
36、:张毅(1964)，男，副教授，硕士生导师.主要研究方向为生物制药和基因工程.E-mail:.参考文献(References):Dar S A，Kuenen J G，Muyzer G.2005.Nested PCR-denaturinggradient gel electrophoresis approach to determine the diversity ofsulfate-reducing bacteria in complex microbial communities J.Appl Environ Microbiol，71:23252330Diez B，Pedros A，Mars
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