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1、中国组织工程研究 第16卷 第16期 20120415出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 15,2012 Vol.16,No.16 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN:ZLKHAH 2889 1Department of Orthopedics,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;2Central Obstetrics and Gynecology Hospital of Tianjin,Tia
2、njin 300025,China;3Institute of Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300052,China;4School of Precision Instrument and Opto-electronics Engineering,5School of Chemical Engineering and Technology,6School of Materials Science and Engineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China Guo
3、 Hong-gang,Doctor,Associate professor,Masters supervisor,Department of Orthopedics,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China Supported by:National Natural Science Foundation of China,No.81041061*;Technology Foundation of Tianjin Education Commission,No.20090125*Received:2011-0
4、9-06 Accepted:2011-10-29 新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性*郭洪刚1，刘 静2，李峰坦1，杨少光3，陈 治4，姚芳莲5，代凤英6，刘文广6 Biocompatibility of new nano-structured biomimetic bone matrix co-cultured with goat adipose derived stromal cells Guo Hong-gang1,Liu Jing2,Li Feng-tan1,Yang Shao-guang3,Chen Zhi4,Yao Fang-lian5,Dai Feng-yi
5、ng6,Liu Wen-guang6 Abstract BACKGROUND:Development of a bone tissue scaffold using biomimetic strategy has become the key link in development of biological substitutes currently.Imitation of natural bone composition and structure is important in development of bone matrix using biomimetic strategy.O
6、BJECTIVE:To analyze the biocompatibility of nano-scaled-tricalcium phosphate/chitosan/polycaprolactone(n-TCP-CS-PCL)and to evaluate its biological safety.METHODS:Nanostructured bionic bone matrix was developed based on three-dimensional image reconstruction.Goat adipose derived stromal cells were is
7、olated and co-cultured for osteogenic induction.The experimental group:n-TCP-CS-PCL+gel+recombinant human bone morphogenetic protein-2+adipose derived stromal cells.The control group:gel+recombinant human bone morphogenetic protein-2+adipose derived stromal cells.RESULTS AND CONCLUSION:Cells grew we
8、ll with abundant extracellular matrix in the experimental group.The cell proliferation activity,alkaline phosphatase level and osteocalcin level were increased in the experimental group compared with the control group(P 0.05).New bone was gradually mature and there was no inflammatory response in th
9、e experimental group.The n-TCP-CS-PCL can be used as an ideal scaffold of bone tissue engineering for its good biocompatibility.Guo HG,Liu J,Li FT,Yang SG,Chen Z,Yao FL,Dai FY,Liu WG.Biocompatibility of new nano-structured biomimetic bone matrix co-cultured with goat adipose derived stromal cells.Zh
10、ongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu.2012;16(16):2889-2892.http:/ http:/ 摘要 背景：仿生策略研制骨组织生物支架已成为当今研发生物替代品的关键环节，如何模仿天然骨的成分和结构特征以适应细胞生长是仿生研制骨基质的重要内容。目的：观察纳米级-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯(n-TCP-CS-PCL)的细胞及组织相容性，评估其生物安全性。方法：基于三维图像重建辅助研制纳米化仿生骨基质，羊自体脂肪基质细胞分离和成骨诱导培养，进行复合培养：实验组：n-TCP-CS-PCL+凝胶+重组人骨形态发生蛋白 2+脂肪基质细胞；对照组：凝胶+重组人骨形态发生蛋
11、白 2+脂肪基质细胞。结果与结论：实验组细胞生长旺盛、细胞外基质丰富，细胞增殖活力、碱性磷酸酶及骨钙素水平均高于对照组(P 0.05)，新骨发育趋于成熟，未见炎性反应。提示纳米级 n-TCP-CS-PCL 具备良好的生物相容性，是一种理想的骨组织工程支架。关键词：仿生骨基质；脂肪基质细胞；生物相容性；-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯；纳米级 缩略语注释：ADSCs：adipose-derived stem cells，脂肪基质细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.16.009 郭洪刚，刘静，李峰坦，杨少光，陈治，姚芳莲，代凤英，刘文广.新型纳米化仿生骨基质与羊脂
12、肪基质细胞复合培养的生物相容性J.中国组织工程研究，2012，16(16):2889-2892.http:/www.crter.org http:/ 0 引言 支架的生物相容性评价主要体现在两方面，一是评估支架的细胞相容性，即采用体外方法，观察细胞在支架的生长及凋亡等情况；二是通过体内方法研究支架的组织相容性，即观察支架是否产生排斥反应、新骨与材料界面间结合等现象。只有通过体内与体外方法相结合，旨在分析支架的细胞及组织相容性基础上，才能准确地评估骨研发品的生物相容性及安全性。1 材料和方法 设计：观察性实验。时间及地点：实验于2010-10/2011-08分别在天津医科大学、天津大学及中国医学
13、科学院血液病研究所完成。材料：成年雄性安哥拉山羊，体质量平均35.5 kg，由天津市实验动物中心提供。主要试剂及仪器：试剂及仪器 来源 重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)、Celltiter96 Aqueous One Solution 试剂盒 碱性磷酸酶试剂盒、荧光素 二乙酸酯、碘化丙啶 Osteocalcin EIA 试剂盒 CO2细胞培养箱 精密螺旋三维 CT 系统 Promega Sigma Biomed Diagnostics Forma 美国 GE Lightspeed16 郭洪刚，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性 P.O.Box 1200,She
14、nyang 110004 2890 www.CRTER.org 1天津医科大学总医院骨科，天津市 300052；2天津市中心妇产科医院，天津市 300052；3中国医学科学研究院血液病研究所，天津市 300052；天津大学，4精密学院，5化工学院，6材料学院，天津市 300072 郭洪刚，男，1969 年生，河北省武安市人，汉族，2002 年解放军军医进修学院、解放军总医院，博士后，副教授，硕士生导师，主要从事脊柱外科与组织工程学的研究。 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225(2012)16-02889-04 收稿日期：2011-09-06 修回日期：2011-1
15、0-29(20110906018/WL L)实验方法：羊自体脂肪基质细胞分离和培养：取羊腹部脂肪组织，胶原酶消化，红细胞裂解液重悬 10 min，离心15 min，DMEM培养基重悬，培养基含体积分数为10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素、100 g/L链霉素。细胞种植密度约8 000个/cm2，24 h后换培养液，融合时传代。取第4代细胞，对常规诱导培养基加入20 g/L rhBMP-2，含体积分数为10%胎牛血清的DMEM加入浓度0.1 mol/L地塞米松，50 mol/L抗坏血酸、10 mmol/L-甘油磷酸钠，诱导分化2周，经Von Kossa染色，证
16、实其成骨潜能。新型纳米仿生骨基质制备与处理：基于雄性安哥拉山羊颈3/4区域连续薄层平面CT扫描，经图像分割、三维图像重建，提取其中的图像信息，精确测量横突间区域解剖数据，根据图像数据分析结果，调整支架三维尺寸利用沉淀、共混复合及冷冻干燥法制备出三维多孔纳米级-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯(n-TCP-CS-PCL)复合支架，环氧乙烷消毒，备用。纳米仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养：按前期方法制备富血小板血浆、海藻酸钠、凝血 酶 及 纤 维 蛋 白 原 复 合 物 凝 胶1。n-TCP-CS-PCL支架浸泡凝胶内30 min，吸取100 L、5.01010 L-1的 脂 肪 基 质 细 胞(ad
17、ipose-derived stem cells，ADSCs)至离心管，添加富含500 g rhBMP-2液态凝胶3 mL，吹打混匀，制成生长因子凝胶-细胞复合物，微量移液器滴加到支架内，每块50 L，加2 mL诱导培养基，转到37 培养箱中培养。仿生骨基质生物相容性观察：培养第2，4，6，8，12，14，18，20，22天，扫描电镜观察细胞在材料中黏附情况，共聚焦下荧光素二乙酸酯标记活细胞，呈现绿色，碘化丙啶标记死细胞，呈橘红色，定期在激光共聚焦显微镜下观察细胞在仿生骨基质中的变化与转归；未添加材料的培养板设为空白对照组，按相关试剂盒说明测定细胞增殖、碱性磷酸酶及骨钙素水平；将细胞/仿生骨基
18、质培养复合物与空白支架分别移植至羊右侧及左侧股外侧肌处，定期取材，苏木精-伊红染色观察。主要观察指标：扫描电镜观察细胞在材料中的黏附；激光共聚焦显微镜观察细胞在仿生骨基质中的变化与转归；细胞增殖情况；碱性磷酸酶，骨钙素水平及组织学观察。统计学分析：由第二作者采用SPSS 11.0软件完成统计处理。2 结果 2.1 扫描电镜观察细胞在材料中黏附情况 复合培养2 d可见ADSCs伸出伪足黏附在仿生骨基质表面，第6天细胞形态饱满，细胞伸展呈多角形或扁圆球形锚着于支架柱状结构表面，812 d细胞沿支架柱状结构向支架孔隙迁移；1418 d细胞在支架孔隙及其表面呈现三维、叠层内生长，见图1。2022 d细
19、胞分布均匀、细胞间互相连接紧密，分泌大量细胞外基质，细胞体表面有颗粒状钙盐结晶沉积，见图2。2.2 激光共聚焦显微镜观察细胞在仿生骨基质中的变化与转归 荧光素二乙酸酯标记ADSCs呈现绿色，为存活细胞，碘化丙啶标记ADSCs呈橘红色，为死细胞，24 d未见细胞，第6天仿生骨基质边缘出现死细胞，随后各周期，支架表面、孔隙及柱状结构均见大量GFP Figure 1 Adipose derived stromal cells showed three-dimensional migrated growth from both sides of columnar structure of the sc
20、affold to the center at 18 d of co-culture(Scanning electron microscopy,160)图 1 复合培养第 18天ADSCs 沿支架柱状结 构两侧向中央处三维迁移内生长(扫描电 镜，160)Figure 2 The proliferative cells were closely connected with each other with abundant extracellular matrix and multi-layer block-like structure was formed at 22 d of co-cult
21、ure(Scanning electron microscopy,200)图 2 复合培养第 22天增生细胞间紧密连接，融合成多层团块状结构，细胞基质丰富(扫描电镜，200)郭洪刚，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN:ZLKHAH 2891 www.CRTER.org 标记的活细胞附着，死细胞数量较少，见图3。间接反映出ADSCs整体生长代谢稳定，低凋亡趋势。2.3 细胞增殖情况 细胞接种后，随培养时间的延续，各组细胞活性有所增加，第622天，实验组细胞增殖快于空白对照组，提示实验组以支架为载体的分裂
22、增殖速度较快，差异有显著性意义(F=8.301，t=4.145，P 0.05)，见图4。2.4 各组碱性磷酸酶活性检测 第26天各组细胞碱性磷酸酶表达未见明显差异，第8天至随后培养时间，实验组碱性磷酸酶活性高于对照组，差异有显著性意义(F=5.955，t=1.886，P 0.05)，见图5。2.5 各组骨钙素水平检测 第8天开始，实验组骨钙素水平 较对 照组 高，差 异有 显著 性 意义(F=2.348，t=1.707，P 0.05)，见图6。2.6 体内移植观察 实验组第2天，支架周围有少许淋巴细胞及多核细胞浸润，与周围组织无粘连。第4天至随后阶段，未见明显炎症反应，支架中央部有成骨细胞和微
23、小血管长入，814 d，支架表面形成以软骨内成骨为主的薄层骨痂，820 d，呈现编织骨形式的增生新骨，见图7，第22天，骨小梁排列规则而有序。对照组移植初期，未见炎性反应，814 d，仅支架边缘形成少量软骨样骨质，支架中心区域被大量纤维组织所包裹。3 讨论 仿生策略研制骨组织生物支架已成为当今研发及应用骨生物替代品的关键环节，如何模仿天然骨的成分和结构特征以适应种子细胞生长是仿生研制细胞外骨基质的重要内容1-6。骨的纳米结构主要基本单位是柱状的磷灰石晶体，晶体尺寸在纳米量级7-9。纳米级磷酸三钙和壳聚糖及聚己内酯复合组成接近于天然骨质的无机和有机成分，磷酸三钙具有良好的骨引导活性，其碱性的降解
24、产物能降低壳聚糖或聚己内酯降解所产生的无菌性炎症。聚己内酯的引入能增强整体仿生骨基质的机械性能，壳聚糖具备细胞及成骨生长因子识别的天然位点，利于成骨细胞锚着及黏附。故此，将它们与无机Figure 3 Adipose derived stromal cells effectively expressed green fluorescent protein and few scattered dead cells could be seen at 22 d of culture(Fluorescence microscopy,40)图 3 培养 22 d 有效表达绿色荧光蛋白的 ADSCs 及散存
25、少 量的死细胞(荧光显微镜，40)Figure 4 The cellular proliferative activities of adipose derived stromal cells in each group at different time points of culture 图 4 实验组和对照组培养不同时间细胞增殖情况 Experimental group Control group 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 2 4 6 8 12 14 18 20 22 Time(d)Absorbance Figure 5 Alka
26、line phosphatase(ALP)activities of adipose derived stromal cells in each group at different time points of culture 图 5 实验组和对照组培养不同时间碱性磷酸酶活性表达 Experimental group Control group 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 12 14 18 20 22 Time(d)ALP content(16.67 nkat/L)Figure 6 The osteocalcin levels of ad
27、ipose derived stromal cells in each group at different time points of culture 图 6 实验组和对照组培养不同时间骨钙素表达 Experimental group Control group 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 2 4 6 8 12 14 18 20 22 Time(d)Osteocalcin activity(g/L)Figure 7 Woven bone existed in cartilage of the experimental group at
28、 20 d of implantation(Hematoxylin-eosin staining,20)图 7 实验组移植第 20 天存在软骨内成骨形式的编织骨(苏 木精-伊红染色，20)郭洪刚，等.新型纳米化仿生骨基质与羊脂肪基质细胞复合培养的生物相容性 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 2892 www.CRTER.org 类人工基质复合能得到优化性能的骨组织框架材料。通过对宿主部位CT扫描，结合图像采集、分割及三维重建，获取该区域准确解剖数据，对相邻层匹配轮廓间三维表面进行重构来确定支架形貌，有望提高支架外部轮廓尺寸的精确度，减少制备过程的参数误差，使支架空间三维
29、布局更加合理，利于支架外部形态与宿主受损部位相匹配，做到仿生化。细胞与支架之间的相互作用是研究植入生物材料细胞相容性的重要内容10-11。实验通过以富血小板血浆+海藻酸钠+凝血酶+纤维蛋白原凝胶为承载体系将成骨诱导化ADSCs与n-TCP-CS-PCL支架复合培养，观察纳米仿生骨基质对羊脂肪基质细胞黏附和增殖的影响，以探讨该材料作为ADSCs载体来构建组织工程化研发品的可行性。扫描电镜显示培养初期ADSCs由梭形演变为多角或圆球形、伸展充分、形态良好，以支架柱状结构为支撑伸出伪足，黏附在仿生骨基质表面。第612天，细胞进入快速增殖期，细胞密度高，生长旺盛，细胞间连接紧密，呈三维方式向支架孔隙及
30、中央区域迁移，内生长活跃，并分泌丰富的细胞外基质及少量钙盐沉积。成骨种子细胞的生物学行为是研究植入生物材料细胞相容性的重要内容12-13。共聚焦显微镜也验证了ADSCs通过支架柱状结构向孔隙及中央区域贴壁、铺展、增殖、聚集及依靠伪足互相间交联的生长方式，这说明支架对ADSCs具有较好的亲和力，不仅反映在材料表面结构，也体现在其内部孔隙结构方面，材料表面结构(即柱状结构)为细胞伸出伪足提供了良好锚着的空间位点，开放孔隙结构不仅能引导ADSCs向其中心部位迁移、增殖，也为培养液、氧气及细胞代谢物质提供了交换转运的理化场所，这为移植种子细胞新陈代谢及其与宿主修复细胞间生物信息传递创造了微环境，提示成
31、骨诱导化ADSCs与纳米仿生骨基质具备良好的细胞亲和性和细胞相容性。细胞生长曲线显示第4天实验组细胞的增殖快于单纯细胞对照组，随着培养时间延长，实验组碱性磷酸酶活性、骨钙素水平均有所增高，与对照组相比差异具有显著性意义，说明n-TCP-CS-PCL支架对ADSCs增殖及成骨分化能力均有促进作用，这与支架具备良好的细胞相容性有关。实验还观察到新生骨组织通过长入支架孔隙与材料紧密结合，新生骨组织具备编织骨形态，骨小梁排列有序。尽管出现初期短暂的炎症反应，但整个周期未见明显排斥反应及骨吸收现象，也未发现编织骨向板层骨演变及支架降解这一过程，这与观察周期较短有关，或许是实验设计的不足之处。综上所述，基
32、于数字化影像学技术辅助研制骨生物支架，能降低或避免简单理化制备过程中的工艺误差，提高支架的精确尺度。纳米级n-TCP-CS-PCL具备良好的生物相容性，其三维立体结构及其成分类似于天然骨，作为一种理想的骨组织工程支架，具有潜在的临床应用前景。4 参考文献 1 Quadrani P,Pasini A,Matiolli-belmonte M,et al.High-resolution 3D scaffold model for engineered tissue fabrication using a rapid prototyping technique.Med biol Eng Comput.
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40、differentiation and expansion for clinical application of tissue engineering.J Cell Mol Med.2007;11(5):935-944.来自本文课题的更多信息-基金声明：国家自然基金资助项目(81041061)；天津市教委科技基金资助项目(20090125)。作者贡献：第一作者进行实验设计，实验实施为第一、二、四、六作者，实验评估为第五、七、八作者，资料收集为第三、五作者，第一作者成文，第六作者审校，第一作者对文章负责。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求：实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部 2006年颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准。本文创新性：根据 PubMed收索，目前涉及天然-有机-无机等复合类材料，尤其是纳米级-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯(n-TCP-CS-PCL)复合支架的国外报道较少。实验在材料设计方面，具备先进性。纳米级 n-TCP-CS-PCL 具备良好的生物相容性，其三维立体结构及其成分类似于天然骨，作为一种理想的骨组织工程支架，具有潜在的临床应用前景。