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1、嵌合抗原受体-T 细胞免疫治疗桥接异基因造血干细胞移植患者的免疫重建 异基因造血干细胞移植是治疗血液系统恶性肿瘤的最有效方法之一，但对于难治易复发的 B 急性淋巴细胞白血病（refractory or relapsed B-lineage acute lymphoblastic leukaemia，RR-B-ALL）即使高强度化疗及移植复发率依然很高，随着嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）-T 特异性靶向肿瘤细胞的应用，国内外很多研究共同表明1,2,3在 RR-B-ALL 患者移植前使用 CAR-T 细胞免疫治疗用于清除残存的肿瘤细胞，从而减少了此类患者
2、的移植后复发率，改变了 RR-B-ALL 患者预后。然而免疫功能重建与移植预后、感染及移植物抗宿主病等移植相关并发症密切相关，是移植后患者共同面对的问题。本研究对比描述CAR-T 细胞免疫治疗与常规治疗的非 CAR-T 细胞免疫治疗患者病例特征及在移植前后多时间点免疫细胞亚群的差异性，进而探讨维持 CAR-T 治疗桥接移植后患者免疫功能状态正向重建的影响因素。资料与方法 一、对象 回顾性分析 2018 年 8 月至 2021 年 12 月期间在北京陆道培医院接受 CAR-T 细胞桥接异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplant
3、ation，allo-HSCT）治疗的所有急性 B 淋巴细胞白血病（B-ALL）患者 61 例病历资料，其中行自体 CD19-CAR-T 细胞免疫治疗患者 32 例，非 CAR-T 细胞免疫治疗患者 29 例。随访截至 2022年 1 月 31 日，采用电话随访或查阅门诊/住院病历方式获得患者生存信息。入组患者均已签署知情同意书，本项目已通过陆道培医疗伦理委员会批准（DPEC-M-202108）。二、移植类型与预处理 均选用清髓性预处理，其中全身照射（total body irradiation，TBI）/CY 方案 52 例（TBI 200cGY5 次；CY 1.51.8 g/m2，-5 至
4、-4 d），BU/CY 方案 9 例（BU 0.81.2 mg/kg Q6，-9 至-6 d；CY 1.51.8 g/m2，-5 至-4 d）。兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（rabbit anti-human thymocyte immunoglobulin，ATG）57.5 mg/kg，于-5 至-2 d 分次给药。三、造血干细胞来源和回输 采用重组人粒细胞集落刺激因子动员后骨髓联合外周血干细胞输注，重组人粒细胞集落刺激因子剂量为 7.510.0 g/kg，患者回输前 34 d 开始应用至采集结束。四、移植物抗宿主病预防 采用环孢素+霉酚酸酯+短疗程甲氨蝶呤方案。从预处理-9 d 开始应用环孢素
5、（起始剂量为每日 1.252.5 mg/kg，静脉谷浓度维持 100150 ng/ml）及霉酚酸酯（用量为每日30 mg/kg，口服）。无移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）患者 1 个月内霉酚酸酯减停，1 个月后环孢素改为口服（谷浓度维持 100 ng/ml）。短疗程甲氨蝶呤指第 1 天 15 mg/m2，第 3、6、11 天分别为 10 mg/m2，次日亚叶酸钙 6 mg2 次解救甲氨蝶呤。五、入组标准及相关疾病诊断标准 1.急性 B 淋巴细胞白血病：依照 EGIL 1995 诊断积分系统4结合 WHO 2016 诊断分型标准5。2.CAR-T 细
6、胞免疫治疗：纳入标准为（1）诊断为难治性/复发性急性 B 淋巴细胞白血病，即难治指诱导治疗未能取得微小残留阴性的完全缓解；复发指完全缓解后外周血或骨髓任一肿瘤负荷5%，或微小残留阳性，或出现新发髓外病灶；（2）流式细胞术检查肿瘤细胞表达 CD19。排除标准为（1）合并其他进展期的恶性肿瘤。（2）合并严重/持续感染且未得到有效控制。（3）存在症状性的中枢神经系统紊乱，如痴呆、癫痫等。3.移植物抗宿主病：根据 2020 年版 NCCN 临床实践指南，造血细胞移植-移植前受者评估以及移植物抗宿主病的管理方法定义6。4.病毒激活与转阴：应用 PCR 方法检测血浆中人巨细胞病毒、EB 病毒 DNA 定量
7、500 拷贝/ml，定义为病毒激活。六、标本采集及上机前处理 移植物骨髓标本为采髓术后经乙二胺四乙酸二钾抗凝的骨髓血 24 ml，外周标本为重组人粒细胞集落刺激因子动员后进入外周循环的单个核细胞。在患者接受造血干细胞移植术后第 1、2、3、6、8、10、12 个月，采集受者肝素抗凝静脉血 5 ml 行流式检测。所有样本按照厂家说明书推荐方法进行标记。胞膜管为：每管样本中按照细胞计数加入样本，保证加入 2106 个细胞数量，按照说明书在每支试管中加入 520 l 不同荧光素标记的抗体，充分混匀后常温避光孵育 15 min，加入 3 ml BD FACS Lysing Solution 溶血素，混
8、匀后室温避光孵育 10 min，300g 离心 5 min 去上清，加入 3 ml 磷酸盐缓冲液混匀后离心洗涤 1 次，加入 0.5 ml磷酸盐缓冲液上机检测。七、主要仪器及试剂 流式细胞术试剂组合方案，第 1 管为 CD3FITC/CD56 PE/CD45PerCP Cy5.5/CD4 PE CY7/CD19 APC/CD8 APC CY7，第 2 管为 CD4 FITC/CD127 PE/CD3 PerCP Cy5.5/CD25 APC。第 3 管为 CD45FITC/CD34 PE/7-AAD。淋巴细胞亚群抗体为旷博公司产品，CD34 检测试剂（SCE）为美国 Becton Dickin
9、son公司产品。溶血素为美国 Becton Dickinson 公司产品。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司3激光10色BD Lyric流式细胞仪，获取软件为 BD FACSuite，每样本管获取 30 万个活细胞，分析软件为 BD Diva 8.0.2。八、统计学分析 用 SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。首先对所有计量资料行正态性检验，符合正态分布的计量资料以表示，2 组均数比较采用独立样本 t 检验；不符合正态分布的计量资料以 M（Q1，Q3）表示，比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料以百分数表示，两组间比较采用 2 检验。不同结局下各单因素的
10、生存曲线采用 Kaplan-Meier 法，Log-rank检验。以 P0.05）见表 3。图 1 61 例患者 GVHD 及生存曲线 讨论 靶向 CD19 的 CAR-T 细胞免疫治疗为难治性易复发的急性B淋巴细胞白血病的治疗带来巨大的进展，在行allo-HSCT前使用CAR-T治疗特异性杀伤肿瘤细胞，降低患者allo-HSCT后的复发率，将生存率从 20%30%提高到 70%90%1，7。研究表明，CAR-T 细胞免疫治疗常伴有免疫相关不良事件，如白细胞减少、细胞因子释放，如果在 28 d 内不能恢复则会进一步引起感染、神经症状及溶细胞综合征等 8，Fried等9的团队报道中性粒细胞减少症
11、、血小板减少症、神经毒性、感染和细胞因子释放综合征 3 级或 3 级以上不良事件的发生率分别为 38%、23%、18%、29%和 19%。并且他们的研究表明，回输第 30 d 时有 58.8%患者发生了低丙种球蛋白血症，在治疗过程中 74.1%发生了新的低丙种球蛋白血症。故 CAR-T 细胞免疫治疗后机体免疫的恢复也是国内外共同关注的问题，尤其是在桥接移植之后如何诱导免疫耐受的同时又保留移植物抗白血病效应，是能否解决移植后感染、复发等并发症的根本途径，更是影响患者生存的关键因素。我们的研究表明移植前 CAR-T 细胞免疫治疗患者较非CAR-T 治疗患者血清中 IgA、IgG、IgM 水平低，且
12、外周血中总淋巴细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞计数也低，自然杀伤（natural killer，NK）细胞及 Treg 细胞差异无统计学意义。提示 CAR-T 细胞免疫治疗患者在造血干细胞移植前存在更差的免疫状态，这可能与CAR-T 患者移植前化学治疗病史长（899 d203.5 d），第一次缓解期患者比例低（31%65%），CAR-T 细胞免疫治疗毒性相关，这与国际的研究结果一致9。造血干细胞移植后影响免疫重建因素主要包括，患者年龄，干细胞来源、供受者 HLA 不相容性、供者移植物去 T 细胞应用、GVHD、用于预防和治疗 GVHD 的免疫抑制剂的使
13、用等10。供者淋巴细胞在移植后早期活化，产生移植物抗白血病效应来清除肿瘤细胞，预防复发，同时伴随着移植物抗宿主病。而这一过程主要是依靠抗原提呈细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、调节性T细胞、B细胞和自然杀伤细胞之间复杂的相互作用 11。Allo-HSCT 后 CD8+T 细胞在移植后早期恢复，而 CD4+T细胞要在移植后 12 年完成免疫重建12,13，这导致了部分患者在移植后 1 年内 CD4+T/CD8+T 持续处于倒置状态14。CD4+T、CD8+T 恢复情况与预处理方案、患者年龄，移植物 CD34+T 输注剂量，移植类型相关12,13。ATG为选择性 T 淋巴细胞免疫抑制剂，在
14、应用后早期就会出现总淋巴细胞降低，治疗开始的 2 周后所有 T 淋巴细胞亚群绝对计数断崖式下降，40%患者在应用后 3 个月淋巴细胞计数才能恢复至 50%以上。故在本研究中，当 CAR-T 患者移植前外周血总淋巴细胞计数200106/L，CD8+T 细胞绝对细胞375 个/l 的患者，有更低的感染发生率及移植相关死亡率，有更高的 OS 13，17。在我们的统计数据中，2 组患者 CD8+T细胞绝对计数早在移植后 1 个月就达到正常范围下限，2 个月500 个/l。CD4+T 细胞绝对计数在移植后 10 个月才逐渐恢复，截至 12 个月随访终点仍徘徊于低限范围，CD4+T/CD8+T 比例持续倒
15、置。这与国外报道数据相似12,13，只是 2 组患者 CD4+T 细胞绝对计数更快，推测可能与我们提高了 CD34+细胞输注剂量相关。NK 细胞是机体重要的免疫细胞，来源于 CD34+造血干细胞，在骨髓内发育成熟。大多数文献表明 NK 细胞在全相合造血干细胞移植后 1 个月即可达到供者水平18。本研究中虽然移植前非 CAR-T 组患者 NK 细胞数值较高，但移植后早期 1、2、3 个月 CAR-T 组 NK 细胞重建得更快，6 个月后 2组持平。移植后 3 个月内 2 组 GVHD、EB 病毒、巨细胞病毒血症无差别。与既往研究结果相一致，即 NK 细胞移植后 1个月恢复至正常水平，回输高 CD
16、34+干细胞剂量的 CAR-T 组更有助于 NK 细胞亚群重建18。Allo-HSCT 后第 12 个月内外周血 B 细胞数量极低甚至检测不到，后逐渐恢复至移植后 1 年达到正常水平，慢性 GVHD 患者 B 细胞数量恢复更延迟。B 细胞功能恢复依赖于 T 细胞的重建，尤其是 CD4+T 细胞19。无论是 CAR-T 细胞免疫治疗患者还是非 CAR-T 细胞免疫治疗患者，移植后前 3 个月内 B 淋巴细胞绝对计数均在个位数，6 个月逐渐恢复正常，较文献报道中恢复迅速，这可能依赖于本研究中同时相对较快的 CD4+T 细胞恢复。我们的研究发现，虽然与传统经化疗桥接移植的非CAR-T 细胞免疫治疗患
17、者相比，CAR-T 细胞免疫治疗的RR-B-ALL 患者移植前免疫功能状态更差，但经过减低预处理中 ATG 剂量，增加移植物 CD34+输注剂量，并在移植后定期随访免疫细胞亚群绝对计数，观测免疫重建障碍时较早停用环孢素，未增加GVHD发生几率的基础上，使其达到与非CAR-T细胞免疫治疗患者相似的免疫重建时间和质量，差异无统计学意义的 OS，极大程度上改善了 RR-B-ALL 患者的预后。异基因造血干细胞移植，最根本的是造血系统与免疫系统的双重重建。尽管 CAR-T 细胞免疫治疗桥接异基因造血干细胞移植后免疫重建过程尚未完全清楚，但根据既往移植免疫重建规律与经验，移植后定期检测外周血免疫细胞亚群，有助于了解免疫重建过程，对临床诊疗提供依据。