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1、第七章 微生物的遗传和变异（6学时）第一节 微生物的遗传第二节 微生物的变异第三节 微生物的育种第一节 微生物的遗传物质u一、微生物的遗传物质u二、微生物遗传信息的表达u三、微生物基因表达的调控一、微生物的遗传物质u（一）证明核酸是遗传物质的经典实验u（二）微生物的染色体基因组u（三）微生物染色体外的遗传物质（一）证明核酸是遗传物质的经典实验u1、细菌的转化实验u2、噬菌体感染实验u3、病毒重建实验1、细菌的转化实验u细菌的转化实验：细菌的转化实验：19281928年，英国医生年，英国医生GriffithGriffith以肺炎以肺炎链球菌链球菌 (Streptococcus Streptoco
2、ccus pneumoniaepneumoniae)作为研究对象作为研究对象u19441944年，年，AveryAvery等人从等人从热死的热死的S S型菌型菌体中提纯了可体中提纯了可能作为转化因能作为转化因子的各种成分，子的各种成分，并在离体条件并在离体条件下进行了转化下进行了转化实验实验2、噬菌体感染实验u噬菌体感染实验：噬菌体感染实验：19521952年，年，HersheyHershey和和ChaseChase培养获得培养获得含含3232P-DNAP-DNA的噬菌的噬菌体和含体和含3535S-S-蛋白质蛋白质的噬菌体；他们作的噬菌体；他们作了两组对了两组对E.coliE.coli的的感染
3、实验感染实验3、病毒重建实验u病毒重建实验：病毒重建实验：19561956年，年，FraenkelFraenkel用用TMVTMV的的RNARNA与与HRVHRV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时，的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的烟叶上出现的是典型的 TMV TMV 病斑病斑核酸是遗传物质u以上三个实验的结论：只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质u细胞生物的遗传物质：双链DNAu病毒的遗传物质：可以是单链的或双链的DNA或RNADNADNARNARNA碱基碱基腺嘌呤腺嘌呤(adennine,Aadennine,A)鸟嘌呤鸟嘌呤(guanine,G)(guani
4、ne,G)胞嘧啶胞嘧啶(cytosine,C)(cytosine,C)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(thymine,Tthymine,T)腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶(Uracil,UUracil,U)戊糖戊糖脱氧核糖脱氧核糖核糖核糖磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸磷酸核酸的化学组成一、微生物的遗传物质u（一）证明核酸是遗传物质的经典实验u（二）微生物的染色体基因组u（三）微生物染色体外的遗传物质（二）微生物的染色体基因组u染色体：微生物遗传物质DNA的主要存在形式；不同种类，其DNA的数目、大小、结构差异显著u基因组（genome）：微生物单倍体的所有染色体及其所包含遗传基因的总称；包括编码蛋白
5、质的结构基因、调控序列以及目前功能尚不清楚的 DNA序列u基因（gene）：是有功能的DNA片段，含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位生生 物物 学学 名名 基因基因组组大小大小（bpbp）基因数基因数 噬菌体噬菌体 phagephage5 105 104 45050T4T4噬菌体噬菌体T4 phageT4 phage2 102 105 5150150大大肠肠杆菌杆菌Escherichia coliEscherichia coli4.7 104.7 106 641004100枯草芽枯草芽孢孢杆杆菌菌Bacillus Bacillus subtili
6、ssubtilis4.2 104.2 106 647004700啤酒酵母啤酒酵母SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae13.51013.5106 658005800脉脉孢孢菌菌 NeurosporaNeurospora sp.sp.6.0 106.0 107 760006000果果蝇蝇 Drosophila Drosophila melanogastermelanogaster 8 108 107 7 12000 12000 人人 humanhuman3 103 109 950000500001、大肠杆菌的基因组u染色体：只有一条，大小为
7、4.7106bp；双链、环状DNA，与类组蛋白等结合成致密的手脚架形u基因的转录与翻译在细胞质耦合发生u遗传信息具有连续性，一般不含内含子u功能相关的结构基因组成操纵子（operon）u结构基因的单拷贝u重复序列少而短，一般为440个碱基2、啤酒酵母的基因组u染色体：16条，总大小为13.5106bp；染色体由核小体组成，其上有着丝粒和端粒；每一条染色体只含有一条线状、双链DNA u基因的转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质的核糖体上发生u高度重复：tRNA基因在每条染色体上至少有4个，共约250个拷贝u没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列原核微生物与真核生微物基因组的比较比较项目比较项
8、目原核微生物原核微生物真核微生物真核微生物基因组大小基因组大小小小,10,106 6大大,10,107-97-9染色体染色体一般一般1 1条，环状条，环状多条，线状多条，线状核小体核小体无无有有基因连续性基因连续性强强弱（有内含子）弱（有内含子）重复序列和重复序列和不编码序列不编码序列少少多多操纵子结构操纵子结构普遍存在普遍存在一般没有一般没有转录、转译部位转录、转译部位同在细胞质中进同在细胞质中进行行在核中转录，在细在核中转录，在细胞质中转译胞质中转译3、噬菌体的基因组u染色体：包装到二十面体头内，大小为48,502bp；dsDNA，线状u许多功能相关的基因聚集成簇排列u复制和裂解过程中基因
9、组程序性开启或关闭一、微生物的遗传物质u（一）证明核酸是遗传物质的经典实验u（二）微生物的染色体基因组u（三）微生物染色体外的遗传物质（三）微生物染色体外的遗传物质u1、细胞器DNAu2、质粒u3、转座因子1、细胞器DNAu细胞器DNA：真核微生物的叶绿体、线粒体等细胞器都有自己的独立于染色体的环状双链DNAu编码自身所需要的与能量转换有关的蛋白质2、质粒u质粒（plasma）：是宿主染色体外决定某些性状（如抗药性、接合作用等）的闭合、环状、双链DNAu目前仅发现于原核微生物和酵母菌中质粒的特性u常是共价闭合、环状、双链DNA分子u具有自我复制能力u不是宿主生长所必需的，消除质粒后不会影响到宿
10、主细胞的生存u决定宿主细胞的某些性状，如抗药性、接合作用等u具有不相容性质粒在基因工程中的应用u质粒的优点：体积小，易分离和操作；环状，稳定；独立复制；拷贝数多；存在标记位点，易筛选u质粒的提取与检测：碱裂法提取；琼脂糖凝胶电泳检测3、转座因子u转座因子：是微生物细胞中可在染色体上改变自身座位的一段DNA序列u在原核微生物和真核微生物中都有存在转座因子的类型u插入序列（IS）：只含有编码转座所必需的转座酶基因，如IS4u转座子（Tn）：包括复合转座子和复杂转座子两种类型u转座噬菌体：具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体，如Mu二、微生物遗传信息的表达u（一）DNA的复制u（二）基因的转录
11、u（三）多肽链的翻译（一）DNA的复制u参与复制（参与复制（replicationreplication）的物质：原料）的物质：原料dNTPdNTP、模板、模板DNADNA、DNADNA聚合酶、其他蛋白质因子聚合酶、其他蛋白质因子u复制方式：半保留复制，不连续复制复制方式：半保留复制，不连续复制u复制起点：大多数细菌及病毒只有一个复制起点复制起点：大多数细菌及病毒只有一个复制起点 ，一个复制子一个复制子 ；真核生物是多起点的，多个复制子；真核生物是多起点的，多个复制子 u复制方向：大多数双向进行，方向为复制方向：大多数双向进行，方向为5353u复制的三个阶段：复制的起始、复制的延伸和复制复制的
12、三个阶段：复制的起始、复制的延伸和复制的终止的终止DNADNA聚合酶聚合酶IIIIII细菌细菌DNADNA的的 形复制形复制10100 m mm 复制叉复制叉复复制制叉叉复复制制原原点点真核生物真核生物DNADNA的多点复制的多点复制二、微生物遗传信息的表达u（一）DNA的复制u（二）基因的转录u（三）多肽链的翻译（二）基因的转录u参与转录（参与转录（transcriptiontranscription）的物质：）的物质：原料原料NTPNTP、模板、模板DNADNA、RNARNA聚合酶、其他蛋白质因子聚合酶、其他蛋白质因子u转录的不对称性：指导转录的不对称性：指导mRNAmRNA合成的合成的D
13、NADNA链称为模链称为模板链，板链，DNADNA仅有一条链可作为转录的模板仅有一条链可作为转录的模板u启动子：指能被启动子：指能被RNARNA聚合酶识别、结合并启动基因聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段转录的一段DNADNA序列序列u转录的三个阶段：转录起始、转录的三个阶段：转录起始、RNARNA链延伸、转录终链延伸、转录终止，方向为止，方向为5353u转录后加工：内含子的切除、外显子的连接转录后加工：内含子的切除、外显子的连接RNARNA聚合酶聚合酶编码链编码链AACTGTATATTA模板链模板链TTGACATATAAT35转录起始点转录起始点Probnow盒子盒子启动子启动子 35 1
14、0 +1转录区转录区二、微生物遗传信息的表达u（一）DNA的复制u（二）基因的转录u（三）多肽链的翻译（三）多肽链的翻译u参与翻译（translation）的物质：氨酰tRNA、成熟mRNA、核糖体（A位点、P位点）、其他蛋白质因子u翻译的三个阶段：翻译起始、肽链延长和翻译终止，方向为53u起始密码子：AUGu终止密码子：UAA、UAG和UGAu翻译后加工：形成的肽链在蛋白伴侣（chaperone）的作用下形成大分子蛋白三、微生物基因表达的调控u（一）转录水平调控u（二）翻译水平调控（一）转录水平调控u转录水平调控（transcriptional level）：控制从DNA模板上转录特异的RN
15、A的速度u这是一种最经济的办法，可以免去浪费从mRNA合成蛋白质的各种元件和材料u大多数基因表达都属于这种调控1、负调控u负调控（negative regulation）：调节蛋白与DNA的特定位点相作用，关闭或降低操纵子转录活性的调控方式u例子：大肠杆菌乳糖操纵子的负调控 2、正调控u正调控（positive regulation）：调节蛋白与DNA的特定位点相结合，启动或增强操纵子转录活性的调控方式u大肠杆菌乳糖操纵子的正调控 3、弱化作用u弱化作用：是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，通过操纵子的前导区内类似于终止子结构的一段DNA序列而实现，它并不使正在转录中的mRNA全部都中途终止，而
16、是仅有部分中途停止转录u例子：色氨酸操纵子的弱化作用三、微生物基因表达的调控u（一）转录水平调控u（二）翻译水平调控（二）翻译水平调控u翻译水平调控（translational level）：又称为转录后调控；在mRNA合成后，通过调节与核糖体的结合速度等控制从mRNA翻译成多肽链的速度u这种调控比较少见1、SD序列与翻译效率uSD序列（shine dalgarno sequence)：在mRNA上起始密码子上游有一段富含嘌呤的与16SrRNA区段完全互补的小序列uSD序列与16SrRNA的互补程度以及从起始密码子AUG 到SD序列的距离都强烈影响翻译起始的效率2、重叠基因对翻译的影响u前一基
17、因终止密码子和后一基因起始密码子有一个核苷酸重叠：使已完成迁移基因翻译的核糖体立即开始另一基因的翻译，保证同一核糖体对两个连续基因进行翻译，从而使两个基因产物在数量上相等u终止子和起始密码子之间相隔3个核苷酸：虽两个基因之间没有直接重叠，但基因的SD序列却位于前一个基因终止密码子之前，这也能保证两个基因的等量翻译，也是一种偶联翻译3、反义RNA的调控作用u反义RNA（antisense RNA）：是具有能与另一“靶”RNA互补结合的碱基序列u反义RNA可与mRNA相结合，使核糖体不能翻译或提前终止；或形成RNA-RNA二聚，增加了核酸内切酶的作用特异性从而使mRNA变得不稳定第六章 微生物的遗
18、传和变异（6学时）第一节 微生物的遗传第二节 微生物的变异第三节 微生物的育种第二节 微生物的变异u一、微生物的基因突变u二、微生物的基因重组一、微生物的基因突变u（一）基因突变的概念u（二）基因突变的类型u（三）基因的诱发突变u（四）DNA的损伤修复（一）基因突变的概念u基因突变（mutation）：遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化u点突变：由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起u染色体畸变：DNA的大段变化现象，表现为插入、缺失、重复、易位、倒位突变的特性u非对应性：突变的发生与环境因子无对应性非对应性：突变的发生与环境因子无对应性u稀有性：自发突变率很低，一般在
19、稀有性：自发突变率很低，一般在1010-6-61010-9-9u规律性：特定性状的突变具有一定的规律性规律性：特定性状的突变具有一定的规律性u独立性：引起各种性状改变的突变彼此是独立的独立性：引起各种性状改变的突变彼此是独立的u遗传性：突变是可以稳定遗传的遗传性：突变是可以稳定遗传的u回复性：有时突变可以回复回复性：有时突变可以回复u可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变可提高突可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变可提高突变率，但不改变突变的本质变率，但不改变突变的本质一、微生物的基因突变u（一）基因突变的概念u（二）基因突变的类型u（三）基因的诱发突变u（四）DNA的损伤修复（二）基因突变的类
20、型u1、根据结构改变u2、根据表型改变1、根据结构改变u同义突变：是指某个碱基的变化没有改变产物氨基同义突变：是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列（简并密码子）的变化酸序列（简并密码子）的变化u错义突变：是指某个碱基的变化引起了产物氨基酸错义突变：是指某个碱基的变化引起了产物氨基酸的改变；有时影响到蛋白质活性甚至使之失活的改变；有时影响到蛋白质活性甚至使之失活u无义突变：是指某个碱基的改变，使蛋白质合成提无义突变：是指某个碱基的改变，使蛋白质合成提前终止前终止 (UAA(UAA，UAGUAG，UGA)UGA)，产生截短的蛋白质，产生截短的蛋白质u移码突变：由于移码突变：由于DNADNA序列
21、中发生序列中发生1-21-2个核苷酸的缺失个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致之后或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致之后氨基酸序列的完全变化氨基酸序列的完全变化2、根据表型改变u形态突变型：是指造成形态改变的突变型，包括细胞形态和菌落形态以及噬菌斑形态等 u生化突变型：是指造成代谢途径变异的突变型，如营养缺陷型、抗性突变型等u致死突变型：是指导致个体死亡的突变型u条件致死突变型：是指在某一条件下具有致死效应的突变型，如温度敏感突变型一、微生物的基因突变u（一）基因突变的概念u（二）基因突变的类型u（三）基因的诱发突变u（四）DNA的损伤修复（三）基因的诱发突变u诱发突变
22、：并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率；自发突变的频率是很低的，一般为10-6-10-10u诱变剂(mutagen)：是指能够提高基因突变率到自发突变水平以上的物理、化学或生物因子u诱变剂的主要包括碱基类似物、插入染料、强氧化剂、辐射、噬菌体等1、碱基类似物u碱基类似物：在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现碱基错配的机率也高，从而提高突变频率u例如：5-溴尿嘧啶(胸腺嘧啶结构类似物)和2-氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物)2、插入染料u插入染料：是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的扁平分子，它们通过插
23、入DNA分子的碱基对之间使其分开，从而导致DNA在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DNA插入和缺失的机率，导致突变率的增加，常引起移码突变u例如：溴化乙锭和吖啶橙3、强氧化剂u亚硝酸：能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变u羟胺：只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GCAT的转换u烷化剂：如甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基胍(NTG)，烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤N-3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误4、辐射和热u紫外线(UV)：由UV引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体，阻碍碱基的正常配对而导致
24、碱基置换突变u电离辐射：x-射线、r-射线，快中子等，作用机理尚不十分清楚u短时间的热处理：使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而导致GCAT的转换5、生物诱变因子u转座因子：也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变，而且由于转座因子Tn、Mu带有可选择标记(抗生素抗性等)，因此可容易地分离到所需的突变基因一、微生物的基因突变u（一）基因突变的概念u（二）基因突变的类型u（三）基因的诱发突变u（四）DNA的损伤修复（四）DNA的损伤修复uDNA损伤的修复和基因突变有密切的关系，突变往往是DNA损伤与损伤修复这两个过程共同作
25、用的结果u根据修复途径和参加修复的酶类差异，大致可将DNA的损伤修复分为光修复、切除修复、重组修复和SOS修复 1、光修复u光修复：也叫做光复活作用，一种高度专一的修复方式，只作用于由紫外线引起的DNA嘧啶二聚体的修复u光复活酶在光照的情况下吸收光能而被激活从而切断二聚体之间的连接而恢复原状2、切除修复u切除修复：在暗环境下，特异性酶识别DNA链中的损伤部位，将其分别切离，在DNA聚合酶和连接酶的作用下完成修复u切除修复包括核苷酸切除修复和碱基切除修复两大类3、重组修复u重组修复：必须在DNA进行复制的情况下进行，故又称复制后修复uRceA蛋白结合在有缺口的单链DNA上，并与完整双链的同源区配
26、对形成三链区，由完整双链中的母链与带缺口的子链发生重组u子链中的缺口由母链添边，而母链中失去的部分则由DNA聚合酶和连接酶进行修复4、SOS修复uSOS修复：SOS是一组修复基因，包括recA、lexA、uvrA等，它们为DNA的损伤所诱导uSOS修复是DNA受到重大损伤时的一种应急反应二、微生物的基因重组u（一）原核微生物的基因重组u（二）真核微生物的基因重组基因重组u基因重组（gene recombination）：是指两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新基因型的过程u自然发生：原核微生物主要包括转化、转导、接合等方式；真核微生物主要包括有性杂交、准性杂交等u人工操作
27、：主要包括诱变育种、原生质体融合、基因工程等手段（一）原核微生物的基因重组u1、转化u2、转导u3、接合1、转化u转化(transformation)：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段，并组合到其基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象u可分为自然转化和人工转化2、转导u转导(transduction)：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象u可分为普遍性转导和局限性转导比较项目普遍性转导局限性转导转导的发生自发人工诱导噬菌体形成错误的装配前噬菌体的反常切除形成机制包裹选择模型杂种形成模型内含DNA只含宿主染色体DNA含噬菌体和宿主
28、DNA转导性状供体的任何性状前噬菌体邻近两端的DNA片断转导过程通过双交换使转导DNA替换了受体DNA同源区转导噬菌体插入，使受体菌为部分二倍体转导子不能使受体菌溶源化，转导特性稳定为缺陷溶源菌，转导特性不稳定3、接合u接合(conjugation)：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，也称杂交u接合菌株包括F+菌株、F-菌株、Hfr菌株和F菌株等二、微生物的基因重组u（一）原核微生物的基因重组u（二）真核微生物的基因重组（二）真核微生物的基因重组u1、有性杂交u2、准性生殖1、有性杂交u有性杂交：是指微生物性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传后代的一种
29、育种技术u凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌都可采用此法2、准性生殖u准性生殖（parasexuality）：类似于有性生殖；是指同种微生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子的一种原始生殖方式u常见于某些丝状真菌第六章 微生物的遗传和变异（6学时）第一节 微生物的遗传第二节 微生物的变异第三节 微生物的育种第三节 微生物的育种u一、诱变育种u二、基因工程育种 微生物育种的手段u杂交育种：供体菌和受体菌通过有性杂交等，从杂交子代中筛选出优良性状的菌株u诱变育种：用诱变剂处理受体菌，使DNA发生改变，使遗传性状发生变异，筛选出所需菌株u基因工程育种：提取供体
30、菌的DNA，在体外进行切割后与载体连接，导入受体菌内复制或表达，筛选出所需菌株一、诱变育种u（一）挑选优良的出发菌株u（二）制备菌悬液u（三）诱变处理u（四）突变菌株的筛选（一）挑选优良的出发菌株u以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响u采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株u选择对诱变剂敏感的菌株一、诱变育种u（一）挑选优良的出发菌株u（二）制备菌悬液u（三）诱变处理u（四）突变菌株的筛选2、制备菌悬液u在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液；分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落u在实际工作中，要得到均匀分散的细胞
31、悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤u诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；对芽孢杆菌则应处理它们的芽孢一、诱变育种u（一）挑选优良的出发菌株u（二）制备菌悬液u（三）诱变处理u（四）突变菌株的筛选（三）诱变处理u选择简便有效、最适剂量的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)和亚硝基甲基脲(NMU)等u利用复合处理的协同效应：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用菌种 单独处理 复合处理 诱变剂 突变率(%)诱变剂 突变率(%)土曲霉 紫外线 X 射线 21.3 19.7 X 射线+紫外线
32、 42.8 土曲霉 氮芥(0.1%)紫外线 不明显 4.7 氮芥+紫外线 11.0 链霉菌 紫外线 射线 31.0 35.0 紫外线+射线 43.6 金色链霉菌 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外线 6.06 1.78 12.5 二乙稀三胺+紫外线 硫酸二乙酯+紫外线 26.6 35.86 1、紫外线的使用u在诱变处理前，先开紫外灯预热 20 分钟，使光波稳定u将 3 5ml 细胞悬浮液置 6cm 培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射 3 5 分钟进行表面杀菌u打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌u处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取 0.2ml 涂平板，或经暗培养一段
33、时间后再涂平板 2、5-溴尿嘧啶的使用u称取称取 5-BU 5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为 2mg/ml 2mg/ml u将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质中过夜，使其尽量消耗自身营养物质u将将 5-BU 5-BU 加入培养基内，使其终浓度一般为加入培养基内，使其终浓度一般为 10 10 20g/ml 20g/ml，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定程中诱变，然后挑单菌落进行测定u处理孢子悬
34、浮液时，可采用较高浓度的处理孢子悬浮液时，可采用较高浓度的 5BU(100 5BU(100 1000g/ml)1000g/ml)与孢子悬浮液混合后振荡培养，经一定与孢子悬浮液混合后振荡培养，经一定时间后适当稀涂平板时间后适当稀涂平板一、诱变育种u（一）挑选优良的出发菌株u（二）制备菌悬液u（三）诱变处理u（四）突变菌株的筛选（四）突变菌株的筛选u营养缺陷型突变株：通过外加限量的所要求的营养物，克服生长的障碍，而又使最终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或某种最终产物的积累u抗阻遏和抗反馈突变型：都是由于代谢失调所造成的，它们都有共同的表型，即在细胞中已经有大量最终代谢产物时
35、仍然继续不断地合成这一产物 u抗性突变株：筛选各种抗性突变型是生产上常用来提高某些代谢产物的重要途径 二、微生物的基因工程u（一）目的基因的克隆u（二）克隆载体的选择u（三）目的基因与载体的体外重组 u（四）重组载体引入受体细胞 u（五）转化子的筛选和重组子的鉴定基因工程的概念u基因工程：是用人工方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在体外进行切割后，将其载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞中使之复制、表达，从而获得新的性状u基因工程的基本操作如下图所示：（一）目的基因的克隆u提取总DNA，设计引物，PCR扩增u通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)，RT-PCR扩增
36、u根据蛋白质肽链中氨基酸序列来设计特定的DNA序列，PCR扩增u用化学方法合成特定功能的基因三、微生物的基因工程u（一）目的基因的克隆u（二）克隆载体的选择u（三）目的基因与载体的体外重组 u（四）重组载体引入受体细胞 u（五）转化子的筛选和重组子的鉴定（二）克隆载体的选择u载体是一个有自我复制能力的复制子u载体能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率u载体最好只有一个限制性内切酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上u载体上必须有一种选择性遗传标记，如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因载体的种类u原核受体细胞的载体：主要有细菌质粒(松弛型)和噬菌体两类u真核细胞的载体：主要有S
37、V4病毒和酵母YAC 三、微生物的基因工程u（一）目的基因的克隆u（二）克隆载体的选择u（三）目的基因与载体的体外重组 u（四）重组载体引入受体细胞 u（五）转化子的筛选和重组子的鉴定（三）目的基因与载体的体外重组u酶切：对目的基因与载体均采用同一种限制性内切酶处理，从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端u连接：然后把两者放在较低的温度(56)下混合“退火”，粘性末端上碱 基互补的片段重新配对，形成双链，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体1、限制性核酸内切酶u限制性核酸内切酶：20世纪60年代末Arber 等发现细菌能够产生识别特定的DNA序列并对
38、其加以切割的酶，简称DNA内切酶；这个发现标记着DNA重组技术的诞生u工具酶识别序列是48个核苷酸，这些位点的显著特点是它们具有双重旋转对称的结构或称回纹结构XhoI SciIDNA内切酶的切割方式u粘性末端：两条单链上的断裂位置交错且对称，所产生的两个末端含有单链的互补序列u平端切割：两条单链上的断裂位置处在一个对称结构的中心，裂口处两条单链的长短平等2、DNA连接酶uDNA连接酶：是一种能够催化DNA中相邻的3-OH和5-磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的酶u1972年，David Jackson等使DNA片断的粘性末端退火，然后用DNA连接酶共价连接这些片段；同年内，
39、他们就发展出基因克隆中所需要的质粒载体与外源DNA的连接技术，成功地获得了重组DNA分子三、微生物的基因工程u（一）目的基因的克隆u（二）克隆载体的选择u（三）目的基因与载体的体外重组 u（四）重组载体引入受体细胞 u（五）转化子的筛选和重组子的鉴定（四）重组载体引入受体细胞u受体细胞：可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞；目前使用最广泛的是E.coli，其次为枯草杆菌和酿酒酵母u引入方法：若以重组质粒作载体时，可以用转化的手段；若以病毒DNA作重组载体时,则用转染的方法三、微生物的基因工程u（一）目的基因的克隆u（二）克隆载体的选择u（三）目的基因与载体的体外重组 u（四）重组载体引入受
40、体细胞 u（五）转化子的筛选和重组子的鉴定（五）转化子的筛选和重组子的鉴定u载体遗传标记法u外源基因表达产物的鉴定u重组 DNA 分子结构特征的鉴定 微生物学与基因工程的关系u基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成u基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的u微生物细胞是基因克隆的主要宿主微生物学与基因工程的关系u基因产物的商品化生产通常是将外源基因导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的u微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源u有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研
41、究中取得的【小结】u名词解释：基因型、表型、基因组、基因、质粒、名词解释：基因型、表型、基因组、基因、质粒、转座因子、操纵子、基因突变、准性生殖转座因子、操纵子、基因突变、准性生殖u微生物的遗传物质基础是什么？有什么直接的实验微生物的遗传物质基础是什么？有什么直接的实验证据？证据？u简述微生物基因表达转录水平的调控方式？简述微生物基因表达转录水平的调控方式？u简述微生物基因突变的机理和类型？简述微生物基因突变的机理和类型？u请设计一个实验来决定在一种特定的细菌中发生的请设计一个实验来决定在一种特定的细菌中发生的遗传转移过程是转化、转导还是接合？遗传转移过程是转化、转导还是接合？u基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及到基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及到微生物的参与？微生物的参与？