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1、宋宋宋宋 苏轼苏轼苏轼苏轼桃花桃花桃花桃花基基 因因 工工 程程淮阴师范学院淮阴师范学院 杨文杰杨文杰生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程C C C C 用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞用于基因转移的受体菌或细胞A A A A 用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶用于核酸操作的工具酶B B B B 用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体4 基因工程的基本条件基因工程的基本条件第二节第二节 基因工程的载体系统基因工程的载体系统质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体粘粒载体粘粒载体人工染色体载
2、体人工染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征一、克隆载体(一一)载体的功能及特征载体的功能及特征载载体体:在在基基因因克克隆隆中中携携带带外外源源基基因因进进入入受受体体细细胞胞的的基基因因工工程程“运运载载工工具具”称称为为载载体体。载载体体的的化化学学本本质质是是DNA。目目前前基基因因工工程程中中使使用用的的载载体体多为经过改造的质粒多为经过改造的质粒DNADNA。v载体的概念载体的概念v载体应具备的基本特性：载体应具备的基本特性：1.1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性可转移性)；2.2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与
3、特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3.3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；4.4.具有较高的外源具有较高的外源DNADNA的载装能力；的载装能力；5.5.具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。(二二)质粒载体质粒载体(Plasmid)1.质粒的一般生物学特征质粒的一般生物学特征质粒质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；质粒常见于原核细菌和真菌中；质粒常见于原核细菌和真菌中；绝大多数的质粒是绝大多数的质粒是DNADNA型的
4、型的；绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分质粒具有共价、封闭、环状的分 子结构，即子结构，即cccDNAcccDNA；质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300 kb1-300 kb。2.质粒的分类质粒的分类R R质质粒粒：通通称称抗抗药药性性因因子子，它它们们编编码码有有一一种种或或数数种种抗抗菌菌素素抗抗性性基基因因，并并且且能能够够将将此此抗抗性性转转移移到到缺缺乏乏该该质质粒粒的的适适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。F F质质粒粒：又又叫叫F F因因子子或或性性质质粒粒，它它
5、们们能能使使寄寄主主染染色色体体上上的的基因和基因和F F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。ColCol质质粒粒：即即所所谓谓产产生生大大肠肠杆杆菌菌素素因因子子，它它们们编编码码有有控控制制大大肠肠杆杆菌菌素素合合成成的的基基因因。大大肠肠杆杆菌菌素素是是一一类类可可以以使使不不带有带有ColCol质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。3.质粒的基本特性质粒的基本特性（1 1）自主复制）自主复制（2 2）不相容性）不相容性（3 3）转移性）转移性（4 4）编码性状）编码性状（1 1）自主复制）自主
6、复制质粒质粒DNADNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子复制子”。一般一个质粒一般一个质粒DNADNA分子上只含有一个复制子。分子上只含有一个复制子。不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达700700个个/细胞，细胞，最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。orioriE.coli E.coli ColE1ColE1
7、 plasmidplasmidroprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IRNA I33555533v拷贝数的控制机制拷贝数的控制机制质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合复制方向复制方向v按复制能力可将质粒分为两种类型：按复制能力可将质粒分为两种类型：严紧型（严紧型（Stringent plasmid):Stringent plasmid):低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-31-3个质个质 粒分子粒分子 松弛型（松弛型（Relaxed plasmid):Relaxed pla
8、smid):高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达10-6010-60 个质粒分子个质粒分子（2 2）质粒的不相容性）质粒的不相容性质粒的不相容性质粒的不相容性(Plasmid incom-patibility)：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。粒。不相容性的质粒组成不相容性群不相容性的质粒组成不相容性群,目前，在大
9、肠杆目前，在大肠杆菌质粒中至少已鉴定出了菌质粒中至少已鉴定出了3030个以上的不亲和群。个以上的不亲和群。质粒的接合转移质粒的接合转移接合型质粒接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如到另一个细胞（接合作用），如F F、ColCol、R R质粒等；质粒等；（3 3）质粒的转移）质粒的转移非接合型质粒非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作不能在自然条件下独立地发生接合作用如用如ColCol、R R的其它成员。的其它成员。性须性须质粒的迁移作用（质粒的迁移作用（Mobilization)Mobilization)：非接合型
10、的质粒非接合型的质粒由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过程，如程，如ColE1ColE1质粒。质粒。质粒的迁移作用质粒的迁移作用（4 4）编码性状）编码性状野野生生型型的的质质粒粒DNADNA上上往往往往携携带带一一个个或或多多个个遗遗传传标标记记基基因因，这这使
11、使得得寄寄主主生生物物产产生生正正常常生生长长非非必必需需的的附附加加性性状。状。物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有 机物；机物；物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。v这些标记基因对这些标记基因对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义。重组分子的筛选具有重要意义。4.质粒载体的构建质粒载体的构建v天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生
12、能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。型质粒为基础进行人工构建。v目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由 少数几个野生型质粒构建的。少数几个野生型质粒构建的。pSC101：8.8 kb，拷贝数，拷贝数5，四环素抗性标记基，四环素抗性标记基 因因 TcrColE1：6.5 kb，拷贝数拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素大肠杆菌内毒素 标记基因标记基因 E1RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标衍生质粒，氨苄青霉素抗性标 记基因记基因 Apr多克隆位点多克隆位点(Multiple Cloning Sites,MCS)现在
13、几乎所有的载体都含有一个人工合成的密现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为集排列的系列克隆位点，称为“多接头多接头”、“限制限制酶切位点库酶切位点库”或或“多克隆位点多克隆位点”。在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位 点，以方便外源点，以方便外源DNADNA片段的插入。片段的插入。标记基因标记基因(Marker Gene)按其用途可将标记基因分为选择标记基因和按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。筛选标记基因。选择标记基因选择标记基因用于鉴别目标用于鉴别目标DNA(载体载体)的存的存在，将成功转化了载体的宿主
14、挑选出来；在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；筛选标记基因筛选标记基因可用于将携带了外源可用于将携带了外源DNADNA片段的片段的重组子挑选出来。重组子挑选出来。选择标记基因选择标记基因1.1.氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin resistance gene,ampr）2.四环素抗性基因（四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,Tcr）3.氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene,Cmr）4.卡那霉素基因卡那霉素基因（Kanamycin resistance gene,Kanr）筛
15、选标记基因筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源质粒，当一个外源DNADNA片段插入到一个质粒片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即片段的质粒，即重组质粒。重组质粒。互补互补lacZlacZ -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段肽段肽段b b b lacZlacZ -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段肽段肽段b b b b b b -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacZlacZMCSMCS -半乳糖苷
16、酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽段肽段肽段肽段 b b b5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基-D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷X-galX-gal5-5-溴溴溴溴-4-4-氯靛蓝氯靛蓝氯靛蓝氯靛蓝 b b b宿主细胞可编码宿主细胞可编码LacZLacZ酶酶C C端部分序列。虽然宿主端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫叫 互补互补(-complement)-compleme
17、nt)。在质粒载体上带有一个大肠杆菌在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNADNA的短区段，的短区段，其中含有其中含有 半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZLacZ）的调控序列）的调控序列和前和前146146个氨基酸的编码序列；个氨基酸的编码序列；在这一编码区中插入有一个在这一编码区中插入有一个多克隆位点多克隆位点，它并，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZLacZ酶酶的氨基端，而不影响功能；的氨基端，而不影响功能；当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无 互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细
18、菌互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成形成白色菌落。白色菌落。由由 互补而产生的活性蛋白质在诱导物互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTGIPTG的存在的存在下可与生色底物下可与生色底物X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳半乳糖苷）反应，因此糖苷）反应，因此LacLac细菌在含细菌在含X-galX-gal和和IPTGIPTG的培养的培养基上可形成基上可形成蓝色菌落，蓝色菌落，易于识别。易于识别。v人工构建的质粒类型：人工构建的质粒类型：高拷贝质粒：高拷贝质粒：突变拷贝数控制基因，拷贝数突变拷贝数控制基因，拷贝数 1000-3000，扩增基
19、因；，扩增基因；低拷贝质粒：低拷贝质粒：来自来自pSC101pSC101，拷贝数小于，拷贝数小于1010，表，表 达某些毒性基因达某些毒性基因；温敏质粒：温敏质粒：在不同温度下表现出拷贝数、整合在不同温度下表现出拷贝数、整合 等不同性质等不同性质；测序质粒：测序质粒：含有测序通用引物互补序列和多酶含有测序通用引物互补序列和多酶 接头接头polylinkerpolylinker；整合质粒：整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源装有整合促进基因及位点，便于外源 基因的整合基因的整合；穿梭质粒：穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始由人工构建的具有两种不同复制起始 点和选择记号，可在两种不同
20、的寄主细胞中存活点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活 和复制的质粒载体。和复制的质粒载体。；表表达达质质粒粒：装装有有强强化化外外源源基基因因表表达达的的转转录录、翻翻译译、纯化的元件纯化的元件；探针质粒：探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克装有报告基因，便于启动子等元件的克 隆筛选隆筛选；5.重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体第一阶段：第一阶段：pSC101和和ColE1应用较多，但相对分子应用较多，但相对分子 量大且酶切位点少；量大且酶切位点少；第二阶段：第二阶段：pBR322出现后，通过调整载体的结构，出现后，通过调整载体的结构，工作效率大大提高；工作效率大大提高
21、；pUC质粒去掉了多余的片段，质粒去掉了多余的片段，添加了多克隆位点和筛选标记等；添加了多克隆位点和筛选标记等；第三阶段：在此基础上，又增加了辅助功能，形成第三阶段：在此基础上，又增加了辅助功能，形成 了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。FpBR322：4363bp；松弛型复制松弛型复制，50-100拷贝拷贝/cell；用于基因克隆用于基因克隆 30多个单一位点；多个单一位点；具有具有Tcr和和Apr；FpUC18/19：分子量分子量2686bp；装有多克隆位点装有多克隆位点(MCS)；正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ；用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序
22、。Rop基因缺失，基因缺失，500-700拷贝拷贝/cell；FpGEM-3Z/4Z：拷贝数拷贝数 2000-3000/cell装有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ装有两个噬菌体的强启动子装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 2743 bp2743 bpMCSMCSlacZlacZ P PT7T7orioriApAprrpGEM-3ZpGEM-3ZP PSP6SP66.质粒质粒DNA的分离与纯化的分离与纯化氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 沸水浴法沸水浴法 质粒质粒DNADNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙纯
23、度高、周期长、设备要求高、溴乙 锭污染锭污染碱溶法碱溶法 质粒质粒DNADNA纯度底、快速、操作简便纯度底、快速、操作简便质粒质粒DNADNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶 法之间法之间proteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加加CsClCsCl和溴乙锭和溴乙锭 超速离心过夜超速离心过夜在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA稀释
24、沉淀稀释沉淀cccDNAcccDNA碱溶法碱溶法 在在pHpH值在值在12.0-12.512.0-12.5之间时，线之间时，线性染色体性染色体DNADNA片段会被变性，而闭片段会被变性，而闭合环状的质粒的合环状的质粒的DNADNA则不会被变性则不会被变性或只有少量的氢键断裂或只有少量的氢键断裂;当恢复中当恢复中性性pHpH值时便会迅速地复性。值时便会迅速地复性。但变性的线性染色体但变性的线性染色体DNADNA分子复性时不准确，也不迅分子复性时不准确，也不迅速，因此彼此聚集形成网状结构速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变通过离心分离便与变性的蛋白质及性的蛋白质及RNARNA一起沉淀下
25、来，而仍滞留在上清液中一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中的质粒的质粒DNADNA则可用酒精等沉淀收集。则可用酒精等沉淀收集。cccDNAcccDNAL-DNAL-DNAocDNAocDNAD-DNAD-DNA沸水浴法沸水浴法 用含有用含有EDTAEDTA和和TritonX-100TritonX-100的缓冲液悬浮菌体；的缓冲液悬浮菌体；加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁；沸水浴沸水浴4040秒钟秒钟；离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物；乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA；(三三)噬菌体载体噬菌体载体(Bacteriophage)1.1.噬菌体的一般生
26、物学特征噬菌体的一般生物学特征噬菌体或病毒噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效是一类非细胞微生物，能高效 率率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主 复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互而且在一定的条件下上述两种状态还会相互 转化。转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNA能能 被开发成为基因工程的有用载体，因为：被开发成为基因工程的有用载体，因为：F高效率的感染性能使外源基因高效导入受高效率的感染性能使外源基因高效导入受 体细胞体细胞；F
27、自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞 中高效扩增中高效扩增；大肠杆菌的大肠杆菌的噬菌体噬菌体生物结构生物结构F噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；F噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA-DNA组成组成；F-DNADNA全长全长4850248502个核苷酸个核苷酸；F-DNADNA上至少有上至少有6161个基因个基因；COSCOSCOSCOS33335TCCAGCGGCGGGG5TCCAGCGGCGGGGCCCGCCGCTGGA5 CCCGCCGCTGGA5 coscos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基
28、因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNADNA合成控制基因合成控制基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l l-DNA-DNA噬菌体生物学特性：感染周期噬菌体生物学特性：感染周期E.coliE.coli吸附吸附注入注入复制复制包装包装裂解裂解噬菌体生物学特性：感染周期噬菌体生物学特性：感染周期100100个左右的拷贝个左右的拷贝体内包装体内包装包装范围为原包装范围为原DNADNA的的75-105%75-105%即即36-51kb36-51kb噬菌体生物学特性：溶原状态噬菌体生物学特性：溶原状态噬菌体感染大肠杆菌后
29、，除能裂解细胞外，也噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其可能将其DNADNA直接整合到宿主细胞的染色体直接整合到宿主细胞的染色体DNADNA上，上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态溶原状态；整合主要由整合主要由-DNA-DNA上的上的cIcI和和intint两基因的产物所激两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质本身的性质；人们可以根据需要改变人们可以根据需要改变-DNA-DNA或宿主细胞的性质，或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶使噬菌体或处于溶原原状态，或处于溶菌
30、状态状态，或处于溶菌状态；DNADNA重组技术一般需要重组技术一般需要噬菌体进入噬菌体进入溶菌状态溶菌状态。2.2.-DNA-DNA载体的构建载体的构建缩短长度缩短长度野生型野生型-DNA-DNA包装的上限为包装的上限为51kb51kb，本身长度为，本身长度为48.5kb48.5kb，只有当插入的外源，只有当插入的外源DNADNA片段不大于片段不大于2.5kb2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型因此缩短野生型-DNA-DNA的长度，可以提高装载的长度，可以提高装载量。其实野生型量。其实野生型-DNA-DNA上约有上约有40-50%
31、40-50%的片段是复的片段是复制和裂解所非必需的。制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将根据切除的多少，可将-DNA-DNA分成两大类载体：分成两大类载体：插入型载体插入型载体取代型载体取代型载体具有具有一个限制性内切酶位点一个限制性内切酶位点。具有具有成对的限制性内切酶位点，成对的限制性内切酶位点，在两个位在两个位 点之间的点之间的DNADNA区段可以被外源区段可以被外源DNADNA片段取代。片段取代。插入型载体插入型载体插入位点插入位点载体长度载体长度 37kb37kb体外包装体外包装插入片段插入片段体外包装体外包装插入片段大小：插入片段大小：0-14kb0-14kb（515137Kb
32、37Kb）（51 2651 26KbKb）取代型载体取代型载体载体长度载体长度 26kb26kb最小装载长度最小装载长度 10kb 10kb最大装载长度最大装载长度 25kb 25kb插入片段插入片段插入片段插入片段体外包装体外包装体外包装体外包装删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型的-DNA-DNA链上有链上有5 5个个EcoEcoRIRI位点和位点和7 7个个HinHindIIIdIII位点，不位点，不利于重组操作，必须删除至利于重组操作，必须删除至1-21-2个个；同时同时，为了便于各种来源的，为了便于各种来源的DNADNA片段的克隆，片段的克隆，还需要还需要增加一些单一的
33、酶切位点增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或，还需要采用定点突变技术去除或增添酶增添酶切切位点。位点。加装选择标记加装选择标记与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型-DNA-DNA上缺少合适的选择标记，上缺少合适的选择标记，因此因此,加装选择标记是加装选择标记是-DNA-DNA克隆载体构建的重要内容；克隆载体构建的重要内容；-DNA-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记免疫功能类标记颜色反应类标记颜色反应类标记选择标记选择标记 imm434imm434imm434imm434基因编码一种阻止
34、基因编码一种阻止-噬菌体进入噬菌体进入溶菌溶菌 循环循环的阻遏物；的阻遏物；含有完整标记含有完整标记基因的基因的-载体进入受载体进入受 体细胞后，建立体细胞后，建立溶原状态，溶原状态，细菌生细菌生 长缓慢，形成浑浊斑；长缓慢，形成浑浊斑；当外源当外源DNADNA插入到标记基因中，基因插入到标记基因中，基因 失活，失活，-重组分子便进入溶菌循环，重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑；形成透明斑；加装选择标记加装选择标记 lacZlacZlacZlacZ基因编码基因编码-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化无色的无色的X-galX-gal 生成蓝色化合物；生成蓝色化合物；当外源基因插入到当外源基因插
35、入到lacZlacZ基因中，基因中，基因失活，不能合成蓝色化合物；基因失活，不能合成蓝色化合物；而空载体而空载体-DNA-DNA则产生蓝色透明斑。则产生蓝色透明斑。Spi-Spi-正选择型载体正选择型载体若将外源若将外源DNADNA取代取代redred和和gamgam，重组噬菌体便拥有，重组噬菌体便拥有SpiSpi-表型，能在表型，能在P2P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。中繁殖，并形成透明斑。野生型的野生型的噬菌体不能在噬菌体不能在P2P2噬菌体溶源性的细菌中噬菌体溶源性的细菌中繁殖繁殖(Spi(Spi+)，这种生长抑制表型受，这种生长抑制表型
36、受-DNA-DNA上的上的redred和和gamgam两个基因控制。两个基因控制。构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（琥珀型突变（sup)sup)是指由是指由CAGCAG（GlnGln）向）向UAGUAG（stopstop）的突变。的突变。将野生型将野生型-DNA-DNA上上D D和和E E两个头部包装蛋白的基因中的两个头部包装蛋白的基因中的CAGCAG密码子突变成密码子突变成UAGUAG。当这种当这种-DNA-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细
37、菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。株。3.3.-DNA-DNA重组分子的体外包装重组分子的体外包装v外源外源DNADNA插入到插入到 噬菌体载体后，需将重组噬菌体载体后，需将重组DNADNA分子分子导入宿主细胞中。导入宿主细胞中。v转染转染的效率较低的效率较低(10(105 5-10-106 6colony/ug colony/ug -DNA)-DNA)，重组，重组DNADNA分子的转染效率更低分子的转染效率更低(10(103
38、 3-10-104 4colony/ug colony/ug -DNA)-DNA)；v采用体外包装技术，把重组采用体外包装技术，把重组DNADNA分子包装成成熟的噬分子包装成成熟的噬菌体颗粒，便可按正常的噬菌体转导过程导入宿主细菌体颗粒，便可按正常的噬菌体转导过程导入宿主细胞中，可明显提高胞中，可明显提高 噬菌体的转染效率，可达噬菌体的转染效率，可达10107 7左右。左右。v-DNA-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞；菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞；v用于体外包装的蛋白质可直接从感染了用于体外包装的蛋白质
39、可直接从感染了噬菌体的噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。大肠杆菌中提取，现已商品化。v这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少缺少E E组份，另一部分则缺少组份，另一部分则缺少D D组份。包装时，当且组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA-DNA分子混合后，分子混合后，包装才能有效进行。包装才能有效进行。噬菌体头部外壳蛋白质容纳噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNADNA的能力是有一定的能力是有一定限度的，控制在野生型限度的，控制在野生型-DNA-DNA长度的长度的75%-105%75%-105%之间。之间。
40、在这一范围内的在这一范围内的DNADNA可被包装成有活性的可被包装成有活性的 噬菌体颗噬菌体颗粒，而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬粒，而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬菌斑。菌斑。包装限制说明包装限制说明 噬菌体载体克隆外源噬菌体载体克隆外源DNADNA的能力不的能力不是无限的，有一个极限值。是无限的，有一个极限值。噬菌体载体属于噬菌体载体属于克隆载体，克隆载体，主要用于克隆主要用于克隆DNADNA片段。构建片段。构建cDNAcDNA文库和基因组文库文库和基因组文库,并从中筛选目并从中筛选目标基因是标基因是噬菌体载体一般用途，也可用于亚克噬菌体载体一般用途，也可用于亚克隆在大容量
41、载体（如粘粒）中增殖的外源隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源DNADNA片段。片段。4.4.用用噬菌体进行克隆噬菌体进行克隆在在构建基因文库构建基因文库时，不同的重组噬菌体时，不同的重组噬菌体DNADNA经过经过裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑。裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑。这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库。而质粒这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库。而质粒载体构建的文库是以菌落的形式存在的。载体构建的文库是以菌落的形式存在的。5.5.-DNA-DNA及其重组分子的分离纯化及其重组分子的分离纯化将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期；将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生
42、长期；加入加入噬菌体或重组噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，噬菌体的悬浮液，3737培养培养1 1小时；小时；用新鲜培养基稀释，继续培养用新鲜培养基稀释，继续培养4-124-12小时。密度已达小时。密度已达10101313-10-101414/L/L，大肠杆菌细胞已完全裂解；，大肠杆菌细胞已完全裂解；超速离心，沉淀噬菌体；超速离心，沉淀噬菌体；苯酚抽提，释放苯酚抽提，释放-DNA-DNA；乙醇或异丙醇沉淀乙醇或异丙醇沉淀-DNA-DNA。6.6.-DNA-DNA作为载体的优点作为载体的优点-DNA-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；-D
43、NA-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25kb25kb，远远大于质粒的装载量；，远远大于质粒的装载量；重组重组-DNA-DNA分子的筛选较为方便；分子的筛选较为方便；重组重组-DNA-DNA分子的提取较为简便；分子的提取较为简便；-DNA-DNA载体的适合克隆和扩增外源载体的适合克隆和扩增外源DNADNA片段，但不适合表达。片段，但不适合表达。27002700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子(四四)大肠杆菌的大肠杆菌的M13单链噬菌体单链噬菌体DNA1.1.M13M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性 生物结构生物结构M13M13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状；M13M13噬菌体由
44、外壳包装蛋白和正链噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNADNA组成组成；M13M13噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长；M13 DNAM13 DNA全长全长64076407个核苷酸个核苷酸；M13 DNAM13 DNA上至少有上至少有1010个基因个基因。+DNA+DNA(+)DNA(+)DNARFDNARFDNARFDNARFDNAII IIVV 感染周期感染周期-DNA-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII VI I IV II X V VII IX VIIIIII
45、VI I IV II X V VII IX VIIIlacZlacZpolylinkerpolylinker2.2.M13M13噬菌体的噬菌体的构建构建野生型野生型M13RF-DNAM13RF-DNAM13mpM13mpn n系列载体系列载体3.3.M13M13噬菌体的噬菌体的特点特点使克隆的使克隆的DNADNA片段以特定单链的形式输出受体细胞片段以特定单链的形式输出受体细胞外外,这在这在DNADNA定向突变中非常有用；定向突变中非常有用；M13M13重组分子筛选简便重组分子筛选简便，被被M13M13噬菌体感染的受体细噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重胞生长缓慢，形
46、成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大；但但M13-DNAM13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只载体的最大缺陷是装载量小，只有有1.5kb1.5kb；III基因间区段基因间区段(507bp)(五五)考斯质粒考斯质粒和噬菌粒和噬菌粒v-DNA-DNA载体和载体和M13-DNAM13-DNA载体的装载量最大分别为载体的装载量最大分别为25kb25kb和和1.5kb1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNADNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建
47、就是为了进一步提高噬菌体步提高噬菌体DNADNA的装载量。的装载量。v在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNADNA的长的长度，就能同步增加载体的装载能力。度，就能同步增加载体的装载能力。v将噬菌体将噬菌体DNADNA与包装有关的序列与包装有关的序列和和质粒组装在一起，质粒组装在一起，既既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNADNA分分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。质粒和噬菌粒载体的思路。pHC79pHC
48、796400 bp6400 bpTcTcrr fragmentfragmentcoscosorioriApAprrPstIPstIBamHIBamHISalISalI1.1.考斯质粒考斯质粒(cosmidcosmid)载体的构建载体的构建v考斯质粒考斯质粒是一类人工构建的含是一类人工构建的含有有-DNAcos-DNAcos序列和质粒复制子的序列和质粒复制子的特殊类型的载体特殊类型的载体；v装载范围为装载范围为31-45kb31-45kb。v1978年年Collins和和Hohn发明构发明构建建1.8kb1.8kb的的-DNA-DNA片段片段+pBR322+pBR322片段片段；2.2.考斯质粒
49、考斯质粒的特点的特点能像能像-DNA-DNA那样进行体外包装那样进行体外包装,并高效转染受体细胞；并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便重组操作简便,筛选容易；筛选容易；装载量大（装载量大（45kb45kb）且克隆片段具有一定的大小范围；）且克隆片段具有一定的大小范围；不能体内包装不能体内包装,不裂解受体细胞。不裂解受体细胞。3.3.噬菌粒的特点噬菌粒的特点（phagemid or phasmid）v噬菌粒噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记
50、基因的特殊以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体类型的载体。能像能像M13-DNAM13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞；那样体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；装载量比常规的装载量比常规的M13mpM13mp系列要大很多系列要大很多(10kb)(10kb)；通过克隆双链通过克隆双链DNADNA能获得同等长度的单一单链能获得同等长度的单一单链DNADNA；重组操作简便，筛选容易。重组操作简便，筛选容易。pUC118 pUC118 pUC18pUC18+M13M13间隔区间隔区 IGIGpUC119 pUC119