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1、实验七土壤中细菌的分离纯化及计数一、实验目的一、实验目的1 1、掌握微生物分离纯化的方法及步骤。、掌握微生物分离纯化的方法及步骤。2 2、掌握平板菌落计数的原则和方法。、掌握平板菌落计数的原则和方法。二、实验原理二、实验原理 平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的形成的菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即进行。即一长成的菌一长成的菌落代表一个活的细胞落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释，。计数时先将待测样品作一系列稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀使其中的微生物充分分散成单个
2、细胞，再吸取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计统计菌落数目即可计换算出样品的含菌数换算出样品的含菌数。环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起，环境中不同种类的微生物通常混杂生活在一起，为了为了获得纯种微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，制获得纯种微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀稀释涂布平板法释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法
3、分离，纯化该微或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。生物，直至得到该纯种菌株。1、牛肉膏蛋白、牛肉膏蛋白胨胨培养基、土壤培养基、土壤样样品、无菌品、无菌水水2、培养皿、玻璃、培养皿、玻璃试试管、胶管、胶头头滴管、涂布棒滴管、涂布棒三三、实验实验材料材料四、实验步骤四、实验步骤1、细菌的分离纯化、细菌的分离纯化稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1）试管和培养皿编号在试）试管和培养皿编号在试管壁上管壁上依次标上依次标上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。在培养皿。在培养皿养皿的底部依次养皿的底部依次标上标上10-4-1、10-4-2、10-5-1 10-5-2、
4、10-6-1、10-6-2。（2）倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化（微波炉加热）倒平板将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化（微波炉加热3min-5min），待培养基冷却至不烫手时（约），待培养基冷却至不烫手时（约50），无菌倒入已编号的），无菌倒入已编号的培养皿中，室温凝固，备用。培养皿中，室温凝固，备用。（3）土壤稀释液制备。称取）土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶无菌水的三角瓶中，震荡中，震荡15-20min，静置，静置约约2030秒，即成秒，即成10-1的土壤悬液。的土壤悬液。用胶用胶头滴管移取头滴管移取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-2的离心管中，震荡
5、混匀，制成的离心管中，震荡混匀，制成10-2的的菌悬菌悬液液；从；从10-2管中取管中取1 mL菌悬液至标有菌悬液至标有10-3的离心管中，震荡混的离心管中，震荡混匀，制成匀，制成10-3的的菌悬液；同法依次制备菌悬液；同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。的菌悬液。（5）涂布平板无菌操作，用胶头滴管分别移取）涂布平板无菌操作，用胶头滴管分别移取10-4、10-5、10-6稀释菌液各稀释菌液各200 uL于相应编号的培养皿中，于相应编号的培养皿中，用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（注意：用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（注意：涂布棒火焰灼烧，涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布
6、，否则温度太高导致冷却后再涂布，否则温度太高导致菌体死亡）菌体死亡）（6）培养及计数。将涂布好的平皿放入）培养及计数。将涂布好的平皿放入37培养箱中培养箱中倒置培养。倒置培养。2、菌落计数、菌落计数 培养培养48 h后取出培养皿，算出同一稀释度的三个平后取出培养皿，算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿盖正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿盖上冷凝形成水滴，一方面，水滴滴落至菌落表面，会将上冷凝形成水滴，一方面，水滴滴落至菌落表面，会将菌落打散，不易获得单菌
7、落；菌落打散，不易获得单菌落；另一方面，皿盖上形成水蒸气不利于结果的观察且容易另一方面，皿盖上形成水蒸气不利于结果的观察且容易造成培养基内水分蒸发。所以要进行倒置培养。造成培养基内水分蒸发。所以要进行倒置培养。平均菌落数平均菌落数某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数；某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数；CFUCFU菌落形成单位（菌落形成单位（colony-forming unitscolony-forming units，CFUCFU）；）；0.2mL0.2mL每个平皿加入的菌悬液体积；每个平皿加入的菌悬液体积；100mL100mL1010-1-1菌悬液的体积；菌悬液的体积；10g10g称取的土
8、壤重量。称取的土壤重量。计算公式：计算公式：菌落计数原则（六条）菌落计数原则（六条）1 1、先计算、先计算相同稀释度的平均菌落数相同稀释度的平均菌落数。若其中一个若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘菌落数乘2 2以代表全平板的菌落数，然后再计算该以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀
9、释度的平均菌落数。稀释度的平均菌落数。2 2、首先选择、首先选择平均菌落数在平均菌落数在3030300300之间的，当只有之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见见下表，例下表，例1 1）。）。3 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在、若有两个稀释度的平均菌落数均在3030300300之间，之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于比值小于2 2，应采取两者的，应采取两者的平均数平均数；若；若大于大于2 2，则
10、，则取其中稀释取其中稀释度度(倍数倍数)较小较小的计算菌落总数（的计算菌落总数（见下表，例见下表，例2 2及例及例3 3）。）。4 4、若所有稀释度的平均菌落数均大于、若所有稀释度的平均菌落数均大于300300，则应按，则应按稀释度稀释度(倍数倍数)最高最高的平均菌落数乘以稀释倍数（的平均菌落数乘以稀释倍数（见见下表，例下表，例4 4）。）。5 5、若所有稀释度的平均菌落数、若所有稀释度的平均菌落数均小于均小于3030，则应按，则应按稀释度稀释度(倍数倍数)最低最低的平均菌落数乘以稀释倍数（的平均菌落数乘以稀释倍数（见见下表，例下表，例5 5）。）。6 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在、若所
11、有稀释度的平均菌落数均不在3030300300之间，之间，则以则以最近最近300300或或3030的平均菌落数乘以稀释倍数的平均菌落数乘以稀释倍数（见见下表，例下表，例6 6）。）。计算计算菌落菌落总数总数方法举例（加样量为方法举例（加样量为1mL）例次例次不同稀释度的平均菌落数不同稀释度的平均菌落数两个稀释两个稀释度菌落数度菌落数之比之比菌落总数菌落总数（个（个mL）备注备注10-110-210-31365164201.64104采用采用科学计数科学计数法；取两位小法；取两位小数数2760295461.63.78 1042890271602.22.71 104无法计数无法计数16505135
12、.13 105271152.70 102无法计数无法计数305123.05 104“无法计数无法计数”指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数，指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数，“0”指平板上无微生物菌落生长。指平板上无微生物菌落生长。五、作业五、作业细菌稀释度10-410-510-6123平均123平均123平均cfu数/平板每g土壤的CFU数1、将每一个稀将每一个稀释释度的三个平板上的菌落数填入下表，并度的三个平板上的菌落数填入下表，并计计算算结结果果2、培养时为什么要将培养皿倒置培养？培养时为什么要将培养皿倒置培养？其它微生物的分离纯化方法其它微生物的分离纯化方法（一）、稀（
13、一）、稀释释混合平板法混合平板法按无菌操作要求，用胶头滴管依次吸取10-6、10-5、10-4稀释液各200uL，分别加入编号为10-6、10-5、10-4的培养皿中。分别向上述平皿中倒入15ml已融化并且冷却至45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板。将平板置于37烘箱中倒置培养。（二二）、）、平板划平板划线线分离法分离法交叉划交叉划线线法法 连续连续划划线线法法划划线线分离分离图图1、接种环灼烧灭菌。、接种环灼烧灭菌。2、划线涂布。用接种环蘸取一环菌悬液，按照交叉划线法或连、划线涂布。用接种环蘸取一环菌悬液，按照交叉划线法或连
14、续划线法进行单菌落的分离。续划线法进行单菌落的分离。（1）交叉划线法）交叉划线法 先在平板培养基的一边作第一次平行划线先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，条，再转动培养皿约再转动培养皿约70角，并角，并将接种环上的残菌烧掉将接种环上的残菌烧掉，待冷却后通过，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线，部分作第三次平行划线，共划共划4-5次。次。划线完毕后，盖上皿盖，倒划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温箱培养。置于温箱培养。（2）连续划线法）连续划线法 用接种环挑取样品在平板培养基上作连续划线，用接种环挑取样品在平板培养基上作连续划线，划线完毕后，盖上皿盖，倒置温箱培养。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温箱培养。