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1、1 1、根据已知序列克隆基因、根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。目前目前,世界上主要的基因库有世界上主要的基因库有:(1)(1)EMBLEMBLEMBLEMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为其网上地址为:http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.htmlhttp:/www.ebi.ac.uk
2、/ebi-home.html;(2)(2)GenbankGenbankGenbankGenbank,为设在美国国家卫生研究院为设在美国国家卫生研究院(NIH)(NIH)的基因库的基因库,其网上地址为其网上地址为:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.htmlhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;(3)(3)SwissportSwissportSwissportSwissport和和TREMBLTREMBLTREMBLTREMBL,SwissportSwissportSwissportS
3、wissport是一蛋白质序列库是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度其所含序列的准确度比较高比较高,而而 TREMBLTREMBLTREMBLTREMBL只含有从只含有从EMBLEMBLEMBLEMBL库中翻译过来的序列。库中翻译过来的序列。目前目前,以以GenbankGenbank的应用最频繁。这些基因库是相互联的应用最频繁。这些基因库是相互联系的系的,在在GenbankGenbank注册的基因序列注册的基因序列,也可能在也可能在SwissportSwissport注册。注册。要克隆某个基因可首先通过要克隆某个基因可首先通过InternetInternet查询一下该基因或相查询一下该基因或相
4、关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整根据整个基因序列设计特异的引物个基因序列设计特异的引物,通过通过PCRPCR从基因组中克隆该基从基因组中克隆该基因，也可以通过因，也可以通过RT-PCRRT-PCR克隆克隆cDNAcDNA。值得注意的是。值得注意的是,由于物由于物种和分离株之间的差异种和分离株之间的差异,为了保证为了保证PCRPCR扩增的准确性扩增的准确性,有必有必要采用两步扩增法要采用两步扩增法,即即nested PCRnested
5、PCR。PCR反应模式图：反应模式图：PCR反应模式图：反应模式图：PCR反应模式图：反应模式图：Nested PCR反应模式图反应模式图 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNADNA或或cDNAcDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少那么需要设计至少1 1对简并引对简并引物物(degenerated primer),(degenerated primer),从从cDNAcDNA文库中克隆该基因
6、。以这种方法文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。另外另外,在基因克隆之后在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究如还要进一步做表达研究,所使用的所使用的PCRPCR酶最好不用酶最好不用Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶,而采用其他有自我检测而采用其他有自我检测(reading(reading proof)proof)功能的酶功能的酶,如如pfupfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误突变或终止密码子而导致整个研究结论的
7、错误。2根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组再将其与用不同内切酶处理的基因组DNADNA杂交杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体的载体(质粒、噬菌体或病毒质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后因组中的拷贝数。但在探针杂交后
8、,要注意高强度要注意高强度(high(highstringent)stringent)漂洗漂洗,以避免干扰信号以避免干扰信号,即保证克隆的特异性即保证克隆的特异性,同时节同时节省时间。省时间。3未知序列的基因打靶 根据已知序列进行基因克隆,多数是重复别人的工作,或者是在别人工作的基础上继续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过程。对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。3 31 1随机引物法克隆未知序列基因随机引物法克隆未知序列基因 随机引物随机引物PCR(arbitrarilyPCR(arbitrarilyprimedprimedPCR,AP-PCR)PCR,AP-PCR)首先被用于基因组首
9、先被用于基因组DNADNA或或RNARNA的指纹图谱的指纹图谱(finger(fingerprint)print)分析分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关的基因或关的基因或mRNAmRNA。该方法的理论依据是。该方法的理论依据是:表型受基因支配表型受基因支配,在一个生物体发在一个生物体发生了表型变化后生了表型变化后,其基因组其基因组DNADNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等闭等;另一方面另一方面,如在寄生虫的发育过程中如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因不同发育阶段的虫体所表达的基因
10、很可能不同很可能不同,如将不同发育阶段的虫体如将不同发育阶段的虫体mRNAmRNA提取出来提取出来,用单一引物用单一引物(随机引物随机引物,其长度不超过其长度不超过16 nt)16 nt)对不同时期的虫体对不同时期的虫体mRNAmRNA进行扩增比较进行扩增比较,即可找出导致表即可找出导致表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,PCR,它要求至少有它要求至少有2 2种来自不同种来自不同表型但又很类似的基因组表型但又很类似的基因组DNADNA或或mRNAmRNA。AP-PCRAP-PCR扩增后的产物必须扩增后的产物必须99%99%是一是一致的致的,只有
11、个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图见图1)1)。图1应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体()的扩增产物 AP-PCRAP-PCR的操作一般采用两步法的操作一般采用两步法,即前即前1010个循环多以较低的退火温度个循环多以较低的退火温度(annealing(annealingtemperature)temperature)进行扩增进行扩增,后后2020个循环则采
12、用较高的退火温度扩增。个循环则采用较高的退火温度扩增。AP-AP-PCRPCR产物多较短产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为如扩增的模板为mRNA,mRNA,通过比较扩增产物的强度通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在可以得知该基因在2 2种生物种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在在AP-PCRAP-PCR检测到与某一表型相关检测到与某一表型相关的基因或基因产物的基因或基因产物(mRNA)(mRNA)以后以后,下一步工作就是克隆出整个基因或下一
13、步工作就是克隆出整个基因或mRNAmRNA。主。主要操作程序为要操作程序为:(1)AP-PCR:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCRAP-PCR检测检测到的特定片段从凝胶中切下到的特定片段从凝胶中切下,提取提取DNADNA克隆到适宜的载体内克隆到适宜的载体内(如如TATA载体载体),),再测定再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2 2个方向相反的引物个方向相反的引物(P-1,P-2,(P-1,P-2,见图见图2)2)。引。引物长度多在物长度多在20 nt20 nt以上；退火温度在以上；退火温度在
14、6060以上；以上；(2)(2)将基因组将基因组DNADNA做适当酶切做适当酶切,然然后在其两端连接上相同的接头后在其两端连接上相同的接头(见图见图2,2,这种接头可从生物制品公司购买这种接头可从生物制品公司购买)。3.23.2DifferentialDifferentialdisplaydisplayPCR(DD-PCRPCR(DD-PCR)DD-PCRDD-PCR是在是在AP-PCRAP-PCR基础上发明的一种基础上发明的一种RT-PCRRT-PCR方法方法,主要用于主要用于2 2种或多种类似生物个体在基因表种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是达上的差异分析。其基本原理
15、是:所有真核生物的所有真核生物的成熟成熟mRNAmRNA都含有不同长度的都含有不同长度的poly+(A)poly+(A)尾部序列尾部序列,根根据据poly+(A)poly+(A)内部的内部的2 2个核苷酸排列的不同个核苷酸排列的不同,可以将所可以将所有的有的mRNAmRNA分子分为分子分为1212类类(见图见图3)3)。图真核生物12种mRNA的序列特点 根据这根据这1212种种mRNAmRNA序列可合成序列可合成1212种相应的反转录引物，即种相应的反转录引物，即M MN NTTTTTTTTTTTTTTTT,用其分别进行反转录用其分别进行反转录,即可将所有即可将所有mRNAmRNA分类合成分
16、类合成1212种种cDNA(cDNA(于于1212个试管内个试管内)，然后再用随机引物，然后再用随机引物,以这以这1212种种cDNAcDNA分别做分别做模板进行模板进行PCRPCR扩增扩增(见图见图1 1和图和图4)4)，那么与表型相关的，那么与表型相关的mRNAmRNA就很容易被就很容易被发现并克隆出来。但不论发现并克隆出来。但不论AP-PCRAP-PCR还是还是DD-PCR,DD-PCR,都适用于都适用于2 2种种源近似生种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其其PCRPCR的模板必须是的模板必须是来自来自2 2个生物或同一生物
17、的不同发育阶段的个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNAmRNA。DD-PCRDD-PCR的优点是快的优点是快速、方便速、方便,可以检测表达量极低的可以检测表达量极低的mRNAmRNA，但其技术条件要求较高，所，但其技术条件要求较高，所扩增的扩增的mRNAmRNA的质量不能有差异的质量不能有差异,即即mRNAmRNA不应降解。目前这一方法已广不应降解。目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。图DD-PCR示意图箭头所示为特异扩增产物3.33.3RepresentativeRepresentativedifferencedifferen
18、ce analysisanalysisPCR(RDA-PCR)PCR(RDA-PCR)这是一种差减杂交这是一种差减杂交 (subtractive(subtractivehybridization)hybridization)与与PCRPCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCRAP-PCR和和DD-PCRDD-PCR。前。前2 2种方法是将两模板种方法是将两模板DNADNA或或cDNAcDNA分别进行分别进行PCRPCR扩增扩增,最后通过扩增产物的差异最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带分离和克隆特异扩增带,其缺点是需要将特异扩增产物从
19、胶中切下来其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取提取DNA,DNA,再再扩增后才能克隆。扩增后才能克隆。RDA-PCRRDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异只扩增区别于某一表型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图见图5)5)。其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来因掩盖起来,而只暴露出特异的基因而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。在整个反应中只有特异基因能被扩增。其操作程序为其操作程序为:(1):(1)用同一限制性内切酶
20、用同一限制性内切酶(一般用一般用Bam HI,Bgl IIBam HI,Bgl II或或Hind III)Hind III)同同时处理靶基因组和掩盖基因组时处理靶基因组和掩盖基因组DNADNA，其中掩盖基因组，其中掩盖基因组DNADNA的量至少要的量至少要2 2倍于靶基倍于靶基因组因组DNADNA的量；的量；(2)(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切其序列与酶切产生的粘性末端的序列相对应；产生的粘性末端的序列相对应；(3)(3)将将2 2个基因组的个基因组的DNADNA混合后混合后,高温变性高温变性,低温低温退火。由于掩盖基因组退火。
21、由于掩盖基因组DNADNA的量远大于靶基因组的量远大于靶基因组DNADNA量量,那么与掩盖基因组那么与掩盖基因组DNADNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组合合,不会受掩盖基因的影响；不会受掩盖基因的影响；(4)(4)用用Taq DNATaq DNA聚合酶将粘性末端补齐后聚合酶将粘性末端补齐后,加入与加入与连接子相对应的引物连接子相对应的引物,经过经过3030个左右的个左右的PCRPCR扩增扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序
22、较复杂因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序较复杂,各反应步骤要各反应步骤要求准确无误求准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。列等变化均可检测出来。4 4用特异抗体克隆基因用特异抗体克隆基因 用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有:(1):(1)制备识别制备识别功能抗原的单克隆抗体功能抗原的单克隆抗体;(2);(2)将将SDS-PAGESDS-PA
23、GE分离的蛋白质特异分离的蛋白质特异带切下免疫动物带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质其抗体只识别该特异蛋白质;(3);(3)用用Western-Western-blotblot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或或cDNAcDNA文库文库,从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。出来。5 5特异基因的功能克隆特异基因的功能克隆 它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的
24、一它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有种方法。基因的功能克隆主要有2 2种种:一是一是phagephagedisplay,display,另一是另一是peptidepeptidedisplaydisplay。后者的原理与前者基本相同。目前以。后者的原理与前者基本相同。目前以phagephagedisplaydisplay的应用最为广的应用最为广泛。泛。任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程在其对宿主侵入或致病过程中中,病原体本身的蛋白质成分病原体本身的蛋白质成分(ligand
25、)(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体需要首先与宿主细胞上的受体(receptor)(receptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上的相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上的HeparanHeparansulfatesulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能分析宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预
26、防措施及制备阻断药是制订免疫预防措施及制备阻断药物的前提。物的前提。phagephagedisplaydisplay法是克隆病原体法是克隆病原体ligandligand的一种最为理想的手段。的一种最为理想的手段。图6phage displayphage display克隆基因示意图 PhagePhagedisplaydisplay的基本操作过程为的基本操作过程为:(1):(1)提取某一病原体基因组提取某一病原体基因组DNA,DNA,用用超声波将超声波将DNADNA切割成切割成5005001 5001 500的片段的片段;(2);(2)将片段末端用将片段末端用T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶处理
27、后处理后,与载体与载体DNA(phagemid)DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅助噬菌体助噬菌体(helper(helperphage)phage)同时转染大肠杆菌。同时转染大肠杆菌。phagemidphagemid在大肠杆菌内包在大肠杆菌内包装成噬菌体装成噬菌体,大量繁殖大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；集中在噬菌体颗粒的表面；(3)(3)将特定的受体固定于载体上将特定的受体固定于载体上(多为多为ELISAELISA板板),),方法同一般的方法同一般
28、的ELISAELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板加入平板孔内孔内,感作一段时间感作一段时间,用用PBSPBS等缓冲液漂洗。最后等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的那些表达非相关蛋白的噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱;(4);(4)用高强度用高强度NaClNaCl液将结合在受体液将结合在受体上的噬菌体分离下来上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆。基因克隆。