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1、细胞的结构细胞的结构一一般般结结构构：一一般般细细菌菌都都有有的的构构造造特特殊殊结结构构：部部分分细细菌菌具具有有的的或或一一般般细细菌菌在在特特殊殊环环境境下下才才有有的的革兰氏染色革兰氏染色C.Gram（革兰）于革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。型细菌的染色方法。用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。
2、在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。胞呈无色。用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色兰氏阳性细菌继续保持深紫色实验三实验三 细菌的简单染色和细菌的简单染色和革兰氏染色革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色细菌的简单染色和革兰氏染色l 一
3、 目的要求l 二 基本原理l 三 实验材料l 四 无菌操作过程l 五 操作步骤l 六 实验报告l 七 思考题一一 目的要求目的要求1 1 学学习习制制染染色色片片技技术术，学学习习简简单单染染色色 革革兰兰氏氏染染色色原原理理，理解理解着色机理着色机理。2 2学习并掌握学习并掌握无菌操作的无菌操作的技术技术。3 3 掌握掌握简单染色简单染色 革兰氏染色的方法，并能革兰氏染色的方法，并能正确染色正确染色4 巩固显微镜油镜的使用巩固显微镜油镜的使用方法。方法。（一）细菌的简单染色原理（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理革兰氏染色基本原理二二 基本原理基本原理l细菌细胞微小，且含水量较多
4、，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使所以必须进行染色处理，使细胞着色细胞着色，便于观察。，便于观察。l简单染色是使用简单染色是使用单一染料单一染料染色，可用于观察染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式细菌形态、大小、及排列方式.l染色前一般要将细胞染色前一般要将细胞固定固定，其目的是，其目的是杀死杀死菌体并菌体并使之粘附使之粘附于玻片上，还可以于玻片上，还可以增强菌体的着色能力增强菌体的着色能力。固定有。固定有加热法加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞
5、原有形态。维持细胞原有形态。（一）细菌的简单染色原理（一）细菌的简单染色原理（二）革兰氏染色基本原理（二）革兰氏染色基本原理 革革兰兰氏氏染染色色是是用用于于细细菌菌鉴鉴别别的的一一种种重重要要染染色色方方法法。它它是是根根据据革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌、阴阴性性细细菌菌细细胞胞壁壁结结构构、组组成成的的不不同同而而使使用用一一系系列列的的染染色色处处理理使使之之差差别别显显色色。其其染染色色方方法法是是先先将将细细菌菌分分别别用用结结晶晶紫紫和和碘碘液液初初染染媒媒染染后后，乙乙醇醇脱脱色色，再再经经复复染染剂剂复复染染。最最终终被被染染成成红红色色的的是是革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌；被
6、被染染成成紫紫色色的的是是革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌。占占细胞壁细胞壁的的10%占细胞壁的占细胞壁的90%1 1、细胞壁、细胞壁 革兰氏阳性细菌的细胞壁革兰氏阳性细菌的细胞壁革兰氏染色与细胞壁革兰氏染色与细胞壁：革兰氏阳性革兰氏阳性阴性细菌的细胞壁对比阴性细菌的细胞壁对比v革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色结晶紫使菌体着上紫色第二步：第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。留在细胞内。第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现
7、不同的反应。G G+菌：菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。GG菌：菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无
8、色，蕃红复染后呈红色。1234？三三 实验材料实验材料大肠杆菌（大肠杆菌（24 24 h h 培养）斜面菌种培养）斜面菌种枯草杆菌（枯草杆菌（16 16 h h 培养）培养）斜面菌种斜面菌种四四 无菌操作过程无菌操作过程无菌操作无菌操作：不让不让除我们接种的微生物以外除我们接种的微生物以外 其它微生物其它微生物侵入侵入的技术。的技术。（一）（一）简单染色操作步骤简单染色操作步骤1 1涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、无菌操作无菌操作、均匀的、均匀的薄层薄层2 2干燥：干燥：3 3固定：加热固定固定：加热固定4 4染色：染色：结晶紫染结晶紫染1 1minmin或或蕃
9、红染蕃红染2-32-3minmin或或石炭酸复红染石炭酸复红染1 1minmin。5 5水洗：水洗：6 6 干燥：干燥：7 7镜检：镜检：低倍镜低倍镜观察以确定目标和范围，再换用观察以确定目标和范围，再换用油镜油镜观察绘图。观察绘图。五五 操作步骤操作步骤（二）（二）革兰氏染色操作步骤革兰氏染色操作步骤1 1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。2 2初染：滴加初染：滴加结晶紫结晶紫染色染色1 1minmin，后用水冲洗。后用水冲洗。3 3媒染：滴加媒染：滴加碘液碘液染色染色1-21-2minmin，后用水冲洗，后用水冲洗，甩尽残余水甩尽残余水4 4脱色：用脱
10、色：用95%95%乙醇冲洗乙醇冲洗3030秒秒（需要严格控制时间和浓度需要严格控制时间和浓度），），然后立即用水冲洗。然后立即用水冲洗。5 5复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染蕃红染 2-3 2-3minmin，如果如果石炭酸复红染石炭酸复红染1 1minmin。水洗，晾干。水洗，晾干。6 6镜检：先用低倍镜观察，后用镜检：先用低倍镜观察，后用油镜油镜观察观察阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌1234六六 实验报告实验报告1 写出实验目的写出实验目的2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理写出简单染色、革兰氏染色的基本原理3 根据实验结果绘出简单染色
11、和革兰氏染色的结果图。根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。菌名：放大倍数：细菌简单染色结果图细菌简单染色结果图细菌革兰氏染色结果图细菌革兰氏染色结果图要求：标出菌名、颜色、阳性或阴性菌放大倍数：七七 思考题思考题1 1 细菌简单染色操作过程中应注意哪些事项？细菌简单染色操作过程中应注意哪些事项？2如果对一如果对一未知菌未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色进行革兰氏染色，如何能确证染色结果正确可靠？结果正确可靠？3 3 为什么说为什么说95%95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？下次实验内容：下次实验内容：实验四实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数