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1、关于转基因动物与生物反应器1第一页，本课件共有71页2转基因小鼠模型转基因小鼠模型 历史历史u1974,Jaenisch等人等人,整合整合SV40基因基因的小鼠的小鼠u1980,Gordon 等人等人,育成育成人胸苷激酶人胸苷激酶的转基因小鼠的转基因小鼠u1982,Palmiter等人等人,转大鼠生长激素（转大鼠生长激素（GH）基因的基因的小鼠小鼠 第二页，本课件共有71页3转转GH基因超级小鼠基因超级小鼠第三页，本课件共有71页4转基因兔、牛、猪、羊、转基因兔、牛、猪、羊、鱼、小鼠鱼、小鼠 第四页，本课件共有71页5新加坡国立大学生物系转基因斑马鱼新加坡国立大学生物系转基因斑马鱼1.荧光鱼第
2、五页，本课件共有71页6第六页，本课件共有71页7第七页，本课件共有71页82.蜘蛛羊第八页，本课件共有71页9研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量乳酸。3.超级老鼠第九页，本课件共有71页10不怕猫的老鼠。在科学家展示的照片中，一只褐色老鼠离一只猫不到一英寸，在猫的身边嗅来嗅去。研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌面前转来转去，显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。4.无所畏惧老鼠第十页，本课件共有71页11 2003年7月11
3、日由陈系古教授领导的“人类转基因动物模型的制作”课题组历时5年，研制成功了四种转基因小鼠。其中，荧光鼠为胚胎干细胞、人类基因功能、人体组织工程和克隆器官等研究提供了基础；患白化病的小鼠转导了酪氨酸酶基因后长出了黑毛；四环素调控系统和丙肝核心抗原的转基因小鼠分别传到第四、第三代，为制备人类丙肝病毒感 染的双基因动物模型提供了父代、母代。第十一页，本课件共有71页12第十二页，本课件共有71页13第十三页，本课件共有71页14第十四页，本课件共有71页15转基因动物模型优势：转基因动物模型优势：可以从整体水平、器官水平、组织水平、可以从整体水平、器官水平、组织水平、分子水平进行多层次、全方位、深入
4、而分子水平进行多层次、全方位、深入而又系统的综合研究。又系统的综合研究。第十五页，本课件共有71页16 借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定的移转与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定的移转给后代的动物称为给后代的动物称为转基因动物。转基因动物。一、转基因动物一、转基因动物（transgenetic animaltransgenetic animal）第十六页，本课件共有71页17目的基因的来源目的基因的来源1.采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的
5、基因；采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；2.通过通过mRNA合成合成cDNA；3.人工合成的人工合成的DNA片段；片段；4.目的基因的克隆。目的基因的克隆。第十七页，本课件共有71页18u显微注射法显微注射法u病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法u胚胎干细胞法胚胎干细胞法u精子载体法精子载体法u酵母人工染色体载体法酵母人工染色体载体法u其它其它二、培育转基因动物的方法二、培育转基因动物的方法第十八页，本课件共有71页191.显微注射转基因技术显微注射转基因技术利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外利用显微操作技术转移外源基因的方法。源基因的方法。源基因
6、的方法。源基因的方法。此法转入此法转入此法转入此法转入基因长度可达数百基因长度可达数百基因长度可达数百基因长度可达数百kbkb；并能；并能；并能；并能随机地整合在受体体细胞随机地整合在受体体细胞随机地整合在受体体细胞随机地整合在受体体细胞染色体染色体染色体染色体DNADNA上，因此应用上，因此应用上，因此应用上，因此应用范围广。范围广。范围广。范围广。第十九页，本课件共有71页20 microinjection microinjection第二十页，本课件共有71页第二十一页，本课件共有71页22受精卵显微注射制备转基因动物的缺点受精卵显微注射制备转基因动物的缺点1.外外源源基基因因整整合合至
7、至基基因因组组的的效效率率很很低低，对对经经济济大大动动物物（猴、牛、羊）的整合效率更低；（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.随随机机整整合合，转转基基因因整整合合的的位位点点和和拷拷贝贝数数无无法法控控制制，造造成成转转基基因因的的表表达达差差异异很很大大，筛筛选选高高表表达达转转基基因因动动物的工作量很大；物的工作量很大；3.对对经经济济大大动动物物，由由于于需需要要大大量量的的供供体体和和受受体体，耗耗时时长、费用昂贵，受到很大的限制。长、费用昂贵，受到很大的限制。第二十二页，本课件共有71页23将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，
8、人为感染着床前后的胚胎（也滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因动物获得转基因动物的方法。的方法。2、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法第二十三页，本课件共有71页24 优点：优点：受精卵携带外源基因的阳性率高受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高第
9、二十四页，本课件共有71页25缺点：缺点：容纳大小有限容纳大小有限(10-15kb)重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外源基重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外源基因的表达因的表达 潜在致癌性潜在致癌性,载体复杂载体复杂 整合率不高整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性胚胎自我保护机制对其有抗性第二十五页，本课件共有71页263.胚胎干细胞方法胚胎干细胞方法第二十六页，本课件共有71页27 优点：优点：外源基因整合情况的可控性高。外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。
10、的稳定性。外源基因导入外源基因导入ESES细胞的方法多样，细胞鉴定细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便及筛选方便。第二十七页，本课件共有71页28 缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体第二十八页，本课件共有71页29目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。较成熟，在大动物上应用较晚。第二十九页，本课件共有71页304.精子载体导入法精子载体导入法第三十页，本课件共有71页31 5 酵母人工染色体载体法（酵母人工染色
11、体载体法（YAC）利用酵母人工染色体利用酵母人工染色体()作为载体制作转基因动物的方法。作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体,能克能克隆百万对碱基的大片段。隆百万对碱基的大片段。第三十一页，本课件共有71页32 优点：优点：保证大片段的完整性保证大片段的完整性。保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高。保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性,因而可以因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。消除或减弱基因整合后的位置效
12、应。第三十二页，本课件共有71页336、体细胞核移植法、体细胞核移植法 将外源基因导入到体细胞中将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进再将该细胞进行培养行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行选择其中带有外源基因的细胞进行扩增扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活融合并激活），），将重组胚进行体外培养或者植将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。入同步化的假孕动物的输卵管。第三十三页，本课件共有71页347.其它方法其它方法 性腺转基因方法性腺转基因方法 第三十四页，本课件
13、共有71页35总结：转基因动物的制作方法总结：转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法4、精子载体法、精子载体法5、YAC法法6、体细胞核移植法、体细胞核移植法第三十五页，本课件共有71页36u显微注射法显微注射法u病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法u胚胎干细胞法胚胎干细胞法u精子载体法精子载体法u酵母人工染色体载体法酵母人工染色体载体法u其它其它u基因打靶基因打靶二、培育转基因动物的方法二、培育转基因动物的方法第三十六页，本课件共有71页37基因打靶基因打靶利用细胞脱氧
14、核糖核酸利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)可与外源性可与外源性DNADNA同同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。一基因的技术。1 1、基因敲除（、基因敲除（gene knock outgene knock out）2 2、基因替换（、基因替换（gene knock ingene knock in）第三十七页，本课件共有71页38基因敲除（基因敲除（gene knock outgene knock out），），指外源指外源DNADNA与受体细胞基因组中与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因序列相
15、同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中,而而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因动物。获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因动物。第三十八页，本课件共有71页39基因替换（基因替换（gene knock ingene knock in），），指外源指外源DNADNA与受体基因组中特定与受体基因组中特定的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的一个基因的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的一个基因的编码区被另一个基因的编码区的拷贝所置换的基因动物。的编码区被另一个基因
16、的编码区的拷贝所置换的基因动物。第三十九页，本课件共有71页40基因打靶基因打靶1.1.基因敲除基因敲除（gene knock outgene knock out）将基因组特定内源基因定点突变将基因组特定内源基因定点突变2.2.基因替换基因替换（gene knock ingene knock in）将基因组特定内源基因进行定向重组将基因组特定内源基因进行定向重组第四十页，本课件共有71页41u显微注射法显微注射法u病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法u胚胎干细胞法胚胎干细胞法u精子载体法精子载体法u酵母人工染色体载体法酵母人工染色体载体法u其它其它u基因打靶基因打靶二、培育转基因动物的方法
17、二、培育转基因动物的方法第四十一页，本课件共有71页42三、三、转基因动物的检测转基因动物的检测第四十二页，本课件共有71页43uDNA的提取的提取uPCR/RT-PCRuSouthern杂交杂交u表达产物的检测（蛋白表达产物的检测（蛋白/下游产物）下游产物）第四十三页，本课件共有71页44Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂
18、糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。第四十四页，本课件共有71页451、改良动物品种2、生物制药3、动物模型4、异体器官移植5、基因治疗四、转基因动物的应用四、转基因动物的应用第四十五页，本课件共有71页46转基因动物的低效性转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与
19、预期不符问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题乳腺生物反应器的问题社会问题社会问题五、转基因动物研究存在的问题五、转基因动物研究存在的问题第四十六页，本课件共有71页47六、细胞转染常用方法第四十七页，本课件共有71页481.电穿孔法实现外源基因的转移电穿孔法实现外源基因的转移利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源通透性，从而使外源DNADNA转转转转移至细胞中。移至细胞中。移至细胞中。移至细胞中。此法简单、效率此法简单、效率此法简单、效率此法简单、效率较高，广泛应用于
20、培养细胞的较高，广泛应用于培养细胞的较高，广泛应用于培养细胞的较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。基因转移。基因转移。基因转移。第四十八页，本课件共有71页492.磷酸钙磷酸钙DNA共沉淀法基因转移技术共沉淀法基因转移技术这种方法是受二价金属离子能这种方法是受二价金属离子能这种方法是受二价金属离子能这种方法是受二价金属离子能促进细胞菌吸收外源促进细胞菌吸收外源促进细胞菌吸收外源促进细胞菌吸收外源DNADNA的启的启的启的启发而发展起来的。当核酸以磷发而发展起来的。当核酸以磷发而发展起来的。当核酸以磷发而发展起来的。当核酸以磷酸钙酸钙酸钙酸钙DNADNA共沉淀物的形式在共沉淀物的形式在共沉淀物的
21、形式在共沉淀物的形式在时，细胞摄取时，细胞摄取时，细胞摄取时，细胞摄取DNADNA的能力显著的能力显著的能力显著的能力显著加强。磷酸钙加强。磷酸钙加强。磷酸钙加强。磷酸钙DNADNA复合物吸附复合物吸附复合物吸附复合物吸附细胞膜被细胞内吞。细胞膜被细胞内吞。细胞膜被细胞内吞。细胞膜被细胞内吞。不适用于原代细胞（所需的不适用于原代细胞（所需的不适用于原代细胞（所需的不适用于原代细胞（所需的DNADNA浓度较高）浓度较高）浓度较高）浓度较高）,操作简便但重操作简便但重操作简便但重操作简便但重复性差复性差复性差复性差,有些细胞不适用有些细胞不适用有些细胞不适用有些细胞不适用第四十九页，本课件共有71
22、页503.脂质载体法脂质载体法将需要转移的外源将需要转移的外源将需要转移的外源将需要转移的外源DNADNA或或或或RNARNA包裹于脂质体内，由于包裹于脂质体内，由于包裹于脂质体内，由于包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，脂质体具有磷脂双层结构，脂质体具有磷脂双层结构，脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与与细胞膜类似，因此可以与与细胞膜类似，因此可以与与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外受体细胞膜融合，从而将外受体细胞膜融合，从而将外受体细胞膜融合，从而将外源源源源DNADNA转入宿主细胞。转入宿主细胞。转入宿主细胞。转入宿主细胞。这种这种这种这种方法转基因效率
23、高。方法转基因效率高。方法转基因效率高。方法转基因效率高。第五十页，本课件共有71页51第五十一页，本课件共有71页524.病毒介导的生物学方法病毒介导的生物学方法（1）逆转录病毒）逆转录病毒（RNA病毒）病毒）（2）腺病毒）腺病毒（双链（双链DNA病毒病毒）第五十二页，本课件共有71页53第五十三页，本课件共有71页54第五十四页，本课件共有71页55第五十五页，本课件共有71页56比比 利利 时时 蓝蓝 牛牛第五十六页，本课件共有71页57动物生物反应器第五十七页，本课件共有71页58 一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应
24、器（动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。器的研究最为引人注目。第五
25、十八页，本课件共有71页59一一、动物血液生物反应器动物血液生物反应器 外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。器。大家畜的血液容量较大大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。血细胞组分可通过裂解细胞获得。第五十九页，本课件共有71页60二、动物膀胱生物反应器二、动物膀胱生物反应器 外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器外源基因在膀胱中
26、表达的转基因动物生物反应器,叫叫动物膀胱生物反应器。动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。第六十页，本课件共有71页61三、动物乳腺生物反应器三、动物乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达指导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。物的乳液中获取重组蛋白。第六十一页，本课件共
27、有71页621.动物乳腺生物反应器的制备动物乳腺生物反应器的制备（1）表达载体的构建 目前用于表达载体的启动子调控元件选用动物乳蛋白基因启动子元件，主要有四类乳腺定位表达调控元件：第一类是B2乳球蛋白(BLG)，第二类是酪蛋白基因调控序列：第三类是乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列；第四类是乳清白蛋白基因调控序列。第六十二页，本课件共有71页63（2）目的基因的选择）目的基因的选择 选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰选择目的基因的基本要求是，正常情况下浓度低、翻译后修饰复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔的蛋白基复杂、其它表达体系难以表达或表达量低、应用前景广阔
28、的蛋白基因。因。第六十三页，本课件共有71页64（3）体外重组）体外重组 选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建选择好目的基因和启动子调控元件后进行体外重组，构建融合基因。融合基因。第六十四页，本课件共有71页65（4）基因转导）基因转导 将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。将构建好的重组基因用基因转导方法转移到受精卵。第六十五页，本课件共有71页66（5）胚胎移植）胚胎移植 利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体利用胚胎移植技术将制备的转基因受精卵植入待孕母体子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通过子宫内，生产转基因动物，得到转基因乳腺表达个体。通
29、过采集转基因动物的乳汁采集转基因动物的乳汁,来获得目的基因表达产物。来获得目的基因表达产物。第六十六页，本课件共有71页67（6）鉴定）鉴定 转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌转基因动物乳腺生物反应器可以从分子水平和乳腺分泌物两个方面进行鉴定。物两个方面进行鉴定。第六十七页，本课件共有71页682.动物乳腺生物反应器的优点动物乳腺生物反应器的优点u产品质量稳定产品质量稳定u产品成本低产品成本低u研制开发周期短研制开发周期短u无污染无污染u经济效益显著经济效益显著第六十八页，本课件共有71页693.动物乳腺生物反应器的应用动物乳腺生物反应器的应用u高乳汁营养价值高乳汁营养价值u生产药用蛋白生产药用蛋白 第六十九页，本课件共有71页704.动物乳腺生物反应器存在的问题动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题）伦理道德问题 第七十页，本课件共有71页感感谢谢大大家家观观看看第七十一页，本课件共有71页