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1、实验二实验二琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶电泳及DNA的纯化的纯化一、实验目的一、实验目的 1 1、掌握琼脂糖凝胶电泳分离、掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA的原理和方法的原理和方法2 2、掌握回收试剂盒纯化、掌握回收试剂盒纯化DNADNA的方法的方法DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。DNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同分子筛效应。不同DNADNA的分子量大小及构型不同，的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而电泳时的泳动率就不同，
2、从而分出不同的区带分出不同的区带。二、实验原理二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂琼脂糖的浓度糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳法分离琼脂糖凝胶电泳法分离DNADNA，主要是利用主要是利用分子筛效分子筛效应应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据而就可依据DNADNA分子的大小使其分离。该过程可以分子的大小使其分离。该过程可以通过把通过把分子量标准参照物分子量标准参照物和样品一起进行电泳而和样品一起进行电泳而得到检测。得到
3、检测。溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）为扁平状分子，在紫外光照射下为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。发射荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物，其复合物，其荧光强度与荧光强度与DNADNA的含量成正比。据此可粗略估计样的含量成正比。据此可粗略估计样品品DNADNA浓度。浓度。注意事项：注意事项：EBEB是有毒物质，切勿用手接触，更不要污染环境。是有毒物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，三、实验材料、器具及药品三、实验材料、器具及药品 电泳：电泳：实验一
4、的实验一的PCRPCR产物样品。产物样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外凝胶成像系统等。炉，紫外凝胶成像系统等。琼脂糖，琼脂糖，1XTAE1XTAE电泳缓冲液电泳缓冲液，溴化乙锭（，溴化乙锭（EBEB），），6X6X载载样缓冲液样缓冲液 纯化：纯化：回收试剂盒回收试剂盒四、实验步骤四、实验步骤 1g 琼脂糖加入琼脂糖加入100ml 1TAE电泳缓冲液中，摇匀。电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。用胶带将制胶板两端封好，用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子插入适当梳子，将溶解，将溶解
5、的琼脂糖（约的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。）倒入，室温冷却凝固。将凝胶置入电泳槽中，加将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面电泳缓冲液至液面覆盖凝胶覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。，小心垂直向上拔出梳子。用移液器吸取用移液器吸取PCR产物样品产物样品4l于封口膜上，再加于封口膜上，再加入入2l 的的6X载样缓冲液，混匀后，载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。将染色后的凝胶置于紫外凝胶成像
6、系统上，盖将染色后的凝胶置于紫外凝胶成像系统上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的的DNADNA条带。条带。将凝胶放入将凝胶放入EBEB染液中染色染液中染色5-10min,5-10min,用清水稍微用清水稍微漂洗。漂洗。v配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围分辨范围 常用的常用的电电泳泳缓缓冲液冲液4 保存备用保存备用.0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，3
7、0%甘油水溶液常用的常用的6X6X载样载样缓缓冲液冲液7、用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶。8、使用TAE缓冲液制作1琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。1.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1L进行计算(100mg=100L)。2.按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应3倍体积的NaI。4.均匀混合后55加热融化胶块。间断振荡混合，使胶块充分融化(约10分钟)。5.加入20微升的硅胶树脂，充分混匀后室温放置20分钟。6.注：
8、硅胶树脂使用前，一定要将硅胶树脂液充分搅匀。7.6.离心（10，000 rpm、1分钟）后除去上清液。8.注：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可废弃。如果回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新吸附。9.7.在Microtube中加入800L清洗液，振荡搅匀后室温静置10分钟，然后离心（10，000 rpm、1分钟），除去上清液。10.注：请确认清洗液中已经加入指定体积的100%乙醇。8.重复操作7（不需要静置10分钟）9.注：为提高DNA片段的回收效率，此时应尽量除净上清液（完全风干至不含残留的乙醇气味）10.9.加入和硅胶树脂等量（体积比）30L的灭菌蒸馏水后搅
9、匀，55 水浴中放置10分钟。10.离心（10，000 rpm、1分钟）后吸取上清液，尽量注意不要吸取硅胶树脂。此回收上清液即可为DNA回收溶液。11.几点注意事项加以说明：几点注意事项加以说明：加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品孔中的气泡。应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）作业1、电泳检测实验一的PCR结果2、PCR产物的纯化3、实验结果分析