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1、关于色谱分离原理第一页，本课件共有144页18-1 概述色谱发展简史色谱法在工业生产和科学研究中的作用色谱法的定义与分类第二页，本课件共有144页一、一、色谱发展简史色谱发展简史色谱法的出现 色谱法的发展 色谱法的现状和未来？第三页，本课件共有144页色谱法的出现1903年 Tswett（茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法第四页，本课件共有144页色谱法的出现1903年 Tswett（茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法第五页，本课件共有144页1906年 Tswett 的研究成果发表Chromatographie(德语）Chromatography(英语）色谱玻璃管=“色谱柱”colu
2、mn碳酸钙=“固定相”stationary phase石油醚=“流动相”mobile phase第六页，本课件共有144页色谱法的发展色谱法的发展1931年 Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了-,-,-胡萝卜素等60多种植物色素1941年 Martin 和 Synge建立了液液分配色谱法并提出气相色谱的设想1952年 Martin等发明了气液色谱法1952年 Martin 和 Synge 获得诺贝尔化学奖第七页，本课件共有144页A.J.P.Martin第八页，本课件共有144页R.L.M.Synge第九页，本课件共有144页气相色谱仪气相色谱仪第十页，本课件共有144页色谱法的发展色谱法的发
3、展1957年Goley开创了毛细管气相色谱1960年代末出现高效液相色谱法1980年代超临界流体色谱得到发展1980年代Jorgeson发展了高效毛细管电泳1990年代后期毛细管电色谱得到重视和发展第十一页，本课件共有144页高效液相色谱仪高效液相色谱仪第十二页，本课件共有144页毛细管电泳仪毛细管电泳仪第十三页，本课件共有144页液相色谱分离速度的变化液相色谱分离速度的变化第十四页，本课件共有144页色谱法的现状和未来色谱法的现状和未来气相色谱和高效液相色谱发展最好超临界流体色谱处于失利地位毛细管电泳与毛细管电色谱处于研究阶段,进入部分应用领域第十五页，本课件共有144页气相色谱和高效液相色
4、谱发展最好气相色谱和高效液相色谱发展最好气相色谱仪及备件全球市场:约10亿美元/年;3-4%年增长高效液相色谱仪及备件6-8%年增长第十六页，本课件共有144页超临界流体色谱处于失利地位发展晚于GC和HPLC虽然具有一些独特用途，但大多数功能可由GC和HPLC代替第十七页，本课件共有144页毛细管电泳与毛细管电色谱为基因组学研究作出了杰出贡献目前存在的主要问题：分析结果偏差大比HPLC大一个数量级机遇：分离分析生物大分子第十八页，本课件共有144页成功的定量分析方法应具备的基本条件易于使用，操作费用低能够得到准确、可重复的定量结果要能够解决至少一个分析化学中的重要问题第十九页，本课件共有144
5、页 色谱法在工业生产和科学研究中的作用1930-1940年代为分离复杂的生物组成发挥了独特作用1950年代为石油工业的发展作出了贡献1960-1970年代成为石油化工、化学工业等部门的分析检测手段目前，色谱法已成为生命科学、医药科学、环境科学、材料科学、食品科学、法庭科学以及航天科学等研究领域的重要手段第二十页，本课件共有144页面临的问题当今化学、生命科学、环境科学等研究领域中备受人们关注的热点问题，如蛋白质组学、代谢组学中的分离分析问题的解决，医学中的药理、药物代谢研究和疾病标记物研究，天然产物有效成分的分离分析，食品安全，毒品、兴奋剂等快速检测等等。复杂体系第二十一页，本课件共有144页
6、样品制备检测GC,HPLC,CE,CEC,micro-TASSP(M)E 等分离第二十二页，本课件共有144页发展趋势进一步发展高效分离技术小型化、微型化、自动化各种联用技术样品处理技术高通量第二十三页，本课件共有144页超高效液相色谱（UPLC）chromatogram obtained under isocraticconditions on a 43 cm long capillary column packed with1.0 m non-porous C18 particles(Eichrom Scientific).第二十四页，本课件共有144页超高效液相色谱（UPLC）The s
7、ample was run using constant-flow pumps at 52 000 psi on a 38cm long capillary packed with 1.0 m C18 particles.第二十五页，本课件共有144页芯片液相色谱ZORBAX 300SBC18 5 m particlesH.-F.Yin et al.,presented at the 18th International Symposium onMicroscale Separations and Analysis,HPCE,San Diego,January 2003.第二十六页，本课件共有
8、144页多肽分离图多肽分离图第二十七页，本课件共有144页自动化自动化第二十八页，本课件共有144页分离分析新技术简介分离分析新技术简介毛细管电泳全二维气相色谱液相色谱气相色谱联用液相色谱液相色谱联用色谱质谱联用色谱质谱联用*样品处理技术第二十九页，本课件共有144页毛细管电泳毛细管电泳 毛细管电泳是指溶质以电场为推动力，在毛细管中按淌度差别而实现的高效、快速分离的新型电泳技术。第三十页，本课件共有144页高效毛细管电泳的特点与传统电泳技术及现代色谱技术相比：仪器简单、操作方便、易自动化分离效率高(105-107 块/m)、分析速度快操作模式多实验成本低，消耗少重现较差，分析结果误差大重现较差
9、，分析结果误差大第三十一页，本课件共有144页毛细管电泳示意图第三十二页，本课件共有144页多维气相色谱第三十三页，本课件共有144页全二维气相色谱第三十四页，本课件共有144页全二维气相色谱全二维气相色谱第三十五页，本课件共有144页液相色谱气相色谱联用液相色谱气相色谱联用第三十六页，本课件共有144页液相色谱气相色谱联用液相色谱气相色谱联用橄榄油有机酸第三十七页，本课件共有144页液相色谱液相色谱联用液相色谱液相色谱联用第三十八页，本课件共有144页液相色谱液相色谱联用模式同模式 LCLC多模式 LCLC全二维 LC(i)样品的每一部分均经过二维分离。(ii)样品的所有组分等比例经过二维分
10、离。(iii)第一维具备分离能力。第三十九页，本课件共有144页全二维 LC第四十页，本课件共有144页固相微萃取技术Fig.1-2 SPME construction第四十一页，本课件共有144页固相微萃取技术Fig.1-5 Desorption chamber for coupling SPME to HPLCFig.1-6 Commercially available interface of SPME-HPLC(Supelco)第四十二页，本课件共有144页固相微萃取技术第四十三页，本课件共有144页固相微萃取技术第四十四页，本课件共有144页固相微萃取技术Monolithic cap
11、illary专利申请号：200520095986.1第四十五页，本课件共有144页固相微萃取技术第四十六页，本课件共有144页三、色谱法的定义与分类色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相（固定相和流动相）间的分配系数的差别分配系数的差别，当两相作相对运动时，各物质随流动相运动，并在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。第四十七页，本课件共有144页色谱法的分类按固定相的使用形式按流动相的物理状态按分离机理按色谱操作方式不同按流动相和固定相的极性不同按用途不同分类第四十八页，本课件共有144页按固定相的使用形式分类柱色谱 (column chromatography)平板色
12、谱(planar chromatography)纸色谱(paper chromatography)薄层色谱(thin layer chromatography)第四十九页，本课件共有144页按流动相的物理状态分类气相色谱气固色谱气液色谱 液相色谱液液色谱液固色谱超临界流体色谱第五十页，本课件共有144页按分离机理分类分配色谱(partition chromatography)吸附色谱(adsorption chromatography)离子交换色谱(ion exchange chromatography)排阻色谱(size exclusion chromatography)亲和色谱(affin
13、ity chromatography)第五十一页，本课件共有144页按色谱操作方式不同分类迎头色谱(frontal chromatography)顶替色谱(displacement chromatography)洗脱色谱(elution chromatography)第五十二页，本课件共有144页洗脱色谱（冲洗）这是色谱过程最常用的方法。将试样加入色谱柱的入口端，然后用流动相冲洗柱子，由于各组分在固定相上的吸附（或溶解）能力不同，于是被流动相带出的时间不同。第五十三页，本课件共有144页按流动相和固定相的极性不同正相色谱（流动相极性小于固定相）反相色谱（流动相极性大于固定相）第五十四页，本课件
14、共有144页按用途不同分类分析型色谱制备型色谱流程色谱第五十五页，本课件共有144页18-2 色谱基本术语多环芳烃HPLC色谱图第五十六页，本课件共有144页一、基线（baseline)仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值第五十七页，本课件共有144页二、峰高h第五十八页，本课件共有144页三、保留值死时间(tM)和保留时间(tR)第五十九页，本课件共有144页三、保留值三、保留值 死体积死体积(VM)和保留体积和保留体积(VR)死体积死体积:色谱柱中不被固定相占据的空间以及进样系统管道和检测系统的总体积 （VM=tM Fc）保留体积保留体积:从注射样品到色谱峰顶出现时，所通过色谱系统的流
15、动相体积（VR=tR Fc）第六十页，本课件共有144页三、保留值调整保留时间(tR)和调整保留体积(VR)tR=tR-tM(溶质在固定相中停留的总时间)VR=VR-VM第六十一页，本课件共有144页三、保留值相对保留值(2,1)relative retention在一定色谱条件下两个组分的调整保留时间（体积）的比2,1=tR2/tR1分离因子()separation factor=tR2/tR1第六十二页，本课件共有144页四、溶质保留方程保留因子k(retention factor)容量因子(capacity factor)（分配比）在平衡状态下组分在固定相与流动相中的质量之比k=ns/n
16、m 第六十三页，本课件共有144页四、溶质保留方程溶质通过色谱柱的速度或保留值的大小是由每一瞬间该溶质在流动相中的分子分数决定的。设流动相的平均流速为 u，溶质 x 谱带在色谱柱中的移动速度为 uxux=RuR为溶质 x 在流动相中分子数与总分子数之比第六十四页，本课件共有144页四、溶质保留方程流动相平均流速u和溶质谱带移动速度ux 第六十五页，本课件共有144页四、溶质保留方程 溶质保留方程 kt第六十六页，本课件共有144页四、溶质保留方程分离因子 =tR2/tR1=k2/k1分配系数 K称为相比*第六十七页，本课件共有144页四、溶质保留方程根据保留体积与保留时间的关系k=(VR-VM
17、)/VMVR=KVS+VM第六十八页，本课件共有144页假如一个溶质的分配比为0.2，则它在色谱柱的流动相中的百分率是多少？k=ns/nm=0.2 nm=5nsnm/n100%=nm/(nm+ns)100%=83.3%习习 题题第六十九页，本课件共有144页在某色谱条件下，组分A的保留时间为18min，组分B的保留时间为25.0min，其死时间为2min，试计算：（1）组分B对A的相对保留值；（2）组分A,B的保留因子；（3）组分B通过色谱柱在流动相、固定相保留的时间是多少？各占保留时间分数为多少？解：（1）组分B对A的相对保留值 rB/A=tB/tA=(25-2)/(18-2)1.44（2）
18、组分A,B的保留因子 rA=(18-2)/2=8.0 rB=(25-2)/2=11.5（3）组分B通过色谱柱在流动相保留的时间是tM=2min；在固定相保留的时间tB=25-2=23min。各占保留时间分数的8和92。第七十页，本课件共有144页五、区域宽度标准偏差 半峰宽 Y1/2基线宽度 Y第七十一页，本课件共有144页色谱流出曲线标准偏差半峰宽基线宽度第七十二页，本课件共有144页半峰宽度、基线宽度与标准偏差的关系第七十三页，本课件共有144页18-3 色谱法基本理论色谱分离过程塔板理论速率理论第七十四页，本课件共有144页色谱分离过程第七十五页，本课件共有144页改进分离的两种途径第七
19、十六页，本课件共有144页塔板理论(Martin&Synge)色谱柱是由一系列连续的、相等的水平理论塔板组成在每一块塔板(高度H)中溶质可以在流动相与固定相中迅速达到平衡。H称为理论塔板高度。流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进入的流动相体积为一个塔板体积。所有组分开始时存在于第0号塔板上，且试样的纵向扩散可忽略。分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。第七十七页，本课件共有144页色谱柱长：色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
20、理论塔板数与色谱参数之间的关系为：塔板理论(Martin&Synge)第七十八页，本课件共有144页流出曲线方程当塔板数 n 50,色谱流出曲线趋于正态分布c0 进样浓度，c为时间t时柱出口浓度第七十九页，本课件共有144页色谱流出曲线第八十页，本课件共有144页理论塔板数与理论塔板高度由塔板理论可以得到理论塔板数 n 与色谱峰半峰宽度或基线宽度的关系色谱峰越窄，理论塔板数越多，理论塔板高度越小，柱效能越高n 和 H可作为描述柱效能的指标第八十一页，本课件共有144页有效塔板数和有效塔板高度同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当用塔板数和塔板高度表示柱效能时，必须说明对什么物质而言 第八十
21、二页，本课件共有144页塔板理论的成功与不足成功点：流出曲线的形状浓度极大点的位置计算和评价柱效能的指标（n,H)第八十三页，本课件共有144页塔板理论的成功与不足不足：无法回答的问题1.实验参数如填料的大小、分子结构、温度等对色谱峰形以及塔板数和塔板高度的影响2.理论塔板高度与流速有关第八十四页，本课件共有144页速率理论(van Deemter)色谱峰展宽的因素速率理论方程其它因素第八十五页，本课件共有144页（一）色谱峰展宽的因素涡流扩散（多流路扩散）分子扩散（纵向扩散）传质阻力流动相传质阻力固定相传质阻力第八十六页，本课件共有144页涡流扩散第八十七页，本课件共有144页涡流扩散 dp
22、 是填料的平均直径 填充不规则因子 L 色谱柱长度第八十八页，本课件共有144页分子扩散（纵向扩散）第八十九页，本课件共有144页分子扩散气体分子扩散对色谱峰宽的贡献 弯曲因子 Dg溶质在气相中的扩散系数 u 流动相流速第九十页，本课件共有144页传质阻力物质系统由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。流动相传质阻力固定相传质阻力第九十一页，本课件共有144页传质阻力第九十二页，本课件共有144页流动相传质阻力 k 保留因子第九十三页，本课件共有144页固定相传质阻力 df 固定液的液膜厚度 Dl溶质在液膜中的扩散系数第九十四页，本课件共有144页（
23、二）气相色谱速率理论方程正态分布色谱峰的理论塔板高度可以定义为每单位柱长的方差第九十五页，本课件共有144页气相色谱速率理论方程第九十六页，本课件共有144页流速对理论塔板高度的影响第九十七页，本课件共有144页（三）液相色谱速率理论方程气相色谱与液相色谱的区别：溶质在液相中的扩散系数比在气相中小105倍液体粘度比气体约大102倍液体的表面张力比气体约大104倍液体密度比气体约大103倍液体不可压缩第九十八页，本课件共有144页流动区域中的流动相传质阻力第九十九页，本课件共有144页流动区域中的流动相传质阻力Cm:与填充性质有关的因子第一百页，本课件共有144页流动相滞留区的传质阻力第一百零一
24、页，本课件共有144页流动相滞留区的传质阻力Csm:微孔中流动相及保留因子有关的常数第一百零二页，本课件共有144页液相色谱速率理论方程第一百零三页，本课件共有144页液相色谱速率理论方程第一百零四页，本课件共有144页不同粒径填料色谱柱的H-u曲线第一百零五页，本课件共有144页液相色谱分离速度的变化第一百零六页，本课件共有144页（三）其它因素 色谱峰的不对称性 柱外效应第一百零七页，本课件共有144页吸附等温线KVR=KVS+VM第一百零八页，本课件共有144页不对称因子(Asymmetry factor)As=A/BAs 1 拖尾色谱峰；As 1 前伸色谱峰第一百零九页，本课件共有14
25、4页柱外效应除了色谱柱中发生的谱带展宽外，柱外区域也会造成谱带的展宽，这种现象称作柱外效应。主要原因：柱外体积进样器体积检测器体积一些连接管道体积第一百一十页，本课件共有144页柱外效应第一百一十一页，本课件共有144页柱外效应VR 增大时，柱外效应的重要性减低n 较大时，柱外效应有较大的影响第一百一十二页，本课件共有144页柱效和选择性对分离的影响柱效和选择性对分离的影响柱效和选择性对分离的影响第一百一十三页，本课件共有144页色谱分离效果色谱峰的位置-色谱热力学色谱峰的宽窄-色谱动力学第一百一十四页，本课件共有144页18-4 分离度（分辨率）分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值
26、之比第一百一十五页，本课件共有144页不同分离度时色谱峰的分离程度第一百一十六页，本课件共有144页影响分离度的因素色谱分离基本方程式I 柱效因子项；II 分离因子项；III 容量因子项第一百一十七页，本课件共有144页色谱分离基本方程式的推导设两相近的色谱峰基线宽度相等，则有第一百一十八页，本课件共有144页色谱分离基本方程式的推导第一百一十九页，本课件共有144页色谱分离基本方程式的推导由溶质保留方程得分离因子为：=k2/k1tR=k tM+tM 第一百二十页，本课件共有144页色谱分离基本方程式I 柱效因子项；II 分离因子项；III 保留因子项第一百二十一页，本课件共有144页I 柱效
27、因子项分离度与柱效的关系 Rs n1/2增加柱长可提高分离度（分析时间增加，柱压降增大）减小色谱柱的H值，可提高分离度（有效途径）第一百二十二页，本课件共有144页II 分离因子项分离度与色谱柱选择性的关系=1，Rs=0 不能分离越大，分离度越大，分离效果越好Rs确定且已知，可由色谱分离基本方程式计算所需理论塔板数第一百二十三页，本课件共有144页II 分离因子项第一百二十四页，本课件共有144页III 保留因子项第一百二十五页，本课件共有144页液相色谱流动相对分离的影响第一百二十六页，本课件共有144页基本分离方程的应用例有一根1m长的色谱柱，分离组分1和2，得到下列色谱图。图中横坐标l为
28、记录纸走纸距离。若欲得到Rs=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱应加到多长？第一百二十七页，本课件共有144页解先求分离因子：=tR2/tR1=(49-5)/(45-5)=1.1求分离度：Rs=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)=(49-45)/5=0.8求有效塔板数：n有效=16(tR/Y)2=16(49-5)/5)2=1239若要使R=1.2,所需有效塔板数为：n有效=16 Rs2(/(-1)2n有效=16 1.22（1.1/0.1)2=2788所需柱长为：L=2788/1239=2.25 m第一百二十八页，本课件共有144页18-5 色谱定量分析方法在一定的操作条件下，分析组分
29、i的质量（mi）或在流动相中的浓度与检测器的信号（峰面积Ai 或峰高 hi）成正比：f 绝对校正因子色谱定量的依据第一百二十九页，本课件共有144页准确测量峰面积（峰高）准确求出比例系数（校正因子）根据上式正确选定定量计算方法，将测得组分的峰面积（峰高）换算组分含量第一百三十页，本课件共有144页色谱定量分析方法峰面积的测量方法定量校正因子几种常用的定量计算方法第一百三十一页，本课件共有144页峰面积的测量方法峰高乘半峰宽法A=1.065 h Y1/2峰高乘平均峰宽法A=h(Y0.15+Y0.85)/2(不对称色谱峰）积分仪（色谱工作站）第一百三十二页，本课件共有144页定量校正因子（1）绝对
30、校正因子绝对校正因子受仪器及操作条件的影响大，不易准确测定第一百三十三页，本课件共有144页定量校正因子（2）相对校正因子组份i 与基准物 s的绝对校正因子之比常用基准物：苯（热导池检测器）正庚烷（氢焰检测器）第一百三十四页，本课件共有144页几种常用的定量计算方法归一化法内标法内标标准曲线法外标法第一百三十五页，本课件共有144页归一化法要求：试样中所有组分都能流出色谱柱优点：简便、准确；进样量、流速等操作条件对分析结果影响较小第一百三十六页，本课件共有144页内标法将一定量的试样中不含有的纯物质作为内标物，加入准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上相应的峰面积比，求出某组
31、分的含量。特点：适合于所有组分不能全部出峰的试样操作条件变化引起的误差小，分析结果较准确第一百三十七页，本课件共有144页内标法计算公式第一百三十八页，本课件共有144页试样中不存在的纯物质加入的量应接近被测组分要求内标物的色谱峰位于被测组分附近，或几个被测组分色谱峰之间，并与这些组分完全分离内标物与被测组分的物理及物理化学性质相近内标物的选择第一百三十九页，本课件共有144页内标标准曲线法由内标法发展而来。若称量同样量的试样，加入恒定量的内标物中，则有：第一百四十页，本课件共有144页内标标准曲线法第一百四十一页，本课件共有144页内标标准曲线法优点：不必测定校正因子不需要严格定量进样可减小操作条件变化引起的误差第一百四十二页，本课件共有144页外标法第一百四十三页，本课件共有144页感感谢谢大大家家观观看看第一百四十四页，本课件共有144页