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1、关于细胞重组与克隆技术(2)第一页，本课件共有70页（一）特点与意义（一）特点与意义 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。细胞重组技术将细胞融合技术与细的装配过程。细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。尤其是细胞重组结合基的杂种细胞提供了可能。尤其是细胞重组结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，因
2、此细胞重组技术现已成为现代生生新的产物，因此细胞重组技术现已成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。只有了解了物工程中令人瞩目的热点课题之一。只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞和功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要义。器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要义。第二页，本课件共有70页（二）细胞重组技术（二）细胞重组技术 一般而言，一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三
3、种：细胞重组的方式基本分为以下三种：(1)胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。(2)微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。(3)胞质体与核体重新组合形成重组细胞。胞质体与核体重新组合形成重组细胞。胞质体是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。胞质体是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微细胞又可被称为微核体，是指含有一条或几条微细胞又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体染色体(即只含一部分基因组即只含一部分基因组)，外有一薄层细胞，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。胞质体和微细胞与质和一个完整质膜的核质体。胞质体和微细胞与完
4、整细胞融合后就能重组产生相应的杂合体。胞完整细胞融合后就能重组产生相应的杂合体。胞质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功地生存下去。型细胞，在适宜条件下能成功地生存下去。第三页，本课件共有70页 上面第三种方法是一种非常重要的细胞重组技上面第三种方法是一种非常重要的细胞重组技术。它是利用显微操作技术将一个细胞的核移植术。它是利用显微操作技术将一个细胞的核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核(细细胞质胞质)进行交换，从而可能创造无性杂交生物新进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种
5、的一项技术。涉及的细胞核质分离技术是把品种的一项技术。涉及的细胞核质分离技术是把完整细胞的细胞核和细胞质用特殊方法分离开来，完整细胞的细胞核和细胞质用特殊方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来。也可用紫外线或把细胞核从细胞质中吸取出来。也可用紫外线照射把细胞中的核杀死，再用于细胞重组。照射把细胞中的核杀死，再用于细胞重组。第四页，本课件共有70页 1.显微操纵术显微操纵术 对于活细胞进行细胞器的拆合必须借助于显对于活细胞进行细胞器的拆合必须借助于显微操纵术，这是一项十分精细的操作技术。一般微操纵术，这是一项十分精细的操作技术。一般是在显微解剖镜下，将细胞置于消毒的培养液中，是在显微解剖镜下
6、，将细胞置于消毒的培养液中，同时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以同时在器皿的周围围以冰块或置于冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置显微显微操作仪，用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微操作仪，用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑去细胞核，人热电偶等斜插入细胞中去，可以挑去细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。用这种仪器能够进行细胞各部分的解生理实验。用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的剖、细胞各部分物质的抽取和移植
7、、各种物质的注入、测量微电位的变化等等。注入、测量微电位的变化等等。具体操作如下图：具体操作如下图：第五页，本课件共有70页第六页，本课件共有70页第七页，本课件共有70页第八页，本课件共有70页第九页，本课件共有70页第十页，本课件共有70页 2.细胞分离技术细胞分离技术 分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群。这些性质包括：细胞群。这些性质包括：(1)细胞大小。细胞大小。(2)细胞密度。细胞密度。(3)细胞表面电荷。细胞表面电荷。(4)细胞表面标志细胞表面标志(亲
8、外源凝结素和抗体亲外源凝结素和抗体)等。等。(5)细胞中一个或多个成分的荧光强弱。细胞中一个或多个成分的荧光强弱。(6)细胞对其他介质的吸附作用细胞对其他介质的吸附作用 第十一页，本课件共有70页 经常采用的细胞分离方法如下：经常采用的细胞分离方法如下：(1)梯度沉降分离法梯度沉降分离法 主要是根据细胞大小不同分离细胞。细胞在单位重主要是根据细胞大小不同分离细胞。细胞在单位重力作用下，通过密度介质，或在低离心力作用下通过力作用下，通过密度介质，或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降。由于细胞大小不同，沉降速度不梯度密度溶液沉降。由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞大，沉降快。常采用适当的分离介
9、质形成一同，细胞大，沉降快。常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液，这些介质主要有：血清、蔗糖等。定的梯度密度溶液，这些介质主要有：血清、蔗糖等。(2)等密度沉降分离法等密度沉降分离法 主要是根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密主要是根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后到达与其度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分
10、离的。种密度介质交界面上，从而达到分离的。第十二页，本课件共有70页 (3)流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法 这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50m的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以含有一个细胞，以10m/s的速度喷出。的速度喷出。第十三页，本课件共有70页3.细胞破碎方法细胞破碎方法 细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方细胞器的分离需
11、要将组织细胞破碎，常用的方法包括：法包括：(1)超声波破碎法超声波破碎法 原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。缺点是破冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。子不宜采用。(2)反复冻融法反复冻融法 使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱(-70)或液氮罐内冻结后，在或液氮罐内冻结后，在37复温融化，重复复温融
12、化，重复34次操作使细胞壁破碎。次操作使细胞壁破碎。第十四页，本课件共有70页 (3)化学裂解法化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎。由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞完全破碎。由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。裂解后应注意清除化学裂解剂。(4)高速组织捣碎法高速组织捣碎法 主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的主要借助高速组织捣碎机使细胞
13、被高速旋转的叶片破碎。由于也会发热，可能导致分离物的降叶片破碎。由于也会发热，可能导致分离物的降解，因此不能时间过长，必要时可使用循环水冷解，因此不能时间过长，必要时可使用循环水冷却。却。第十五页，本课件共有70页 4.细胞器的分离细胞器的分离 为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗些组分。常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用
14、以上介绍的沉降分离法胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。实现分级分离。第十六页，本课件共有70页 下面以白鼠细胞核、线粒体的制备为例详细介绍一下下面以白鼠细胞核、线粒体的制备为例详细介绍一下细胞器的分离：细胞器的分离：将饥饿将饥饿24h的大白鼠击昏、断颈放血处死，破腹取出肝组的大白鼠击昏、断颈放血处死，破腹取出肝组织，浸入生理盐水中，放在匀浆器中在冰浴条件下进行匀浆。织，浸入生理盐水中，放在匀浆器中在冰浴条件下进行匀浆。用数层经过少量蔗糖溶液湿润的尼龙网过滤，移入离心管中，用数层经过少量蔗糖溶液湿润的尼龙网过滤，移入离心管中，在低温离心机中离心获得沉淀。将沉淀用在低温离心机
15、中离心获得沉淀。将沉淀用5倍体积倍体积0.34molL的蔗糖与的蔗糖与0.5mmolL的的Mg(Ac)2混悬。用长针头注射器在混悬。用长针头注射器在混悬液下加入混悬液下加入4倍体积倍体积0.88molL的蔗糖与的蔗糖与0.5mmolL的的Mg(Ac)2溶液，而且尽量使两种溶液明显分层。以溶液，而且尽量使两种溶液明显分层。以1500rmin离心离心1520min，弃去上清液，沉淀即为经纯化的细胞弃去上清液，沉淀即为经纯化的细胞核。核。将分离细胞核时收集的上清液以将分离细胞核时收集的上清液以10000rmin离心离心l0min。收集沉淀，用预先冷却的收集沉淀，用预先冷却的0.25 mol L蔗糖溶
16、液悬浮，蔗糖溶液悬浮，10000rmin离心离心l0min，反复两次，得到线粒体。反复两次，得到线粒体。第十七页，本课件共有70页 5.胞质体、核体和微细胞的制备胞质体、核体和微细胞的制备 (1)胞质体胞质体 20世纪世纪60年代中期，卡特年代中期，卡特(Catter)发现用细发现用细胞松弛素胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。普处理体外培养细胞能诱发其排核。普雷斯科特雷斯科特(Prescott)借助细胞松弛素的这种作借助细胞松弛素的这种作用，结合高速离心得到了胞质体。用，结合高速离心得到了胞质体。制取胞质体的容器各异，可用玻璃片、塑料制取胞质体的容器各异，可用玻璃片、塑料片、离心管、培养
17、皿、培养瓶等，需在灭菌恒片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在灭菌恒温培养室中进行。适宜的温度、细胞松弛素温培养室中进行。适宜的温度、细胞松弛素B的的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度等因素都是获得纯度大、得率高的胞细胞密度等因素都是获得纯度大、得率高的胞质体至关重要的因素。质体至关重要的因素。第十八页，本课件共有70页 (2)核体核体 与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为有质膜，称为“核体核体”。核体能重新再生其胞质核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。为了生产大量的核体，部分，继续
18、生长、分裂。为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。通过去核前作预离心，可去除贴壁不和胞质体。通过去核前作预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。也可在去核处理后，从离心管底牢的完整细胞。也可在去核处理后，从离心管底部收集样品，接种于培养皿内，温育部收集样品，接种于培养皿内，温育12h，由于由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复1-2次，可使核体的纯度高达次，可使核体的纯度高达99。第十九页，本
19、课件共有70页(3)微细胞微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有一个或数个染色体的有一个或数个染色体的DNA，也是细胞拆合工程也是细胞拆合工程的一种有用材料。的一种有用材料。用上述方法从活细胞中拆
20、散出来的胞质体、核用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇学物质如聚乙二醇(PEG)等融合因子，经过一段时等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。第二十页，本课件共有70页 6.细胞器拆合重组举例细胞器拆合重组举例 细胞器种类很多，分离与纯化较容易。对于植细胞器种类很多，分离与纯化较容易。对于植物而言，目前研究较多的是叶绿体和线粒体的移物而
21、言，目前研究较多的是叶绿体和线粒体的移植。植。叶绿体能进行光合作用，把太阳能转变为化学叶绿体能进行光合作用，把太阳能转变为化学能。如果能把高光合效率作物的叶绿体移到低光能。如果能把高光合效率作物的叶绿体移到低光合效率作物中，就可使低光合效率作物变为高光合效率作物中，就可使低光合效率作物变为高光合效率作物，从而达到增产的目的。叶绿体移植合效率作物，从而达到增产的目的。叶绿体移植的方法是：将分离纯化的叶绿体与原生质体一道的方法是：将分离纯化的叶绿体与原生质体一道培养，通过细胞的胞饮作用将叶绿体摄入原生质培养，通过细胞的胞饮作用将叶绿体摄入原生质体，经过培养，原生质再育成完整的植株。体，经过培养，原
22、生质再育成完整的植株。第二十一页，本课件共有70页 线粒体普遍存在于各种真核细胞中，有自己的线粒体普遍存在于各种真核细胞中，有自己的遗传基因，能够合成一些蛋白质。线粒体的移植，遗传基因，能够合成一些蛋白质。线粒体的移植，可以传递遗传信息，改变受体细胞的某些特征，可以传递遗传信息，改变受体细胞的某些特征，如抗药性和雄性不育性等。线粒体的分离主要采如抗药性和雄性不育性等。线粒体的分离主要采用差速离心分离法。线粒体的移植方法较多，有用差速离心分离法。线粒体的移植方法较多，有微注射、载体转移以及胞饮摄入等。微注射、载体转移以及胞饮摄入等。第二十二页，本课件共有70页二二.克隆技术克隆技术 (一一)克隆
23、的定义克隆的定义 真正意义的克隆是指一种实现无性繁殖的操真正意义的克隆是指一种实现无性繁殖的操作。其理论基础是细胞的全能性，关键技术是细作。其理论基础是细胞的全能性，关键技术是细胞核移植技术。胞核移植技术。克隆来源于英语克隆来源于英语“clone”或或“cloning”的的音译，起源于希腊文音译，起源于希腊文“Klone”，原意是用原意是用“嫩嫩枝枝”或或“插条插条”繁殖。曾译为无性生殖或无性繁繁殖。曾译为无性生殖或无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂而形成的纯细胞系，殖，即由同一个祖先细胞分裂而形成的纯细胞系，这个细胞系每个细胞的基因彼此是相同的。这个细胞系每个细胞的基因彼此是相同的。第二十三页
24、，本课件共有70页第二十四页，本课件共有70页l 随着分子生物学的发展，通过核移植与基因随着分子生物学的发展，通过核移植与基因工程等技术也可获得无性系，于是人们把实现无工程等技术也可获得无性系，于是人们把实现无性繁殖的操作称之为克隆，克隆由名词转化为动性繁殖的操作称之为克隆，克隆由名词转化为动词。词。l 克隆克隆=复印？复印？第二十五页，本课件共有70页(二二)克隆的相关理论基础克隆的相关理论基础 1.生物的生殖方式可以分为有性生殖和无性生物的生殖方式可以分为有性生殖和无性生殖两大类。无性生殖是一种低级的生殖方式，生殖两大类。无性生殖是一种低级的生殖方式，如微生物等低等生物多采取自行分裂的方式
25、繁如微生物等低等生物多采取自行分裂的方式繁殖。殖。2.植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。第二十六页，本课件共有70页 3.细胞要么保持细胞要么保持“全能全能”，使各种机能的发展，使各种机能的发展受到局限而维持在低水平上，要么牺牲受到局限而维持在低水平上，要么牺牲“全能全能”而特化，以大大提高某种功能的效率。此二者必而特化，以大大
26、提高某种功能的效率。此二者必选其一。在细胞进化的过程中，单细胞生物选择选其一。在细胞进化的过程中，单细胞生物选择了前者，高等生物则选择了后者。了前者，高等生物则选择了后者。4.从理论上讲，任何一个细胞都含有其生物体从理论上讲，任何一个细胞都含有其生物体基因组的全部基因，因此都可以被克隆。但实际基因组的全部基因，因此都可以被克隆。但实际上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。植物细胞全能性获得了充分的论证。在此工的。植物细胞全能性获得了充分的论证。在此基础上，植物
27、的组织培养技术迅速发展起来。基础上，植物的组织培养技术迅速发展起来。第二十七页，本课件共有70页 5.用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。也期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。这种对动物细胞全能术成功克隆出了许多动物。这种对动物细胞全能性的认识自性的认识自1997年后得到了改变，首只体细胞克年后得到了改变，首只体细胞克隆
28、动物隆动物“多莉多莉”羊的成功证明了成熟的体细胞也羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊具有全能性。后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分证明高度分化的细胞核仍具有全的成功，更充分证明高度分化的细胞核仍具有全能性。自此，人们对细胞全能性有了全新的认识。能性。自此，人们对细胞全能性有了全新的认识。第二十八页，本课件共有70页(三三)克隆的技术方法克隆的技术方法 目前，克隆技术最成功的应用体现在克隆目前，克隆技术最成功的应用体现在克隆动物的培育上。对于哺乳动物的克隆，长期以动物的培育上。对于哺乳动物的克隆，长期以来有些习惯上或认识上的误区，如将胚胎分割来有些习
29、惯上或认识上的误区，如将胚胎分割也当作克隆，其实不然。这应该属于胚胎工程也当作克隆，其实不然。这应该属于胚胎工程的范畴。下面将重点介绍的克隆主要是指以细的范畴。下面将重点介绍的克隆主要是指以细胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术。胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术。动物克隆技术路线如下图：动物克隆技术路线如下图：第二十九页，本课件共有70页第三十页，本课件共有70页1.细胞核移植细胞核移植(1)定义定义 细胞核移植技术是一种利用显微操作技术细胞核移植技术是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得到
30、的核成熟卵内的精细技术。细胞核移植所得到的杂种称为核质杂种。根据细胞核移植对象的不杂种称为核质杂种。根据细胞核移植对象的不同可分为胚胎细胞核移植、体细胞核移植等。同可分为胚胎细胞核移植、体细胞核移植等。第三十一页，本课件共有70页(2)发展历史发展历史 第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯施佩曼博士。施佩曼博士。他构想了一个他构想了一个“奇异的实验奇异的实验”：把一个卵细胞的：把一个卵细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个
31、卵细胞中。但由于技术等方胎的细胞核放入这个卵细胞中。但由于技术等方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。法。1952年，美国人罗伯特，布里格斯年，美国人罗伯特，布里格斯TJ金金首先利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。首先利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。1958年到年到1962年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内年，英国剑桥大学利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。该过胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。该过程的图解如图程的图解如图8-1。第三十二页，本课件共有70页 第三十三页，本课件共有70页国外首次克隆成功哺乳动物的文献报
32、道列于下表：国外首次克隆成功哺乳动物的文献报道列于下表：第三十四页，本课件共有70页国内首次克隆成功哺乳动物的文献报道列于下表：国内首次克隆成功哺乳动物的文献报道列于下表：第三十五页，本课件共有70页 经过大量低等动物实验成功之后，研究人员经过大量低等动物实验成功之后，研究人员开始进行哺乳动物的移核试验。最早用来作移核开始进行哺乳动物的移核试验。最早用来作移核试验的哺乳动物是小鼠。试验的哺乳动物是小鼠。1977年，美国的杰克逊年，美国的杰克逊实验室用实验室用“亚无性繁殖亚无性繁殖”的方式，培育出的方式，培育出7只单只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有
33、母体一方的染色体，故称之为单亲小鼠。随着技术手段的的染色体，故称之为单亲小鼠。随着技术手段的发展和进步，哺乳动物的细胞核移植实验开始进发展和进步，哺乳动物的细胞核移植实验开始进入一个令人瞩目的新阶段。入一个令人瞩目的新阶段。1981年，瑞士日内瓦年，瑞士日内瓦大学的卡尔大学的卡尔伊尔门泽和美国杰克逊实验室的彼伊尔门泽和美国杰克逊实验室的彼得得霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育到囊胚期，再将此胚胎植中，经培养移核卵发育到囊胚期，再将此胚胎植入同步孕小鼠
34、的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，入同步孕小鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。并发育成了可育的个体。第三十六页，本课件共有70页 中国的细胞核移植技术工作开始于中国的细胞核移植技术工作开始于20世纪世纪50年年代，主要是在两栖类和鱼类上进行的。代，主要是在两栖类和鱼类上进行的。1961年开年开始，童第周等以金鱼和螃皱鱼为材料，进行鱼类始，童第周等以金鱼和螃皱鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核的影响。细胞质对细胞
35、核的影响。1980年年4月，中国科学月，中国科学院武汉水生生物研究所利用鲫鱼做移核试验，成院武汉水生生物研究所利用鲫鱼做移核试验，成功地培育出两尾无性繁殖的幼鱼。之后的功地培育出两尾无性繁殖的幼鱼。之后的1989年，年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼鲤鲫核鱼”新品种，这个新新品种，这个新品种的品种的“鲤鲫核鱼鲤鲫核鱼”既具有鲫鱼的鲜美味道，又既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。具有鲤鱼的生长快速。第三十七页，
36、本课件共有70页2.核移植技术核移植技术 细胞核移植必须有一个前提，就是要尽量保证细胞核移植必须有一个前提，就是要尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期。核供体和受体细胞处于同样的细胞周期。我国在细胞核移植技术选育鱼类新品种方面处我国在细胞核移植技术选育鱼类新品种方面处于世界领先地位，因此，下面就于世界领先地位，因此，下面就以鱼类细胞核移以鱼类细胞核移植为例，详细介绍一下细胞核移植技术要点：植为例，详细介绍一下细胞核移植技术要点：第三十八页，本课件共有70页(1)供体和受体的准备供体和受体的准备 供体通常为鱼类的囊胚细胞或成体细胞，受体为成熟的供体通常为鱼类的囊胚细胞或成体细胞，受体为成熟
37、的卵细胞，该受体卵一般可通过人工催产的方法得到。卵细胞，该受体卵一般可通过人工催产的方法得到。卵子卵子在接受供体核之前要先激活来获得发育能力。对于鱼卵而在接受供体核之前要先激活来获得发育能力。对于鱼卵而言，当它被挤入水中既可被激活。对于两栖类动物的卵可言，当它被挤入水中既可被激活。对于两栖类动物的卵可采用针刺方法。最关键的是供体和受体在发育时间上要配采用针刺方法。最关键的是供体和受体在发育时间上要配合好，保证在受体成熟卵刚产出时，供体受精卵发育至囊合好，保证在受体成熟卵刚产出时，供体受精卵发育至囊胚期。根据经验可采取以下方法达到这一目的。胚期。根据经验可采取以下方法达到这一目的。超低温保存供体
38、囊胚细胞。超低温保存供体囊胚细胞。用控制温度的手段控制供体受精卵的发育进程。用控制温度的手段控制供体受精卵的发育进程。用成体细胞的核代替囊胚细胞的核作为供体核。用成体细胞的核代替囊胚细胞的核作为供体核。第三十九页，本课件共有70页 (2)去卵膜和卵核去卵膜和卵核 可用小镊子在解剖显微镜下仔细剥去卵膜，或可用小镊子在解剖显微镜下仔细剥去卵膜，或用适当的胰蛋白酶溶液软化卵膜，经过轻轻晃动，用适当的胰蛋白酶溶液软化卵膜，经过轻轻晃动，使卵子从中脱出。使卵子从中脱出。对于鱼卵，可用极细的玻璃微针对于鱼卵，可用极细的玻璃微针(针尖仅为针尖仅为24m)借助第二极体标志借助第二极体标志(卵核位于极体下方卵核
39、位于极体下方)挑挑出细胞核。对于两栖类可采用紫外线照射受体卵出细胞核。对于两栖类可采用紫外线照射受体卵达到去核目的。达到去核目的。(3)供体细胞制备供体细胞制备 将发育至囊胚期的胚胎或组织器官进行机械切将发育至囊胚期的胚胎或组织器官进行机械切割，置于用细胞分离液等溶液配置的胰蛋白酶溶割，置于用细胞分离液等溶液配置的胰蛋白酶溶液中处理几分钟，直至分离出单个细胞。也可将液中处理几分钟，直至分离出单个细胞。也可将囊胚细胞或得到的离体细胞短期培养后用作供体。囊胚细胞或得到的离体细胞短期培养后用作供体。第四十页，本课件共有70页 (4)移核移核 由于细胞核极小，而且脆弱，因此需要极其小由于细胞核极小，而
40、且脆弱，因此需要极其小心，防止损伤细胞核或伤害到细胞质。心，防止损伤细胞核或伤害到细胞质。实际上核实际上核移植时，核周围的少量细胞质也一起注射进了去移植时，核周围的少量细胞质也一起注射进了去核后的受体细胞中了。因此，选择合适的微吸管核后的受体细胞中了。因此，选择合适的微吸管是核移植的重要一环。微吸管的内径要比供体细是核移植的重要一环。微吸管的内径要比供体细胞小，比细胞核大。应尽量避免注入去核卵时带胞小，比细胞核大。应尽量避免注入去核卵时带进过多的细胞液，同时，微吸管刺入的位置、深进过多的细胞液，同时，微吸管刺入的位置、深度和力度都要很好把握。而且时间不宜太久，一度和力度都要很好把握。而且时间不
41、宜太久，一般在般在30-40min以内完成。否则；时间久了，卵会以内完成。否则；时间久了，卵会变质。温度不宜太高，一般在变质。温度不宜太高，一般在1618。第四十一页，本课件共有70页3.克隆动物一般制备技术克隆动物一般制备技术 克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。其中以胚胎细胞克隆的应干细胞、成纤维细胞、体细胞等。其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。下面将分别对这些用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。下面将分别对这些方法作一介绍：方法作一介绍：(1)胚胎细胞核移植法。胚胎细
42、胞核移植法。将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合。发下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合。发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。原则上一枚早期胚胎有多原则上一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法就可以克隆出多少个个体。还可将少个细胞，通过这种方法就可以克隆出多少个个体。还可将细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多克隆动物。图细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多克隆动物。图8-2显示显示的是对胚胎细胞进行核移植克隆出动物的具体过程。由图的是对胚胎细胞进行核
43、移植克隆出动物的具体过程。由图8-2可以总结出图可以总结出图8-3所示的克隆动物培育的一般过程。所示的克隆动物培育的一般过程。第四十二页，本课件共有70页第四十三页，本课件共有70页第四十四页，本课件共有70页(2)胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植 将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分代培将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分代培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。再利用细力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。再利用细胞核移植技术，可以
44、比胚胎核移植生产出更多的胞核移植技术，可以比胚胎核移植生产出更多的动物个体。动物个体。但目前仅有小鼠分离克隆出其胚胎干但目前仅有小鼠分离克隆出其胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。细胞系并成功克隆出成体鼠。(3)胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植 从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。娠产仔，克隆出动物个体。1996年，英国报道利年，英国报道利用此法克隆出用此法克隆出3只山羊。只山羊。第四十五页，本课件共有70页4.体细胞克隆技术体细胞克隆技术
45、 体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。1997年年2月月23日，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和日，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制制药公司的胚胎学家伊恩药公司的胚胎学家伊恩维尔穆特博士的研究小组经过多年维尔穆特博士的研究小组经过多年的无性繁殖实验无性繁殖了一只雌性小绵羊的无性繁殖实验无性繁殖了一只雌性小绵羊“多莉多莉”(见见图图8-4)
46、，并且存活较长时间。维尔穆特解释他的多莉是，并且存活较长时间。维尔穆特解释他的多莉是“有史有史以来第一次通过成熟细胞的核移植生产出来的动物后代以来第一次通过成熟细胞的核移植生产出来的动物后代”。多莉与以往的克隆动物的最大区别是它的核供体是高度分化多莉与以往的克隆动物的最大区别是它的核供体是高度分化了的体细胞了的体细胞乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的早期胚胎细胞。这是克隆技术领域的一项重大突破，利用这早期胚胎细胞。这是克隆技术领域的一项重大突破，利用这一技术可以大批复制某一动物。一技术可以大批复制某一动物。第四十六页，本课件共有70页第四十七页，本课件
47、共有70页 下面以克隆羊多莉的制备过程为例详细介绍下面以克隆羊多莉的制备过程为例详细介绍一下体细胞克隆动物的技术。伊恩一下体细胞克隆动物的技术。伊恩维尔穆特维尔穆特博士无性繁殖的克隆羊博士无性繁殖的克隆羊多莉的操作过程大多莉的操作过程大致如下。过程示意图如图致如下。过程示意图如图8-5。第四十八页，本课件共有70页 第四十九页，本课件共有70页(1)取处于后三分之一妊娠期的取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊岁母绵羊(芬兰多塞特白品种芬兰多塞特白品种绵羊绵羊)的乳腺细胞作核供体细胞，用的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法饥饿法”使其进入休使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。眠状态而使全部基因具有
48、活性。(2)注射促性腺激素注射促性腺激素GN促使母羊促使母羊(苏格兰黑面母绵羊苏格兰黑面母绵羊)排卵，排卵，2833h取其未受精卵快速去核，放入取其未受精卵快速去核，放入10FCS(小牛血清小牛血清)、1FCS和和0.5FCS连续连续5天，饥饿使其进入天，饥饿使其进入Go期作为受体期作为受体细胞。细胞。(3)乳腺细胞注射乳腺细胞注射GN34-36h后与无核卵放入同一培养皿中，在后与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新遗传物质微电流作用下乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新遗传物质的卵细胞。的卵细胞。(4)将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，将新的卵细胞植入羊的结扎
49、的输卵管内，6天后发育成桑椹期天后发育成桑椹期胚胎或囊胚胚胎或囊胚(816个细胞个细胞)，再移入假孕母羊子宫内。，再移入假孕母羊子宫内。(5)产下多莉即为产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。岁母羊的复制品，也为白色。第五十页，本课件共有70页 取自取自6岁白绵羊身上的供体细胞经过几个月的岁白绵羊身上的供体细胞经过几个月的体外培养，可得到上千个遗传上一致的细胞，但体外培养，可得到上千个遗传上一致的细胞，但并不是所有的细胞都能被克隆成功。克隆技术并并不是所有的细胞都能被克隆成功。克隆技术并不像人们想象的那般简单。伊恩不像人们想象的那般简单。伊恩维尔穆特等人维尔穆特等人将取自将取自434只成体绵
50、羊细胞的只成体绵羊细胞的DNA物质植入相同物质植入相同数量的绵羊卵子中，产生了数量的绵羊卵子中，产生了277个融合细胞个融合细胞(成功成功率为率为63.8)，将此融合细胞移入母羊输卵管成功，将此融合细胞移入母羊输卵管成功247个个(89.2)，而发育到桑椹期的胚胎却只有，而发育到桑椹期的胚胎却只有29枚枚(11.7)。将这些卵子植入。将这些卵子植入13只母羊子宫后，只母羊子宫后，仅有一头羊怀胎仅有一头羊怀胎(7.7)。这样才能从一枚成体。这样才能从一枚成体细胞孕育出一只健全的小羊细胞孕育出一只健全的小羊(总成功率为总成功率为0.23)。1998年年9月，多莉经与威尔士山羊交配自然怀胎，月，多莉