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1、关于测定核酸含量的几种方法第一页，本课件共有12页核酸u由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。u核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。u不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。第二页，本课件共有12页为什么要测核酸含量u有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其他试剂含量的确定u为了排除核酸在实验中的干扰第三页，本课件共有12页核酸含量测定的几种方法u定磷法u定糖法u紫外吸收法u荧光光度法第四页，本课件共有12页定磷法u在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸
2、铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物钼蓝u钼蓝最大的光吸收在650660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为110微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。u优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响第五页，本课件共有12页注意事项u1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂 u2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物第六页，本课件共有12页定糖法u核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化合物
3、可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。u1、核糖的测定 生成的绿色化合物在=670nm处有最大的吸收值。u2、脱氧核糖的测定 DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成-羟基-酮戊酸，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在=595nm处有最大吸收值。优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。第七页，本课件共有12页注意事项 其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽量可能除去。第八页，本课件共有12页紫外吸收法u组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250
4、270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。u在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA或RNA为20g/ml。可以次来计算核酸样品的浓度。u优缺点：只用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液第九页，本课件共有12页荧光光度法u即琼脂糖凝胶电泳法。u溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。u该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。第十页，本课件共有12页小节u根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。u无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。u根据需要设定一定的平行以及对照。第十一页，本课件共有12页感感谢谢大大家家观观看看第十二页，本课件共有12页