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1、关于液相色谱分析仪法2023/3/12023/3/1第一页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph 目前常见的目前常见的HPLC仪生产厂家国仪生产厂家国外有外有Waters公司、公司、Agilent公司公司（原（原HP公司）、岛津公司等，国公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。器厂、北京分析仪器厂等。第二页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1液相色谱仪（液相色谱仪（1）high performan
2、ce liquid chromatograph第三页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1液相色谱仪（液相色谱仪（2）第四页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1液相色谱仪（液相色谱仪（3）第五页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1液相色谱仪（液相色谱仪（4）第六页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1二.概论：定义：以液体为流动相的色谱法称为液相色法。以液体为流动相的色谱法称为液相色法。用用常压输送流动相常压输送流动相的方法为经典液相色谱的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周长。法，这种色谱法的柱效能低、分离周长。高效液相色谱法
3、（高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称，简称HPLC）是在经典）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点色谱法具有下列主要优点：第七页，本课件共有66页2023/3/12023/3/11.应用了颗粒极细（一般为应用了颗粒极细（一般为10m以下）规以下）规则均匀的则均匀的固定相固定相，柱效高，分离效率高；，柱效高，分离效率高；2.采用采用高压输液泵高压输液泵输送流动相，流速快，输送流动相，流速快，一般试
4、样的分析需数分钟，复杂试样分一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；析在数十分钟内即可完成；3.广泛使用了高灵敏广泛使用了高灵敏检测器检测器，大大提高了，大大提高了灵敏度。目前，已发展了多种固定相，灵敏度。目前，已发展了多种固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大谱法的应用范围不断扩大。第八页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1.色谱法分类色谱法分类 按两相的物理状态可分为：按两相的物理状态可分为：气相色谱法气相色谱法(GC):适用于分离挥发性化合物。有机适用于分离挥发性化合物。有机物质中分子量小于物质中
5、分子量小于400的采用气相色谱法分析，此的采用气相色谱法分析，此范围的物质约占有机物质总数范围的物质约占有机物质总数15%20%.液相色谱法液相色谱法(LC):适用于分离低挥发性或非挥发性、适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。热稳定性差的物质。分子量为分子量为4002000的有机物质可采用液相色谱法分析，的有机物质可采用液相色谱法分析，而分子量大于而分子量大于2000的则须用凝胶色谱法。的则须用凝胶色谱法。第九页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1按固定相性质及外形分类柱色谱柱色谱:固定相装在柱管内的色谱分析法纸色谱纸色谱:固定相为滤纸的色谱分析法薄层色谱薄层色谱:固
6、定相压成或涂成薄膜的色谱分析法第十页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1（三）HPLC的主要分离类型和原理：高效液相色谱法按分离机理的不同主要分为四类：高效液相色谱法按分离机理的不同主要分为四类：1.液液-固吸附色谱（固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography）固定相固定相：固体吸附剂。如硅胶、氧化铝等，较常使用的是：固体吸附剂。如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相流动相：主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷）并加入少：主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷）并加入少量极性溶剂作缓和剂（如水、甲醇）。量极性溶
7、剂作缓和剂（如水、甲醇）。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂表面对不同物质吸附能力不同使：组分在固定相吸附剂表面对不同物质吸附能力不同使混合物分离的；吸附力越强混合物分离的；吸附力越强,保留时间越长保留时间越长,反之反之,保留时间短保留时间短,。适用于分离分子质量中等适用于分离分子质量中等（2001000）的油溶性试样或极）的油溶性试样或极性较小的植物色素等组分，大多数用于非离子型化合物，。性较小的植物色素等组分，大多数用于非离子型化合物，。常用于分离同分异构体不适宜于分离强极性的离子型化和物常用于分离同分异构体不适宜于分离强极性的离子型化和物和同系物。和同系物。缺点缺点：非线形等温吸附常引
8、起峰的拖尾（离子型化合物易产生：非线形等温吸附常引起峰的拖尾（离子型化合物易产生拖尾）；拖尾）；第十一页，本课件共有66页2023/3/12023/3/12.2.液液-液分配色谱液分配色谱（liquid-liquid partition chromatography）固定相与流动相均为液体，固定相与流动相均为液体，流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：K=式中，Cs溶质在固定相中浓度；Cm-溶质在流动相中的浓度；分离的顺序取决于K值，在同一色谱条件下，样品中K值大的组分保留值大；后流出色谱柱
9、；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。第十二页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；是根：组分在固定相和流动相上的分配；是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。而分离。分离过程是一个分配平衡过程。固定
10、相：固定相：将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的合于担体表面而形成的 液液色谱法液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法正相色谱法(NPC)和和反相色谱法反相色谱法(RPC);流动相流动相的极性小于固定液的极性（的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），），反之，流动相的极性大于固定液的极性反之，流动相的极性大于固定液的极性（反反相相 reverse phase）。）。正相与反相的出峰顺正相与反相的出峰顺序相反。序相反。第十三页，本课件共有66页2023/3/12023/
11、3/1正相色谱法正相色谱法：由极性固定相由极性固定相(如氨基与腈基键合相如氨基与腈基键合相)和非极性和非极性（或弱极性）流动相（或弱极性）流动相(烷烃类如正已烷、环已烷）烷烃类如正已烷、环已烷）所组成的所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱、氨基柱体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱、氨基柱等，代表性的流动相是正己烷。等，代表性的流动相是正己烷。用于分离中等极性和极性较用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。吸强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。吸附色谱也属于正相色谱附色谱也属于正相色谱反相色谱法反相色谱法；由非极性固定相和极性
12、流动相所组成的由非极性固定相和极性流动相所组成的HPLC体系，体系，与正相与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶合硅胶(ODS柱、柱、C18、C8），代表性的流动相是甲醇），代表性的流动相是甲醇-水和乙水和乙腈腈-水或水的缓冲液或水的缓冲液。是当今液相色谱的最主要分离模式。是当今液相色谱的最主要分离模式。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。为控制样品在分析过程适用于分离非极性和极性较弱的化合物。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，值。但需要注意的是，C18和和C
13、8使用的使用的pH值通常为值通常为2.57.5（28），太高的），太高的pH值会使值会使硅胶溶解，太低的硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。第十四页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1液液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，后来在此基础上发展了中去，所以重现性很差，后来在此基础上发展了一种新型固定相一种新型固定相-化学键合固定相化学键合固定相。化学键合固定相化学键合固定相：通过化学反应将固定液（各种不同基团）：通过化学反应将固定液（各种不同基团）键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
14、在键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。在HPLC整个应用整个应用中占中占80%以上。以上。键合固定相的载体主要是硅胶，根据在硅胶表面（具有键合固定相的载体主要是硅胶，根据在硅胶表面（具有-Si-OH基团）化学反应不同可制成四种键合相：基团）化学反应不同可制成四种键合相：（1）硅氧碳型（）硅氧碳型（SiOC=，硅胶与醇类发生酯化反应）。，硅胶与醇类发生酯化反应）。（2）硅碳型（）硅碳型（SiC=，硅胶与卤代烷反应）。，硅胶与卤代烷反应）。（3）硅氮型（）硅氮型（SiN=，硅胶与胺类反应）。，硅胶与胺类反应）。（4）硅氧烷型（）硅氧烷型（Si OSiC=，硅胶与有机硅烷反应）。，硅胶与有机硅烷反应
15、）。稳稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广第十五页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1化学键合色谱与液液分配色谱一样，也可分为正相化学键合色谱与液液分配色谱一样，也可分为正相和反相色谱。和反相色谱。反相键合色谱采用非极性固定相，键合的基团反相键合色谱采用非极性固定相，键合的基团有有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其中烷基和苯基。其中最常用的是最常用的是C18，又称，又称ODS一十八烷基硅烷键合一十八烷基硅烷键合相。所用的流动相为极性溶剂，以水为底溶剂相。所用的流动相为极性溶剂，以水为底溶剂,再加入有机溶剂再加入有机溶剂,最常
16、用的是甲醇最常用的是甲醇-水、乙腈水、乙腈-水和水和四腈呋喃四腈呋喃-水。水。正相键合色谱采用极性固定相，如氨基、腈基等正相键合色谱采用极性固定相，如氨基、腈基等极性基团；非极性或弱极性流动相，一般为烃类极性基团；非极性或弱极性流动相，一般为烃类溶剂，如己烷、庚烷等。溶剂，如己烷、庚烷等。第十六页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1（1）传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（3）选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（4）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；化学键合固定相
17、的特点化学键合固定相的特点第十七页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高中 中低流动相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小的先洗出 极性大的先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）第十八页，本课件共有66页2023/3/12023/3/13.3.离子交换色谱离子交换色谱（ion-exchange chromatography）固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离
18、子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-应用应用：碱金属、碱土金属等离子混合物的分离；食品中添加剂和污染物的分离；生物大分子如氨基酸、核酸等。第十九页，本课件共有66页2023/3/12023/3/14.4.体积体积排阻色谱排阻色谱（size-exclusion chromatography）凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)固定
19、相：固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料亲水凝胶、无机多孔材料,是有一定孔径的多孔是有一定孔径的多孔性填料。性填料。流动相：流动相：在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色
20、谱凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography,GPC）：）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。用于合成高分子的分子量（分布）的测定。第二十页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1基本原理基本原理：按分子大小分离。小分子可以扩：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中
21、等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。剂分子小，故在最后出峰。常用的常用的流动相流动相为水、四腈呋喃等为水、四腈呋喃等 可对相对分子质量在可对相对分子质量在2000以上范围内的化以上范围内的化合合 物按质量分离物按质量分离,如多肽、蛋白质、核酸如多肽、蛋白质、核酸等。等。第二十一页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1分离类型选择分离类型选择 choice of separation types第二十二页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1基
22、本概念和术语：色谱峰色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见 色谱图色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。第二十三页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1噪音噪音(noise)
23、基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。拖尾因子拖尾因子(tailing factor，T)T，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。第二十四页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1保留时间保留时间(retention ti
24、me，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。分配系数分配系数(distribution coefficient，K)在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K 式中Cs、Cm分别是组分在固定相和流动相中溶质的浓度。第二十五页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1 分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数；离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)；凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。理论塔板数理论塔板数(theoretical p
25、late numberN)用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。第二十六页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1三三.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 feature of HPLC 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度 流动相选择范围广。流动相选择范围广。流动相选择范围广。流动相选择范围广。是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分
26、离分析方法。第二十七页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1高压高压压力可达压力可达150420 Kg/cm2。色。色谱柱每米降压为谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。以上。高速高速流速为流速为0.110.0 ml/min。高效高效可达可达5000塔板每米。在一根柱塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达中同时分离成份可达100种。种。高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。同时消耗样品少。流动相选择范围广流动相选择范围广-大部分的有机溶大部分的有机溶剂以及水和有机溶剂的混合物均可用。剂以及水和有机溶剂的混合物均可用。第二十八页，本课件共
27、有66页2023/3/12023/3/1四四.HPLC的系统组成和工作原理：的系统组成和工作原理：（一）系统组成：（一）系统组成：高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统五大部分组成。检测系统、记录系统五大部分组成。1.高压输液系统：高压输液系统：由由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表压力表 等组成。等组成。2.进样系统：进样系统：包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。析试样有效地送入色谱柱上
28、进行分离。3.分离系统分离系统：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。4.检测系统：检测系统：检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。和流量的变化不敏感等。5.记录系统；记录系统；纪录仪、积分仪、色谱工作站纪录仪、积分仪、色谱工作站第二十九页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1（二）工作原理储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色
29、谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。第三十页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1五五.流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.工作流程：工作流程：高压泵将样品高压泵将样品由流动相带入色由流动相带入色谱柱分离后，经谱柱分离后，经检测器将光信号检测器将光信号转变为电信号并转变为电信号并放大，最后
30、以图放大，最后以图谱的形式显示在谱的形式显示在工作站荧屏上。工作站荧屏上。第三十一页，本课件共有66页2023/3/12023/3/12.主要部件主要部件(1)(1)高压输液泵：有恒流泵和恒压泵两种。高压输液泵：有恒流泵和恒压泵两种。高压输液泵：有恒流泵和恒压泵两种。高压输液泵：有恒流泵和恒压泵两种。主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035010350105 5 PaPa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（10 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二
31、硫化碳环己烷己烷煤油(最小)第五十五页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1七七.最常用的色谱定性定量分析方法最常用的色谱定性定量分析方法 定性分析定性分析在色谱分析中最常用的简便可靠的定性方法是在色谱分析中最常用的简便可靠的定性方法是用用已知物（标准样）定性法（即保留时间定性法）。已知物（标准样）定性法（即保留时间定性法）。这个方法的依据是：在一定的固定相和一定这个方法的依据是：在一定的固定相和一定的操作条件下（如柱长、柱填料、流速），的操作条件下（如柱长、柱填料、流速），任何物质都有确定的保留值（保留时间）。任何物质都有确定的保留值（保留时间）。测定时只要在相同的操作条件下，分
32、别进样，测定时只要在相同的操作条件下，分别进样，测定已知物和未知组分的保留值。如果保留测定已知物和未知组分的保留值。如果保留值相同，可认为是同一化合物。值相同，可认为是同一化合物。第五十六页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1 定量方法：定量方法：归一化法：指将所有出峰组分的含量之和归一化法：指将所有出峰组分的含量之和按按100%计算的定量方法。如果样品中所有组分计算的定量方法。如果样品中所有组分都能流出并有响应信号可用此法。都能流出并有响应信号可用此法。归一化法的优点归一化法的优点:简便、准确，不必准确称量和进样操作条件对结简便、准确，不必准确称量和进样操作条件对结果影响较小。
33、此法不适用于痕量分析。果影响较小。此法不适用于痕量分析。第五十七页，本课件共有66页2023/3/12023/3/12.内标法：内标物要满足以下要求：内标物要满足以下要求：a.试样中不含有该物质；试样中不含有该物质；b.与被测组分性质比较接近；与被测组分性质比较接近；c.不与试样发生化学反应；不与试样发生化学反应；d.出峰位置应位于被测组分附近，且无组分出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。峰影响。第五十八页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1内标法特点(a)内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。变动对
34、定量结果的影响不大。(b)每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。大批量试样的快速分析。第五十九页，本课件共有66页2023/3/12023/3/13.外标法外标法：以与待测组分同质的物质作为参比物（标准以与待测组分同质的物质作为参比物（标准物），根据样品量和标准物的量，以及待测物），根据样品量和标准物的量，以及待测组分和标准物的响应信号进行定量的方法。组分和标准物的响应信号进行定量的方法。外标法又称标准曲线法和单点校正法等。外标法又称标准曲线法和单点校正法等。标准曲线法：标准曲线法：用标准物配成浓度递增的用标准物配成浓度递增的标准
35、溶液系列，在一定操作条件下分别定量标准溶液系列，在一定操作条件下分别定量进样，测得各峰面积进样，测得各峰面积A或峰高或峰高hi，绘制，绘制Ai-C或或C-hi标准曲线。分析时，按同一操作条件注标准曲线。分析时，按同一操作条件注入同体积的待测样品，根据所得的入同体积的待测样品，根据所得的hi或或Ai从从标准曲线上查出该组分的浓度含量。标准曲线上查出该组分的浓度含量。第六十页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1操作条件变化对结果准确性影响较大。操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。适用于大批量试样的快
36、速分析。第六十一页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1单点校正法单点校正法：如果样品的浓度变化：如果样品的浓度变化不大，可用本法定量。先注入标准物测不大，可用本法定量。先注入标准物测出校正值出校正值Ki，再以同一操作条件注入待，再以同一操作条件注入待测物分析，按下式计算组分的浓度：测物分析，按下式计算组分的浓度：Pi%=AiKi 外标法的优点是操作简单，计算方便。外标法的优点是操作简单，计算方便。缺点是分析结果的准确性主要取决于进缺点是分析结果的准确性主要取决于进样体积和操作条件是否完全一致。因此，样体积和操作条件是否完全一致。因此，要经常用标准物来校正。要经常用标准物来校正。第
37、六十二页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1HPLC在各领域的主要应用 应用领域应用领域 分析对象举例分析对象举例 环 境常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分。农 业土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有机成分 石 油烃类族组成、石油中微量成分。化 工无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、化妆品、染料。材 料液晶材料、合成高分子材料。食 品无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃 生 物氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、
38、生物胺、多糖、酶、天然高分子化合物。医 药人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物化学成分 第六十三页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1八.HPLC的应用1.金属和非金属元素：金属和非金属元素：土壤、复合肥、作物种子、蔬菜、动物体液、动物饲料、植物材料和微生物中各种金属和非金属元素，采用离子交换色谱分离-电化学检测法进行直接测定。2.碳水化合物：碳水化合物：采用正相或离子交换色谱可对样品中的各种单糖或双糖进行含量测定。3.有机酸：有机酸：植物样品中的有机酸多采用离子交换色谱法测定，也可用反相色谱法。第六十四页，本课件共有66页2023/3/12023/3/14.维
39、生素：维生素：可以采用UV检测器准确快速地同时测定果实蔬菜、食物、饮料、动物饲料和生理体液中各种水溶性（VB族）和脂溶性维生素（VA、VD、VE、VK）。5.氨基酸：氨基酸：采用柱前衍生反相色谱法可在12分钟对17种氨基酸进行准确的痕量分析。6.核苷酸和核酸：核苷酸和核酸：核苷酸的测定采用离子交换和反相色谱法；核酸的分离要用离子交换或体积排阻色谱法。7.植物多胺：植物多胺：采用柱前荧光衍生反相色谱法可对作物种子、植物组织、果树花芽及果实中的游离或结合态多胺进行快速准确测定。8.植物激素：植物激素：9.蛋白质：蛋白质：蛋白质：蛋白质：第六十五页，本课件共有66页2023/3/12023/3/1感感谢谢大大家家观观看看第六十六页，本课件共有66页