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1、第十章第十章 蛋白酶活力测定蛋白酶活力测定概 述n蛋白酶定义 水解蛋白质肽链酶类的总称，适宜PH和温度下水解蛋白为肽段和氨基酸。蛋白酶分类 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶（内肽酶）蛋白酶分类作用位点已知抑制物氨基肽酶金属蛋白酶带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、D或Q组成的肽键2，2，双吡啶，11()-菲咯啉菠萝蛋白酶巯基蛋白酶无特异性2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化羧肽酶A锌金属蛋白酶带有自由氨基酸的L氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸EDTA，EGTA羧肽酶B锌金属蛋白酶K，R羧基端EDTA，EGTA，碱性氨基酸羧肽酶Y丝氨酸羧肽酶氨基酸羧基端PMSF组织蛋
2、白酶C琉基蛋白酶氨基端双肽，可通过K，R或P氨基端作为第二或第三个氨基酸封闭醋酸碘，甲醛胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶在F，T或Y之后抑肽酶，PMSF，TPCK，巨球蛋白胶原酶金属蛋白酶在P-X-G-P肽链中X之后EDTA，EGTA，还原剂，但无血清存在dispase金属蛋白酶无特异性EDTA，EGTA，Hg2+，重金属内肽酶Arg-C丝氨酸蛋白酶在R之后巨球蛋白，TLCK内肽酶Asp-N金属蛋白酶在D和半胱氨酸之前EDTA，菲咯啉内肽酶Glu-C丝氨酸蛋白酶在E或D之后巨球蛋白，TLCK内肽酶Lys-C丝氨酸蛋白酶在K之后TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽肠激酶丝氨酸蛋白酶在D-D-D-D-K-肽链中
3、K之后Xa因子丝氨酸蛋白酶在R之后PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物无花果蛋白酶琉基蛋白酶无特异性TPCK，TLCK，-巨球蛋白激肽释放酶丝氨酸蛋白酶在一些R之后抑肽酶，抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巯基蛋白酶长期孵育时具有广泛特异性TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽巨球蛋白，烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素纤溶酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后PMSF，TLCK，抑肽酶，巨球蛋白链霉蛋白酶混合型无特异性BM完整药片蛋白酶K丝氨酸蛋白酶广泛特异性PMSF，PefablocSc枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶无特异性PMSF，巨球蛋白，苯甲脒热溶素锌金属蛋白酶在非极性残基之前EDTA凝血酶丝氨酸蛋白
4、酶在K之后TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，巨球蛋白，苯甲脒胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，巨球蛋白应用n发酵：发酵酒精时，蛋白水解充分。n皮革脱毛和软化n丝绸脱胶n医药生产要求n掌握测定蛋白酶活力的原理掌握测定蛋白酶活力的原理n理解制备标准曲线的目的和意义理解制备标准曲线的目的和意义n学习制备标准曲线的基本操作学习制备标准曲线的基本操作一、原原 理理酪蛋白酪蛋白 酪氨酸酪氨酸 钼蓝钼蓝和和钨蓝钨蓝（蓝蓝色）色）蛋白蛋白酶酶 Folin PH=10，40 OH-680nmOD酶活力单位：酶活力单位：1mL液体或液体或1g固体酶粉在一定温度、固体酶粉
5、在一定温度、PH下，每分钟水解下，每分钟水解酪蛋白产生酪蛋白产生1ug酪氨酸，为一个酶活力单位。酪氨酸，为一个酶活力单位。福林试剂（福林试剂（Folin）：钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂）金黄色溶液）：钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂）金黄色溶液二、仪器与试剂二、仪器与试剂1、仪器、仪器电子天平、紫外分光光度计、电热恒温水浴锅电子天平、紫外分光光度计、电热恒温水浴锅2、试剂、试剂（1）福林试剂）福林试剂 贮存液和使用液贮存液和使用液 （2）2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 （3）pH7.2磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液 （4）100ug/mL标准酪氨酸溶液标准酪氨酸溶液 （5）0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液 （6）0.
6、4mol/L三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液（7）c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液溶液（8）c（Hcl）=1mol/mL Hcl 溶液溶液三、测定方法三、测定方法1、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制 取取6支支10mL具塞比色管，编号，按下表将酪氨酸溶液稀释，配具塞比色管，编号，按下表将酪氨酸溶液稀释，配制酪氨酸系列标准溶液：制酪氨酸系列标准溶液：10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 1000246810123456蒸蒸馏馏水水(ml)稀稀释释后的酪氨酸后的酪氨酸标标准溶液准溶液浓浓度（度（ug/ml）酪氨酸溶液（酪氨酸溶液（100g/mL）mL试试管管编编
7、号号于上述各管中各吸取于上述各管中各吸取1mL于于10mL比色管中，分别加入比色管中，分别加入5mL0.4mol/mL碳酸钠溶液、碳酸钠溶液、1mL Folin试剂使用液。摇匀，试剂使用液。摇匀，40毒毒水浴显色水浴显色20min后，后，680mn测定吸光度。以吸光度值和酪氨酸浓度测定吸光度。以吸光度值和酪氨酸浓度绘制标准曲线。绘制标准曲线。以光密度以光密度OD为纵坐标，酪氨酸含量为纵坐标，酪氨酸含量（g）为横坐标，绘制标准曲线。为横坐标，绘制标准曲线。酪氨酸标准曲线酪氨酸标准曲线y=0.0011xy=0.0011xR R2 2 =0.9999=0.99990 00.10.10.20.20.3
8、0.30.40.40.50.50.60.60.70.70 0100100200200300300400400500500600600700700酪氨酸含量酪氨酸含量ugug光密度光密度2 2、待测酶液的制备（称取、溶解、稀释）、待测酶液的制备（称取、溶解、稀释）称取0.1g酶粉，用pH7.2磷酸缓冲溶液溶解并定容至100mL，吸取5mL，再用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至250mL，即稀释500倍待测。3 3、样品测定、样品测定第一步第一步操作步骤加预热酶液/mL加预热2%酪蛋白溶液/mL保温显色/min加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL保温/min操作步骤加预热酶液/mL加0.4mol
9、/mL三氯乙酸溶液/mL保温显色/min加预热2%酪蛋白溶液/mL 样品管号 1 2 3 空白管号 1 2 31.0102.00201.002.00101.00第二步第二步 操作步骤加对应的离心上清液/mLc（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液/mL加Folin试剂使用液/mL保温显色/min吸光度值平均吸光度值 样品管号 1 2 3 空白管号 1 2 31.05.001.00201.05.001.0020以空白为对照，以空白为对照，680mn测定吸光度值，求平均值。测定吸光度值，求平均值。从标准曲线上找到酪氨酸的质量从标准曲线上找到酪氨酸的质量A，ug；酪氨酸质量，酪
10、氨酸质量，ugODODy=k x测得的测得的OD值值A=？四、计算样品蛋白酶活力单位样品蛋白酶活力单位(以干基计以干基计)=4 n A 10 1（1-w）式中式中A标准曲线上查的酪氨酸质量，标准曲线上查的酪氨酸质量，ug；44mL反应液取出反应液取出1mL测定；测定；N酶液稀释倍数；酶液稀释倍数；W样品中水分，样品中水分，%。注意注意 严格按顺序加入试剂。严格按顺序加入试剂。先加先加NaCO3，再加，再加Follin试剂，后者只有试剂，后者只有 在碱性条件下才能被还原成兰色物质。在碱性条件下才能被还原成兰色物质。说明：说明：酪蛋白在低温下有少量降解为酪氨酸，酪蛋白在低温下有少量降解为酪氨酸，此
11、操作是与测定样品的条件保持一致，此操作是与测定样品的条件保持一致，消除系统误差。消除系统误差。注意：注意：滤纸不能润湿。滤纸不能润湿。校正：校正：用紫外分光光度计，以蒸馏水作对照，用紫外分光光度计，以蒸馏水作对照，在在680nm处测定光密度。用处测定光密度。用1-6号管的光号管的光密度值减去密度值减去0号管的光密度值。号管的光密度值。end【实验结果实验结果】一、原理一、原理一、酶活力的定义一、酶活力的定义 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力酶活力是指酶催化某些化学反应的能力二、酶活力和酶促反应速度的关系二、酶活力和酶促反应速度的关系 酶活力的大小可以用在一定条件下它酶活力的大小可以用在一定条件下它 所催化的某一化学反应的速度来表示所催化的某一化学反应的速度来表示 测定酶活力就是测定酶促反应的速度测定酶活力就是测定酶促反应的速度【实验原理实验原理】三、酶促反应速度的测定方法及条件三、酶促反应速度的测定方法及条件n 通常用单位时间内通常用单位时间内 产物的生成量表示产物的生成量表示 酶促反应的速度。酶促反应的速度。n 必须测定酶促反应必须测定酶促反应 的初速度。的初速度。时间（时间（t）酶酶促促反反应应速速度度（v）