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1、关于免疫组化(2)理论课第一页，本课件共有82页u免免疫疫组组化化技技术术操操作作并并不不困困难难，虽虽然然染染色色过过程程包包括括很很多多步步骤骤，但但只只要要注注意意一一些些主主要要问问题题，就就能能完完成成一一张张质质量量好好的的免免疫疫组组化切片。化切片。第二页，本课件共有82页内内容容1 1.染色前需注意的问题染色前需注意的问题2.2.染色中需注意的问题染色中需注意的问题 3.3.如何进行科研设计如何进行科研设计第三页，本课件共有82页免疫组化基本流程免疫组化基本流程以石蜡组织为例以石蜡组织为例sp法：法：取材取材-固定固定-脱水脱水-透明透明-浸蜡浸蜡包埋包埋-切片切片-烤片烤片-
2、染色开始，脱染色开始，脱蜡蜡-入水入水-修复修复-阻断内源性过氧阻断内源性过氧化物酶化物酶-正常羊血清封闭正常羊血清封闭-一抗一抗-二抗二抗-三抗三抗-显色显色第四页，本课件共有82页染色前需注意的问题染色前需注意的问题第五页，本课件共有82页一、组织和细胞标本类型：一、组织和细胞标本类型：二、组织取材二、组织取材对病理组织还应做到以下几点：对病理组织还应做到以下几点：材部位必须是主要病变区。材部位必须是主要病变区。必须取病灶与正常组织的交必须取病灶与正常组织的交界区界区必要时取远离病灶的正常必要时取远离病灶的正常组织做对照组织做对照。第六页，本课件共有82页三、组织固定三、组织固定在免疫组化
3、中首选的固定液是在免疫组化中首选的固定液是10%10%中性中性缓冲福尔马林液（市售甲醛缓冲福尔马林液（市售甲醛1 1：9 9稀释）稀释）为确保离体组织的抗原性，值得高度重视为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织须马上固定。组织离体后固的是离体组织须马上固定。组织离体后固定一般不要超过定一般不要超过1515分钟，固定在常温条件分钟，固定在常温条件下时间为下时间为8-248-24小时，同时还要注意的是要小时，同时还要注意的是要避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失第七页，本课件共有82页 为确保离体组织的抗原性，为确保离体组织的抗原性，值得高度重视值
4、得高度重视的是离的是离体组织须体组织须马上固定马上固定。组织离体后固定一般不要超。组织离体后固定一般不要超过过1515分钟，固定在常温条件下时间为分钟，固定在常温条件下时间为8-248-24小时，小时，同时还要注意的是要同时还要注意的是要避免福尔马林过度固定避免福尔马林过度固定造成造成的组织抗原损失，有研究发现新鲜组织经过福的组织抗原损失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林固定一周后组织抗原丢失严重，抗原几尔马林固定一周后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检出乎不能被检出 。组织同样不能长时间放置在。组织同样不能长时间放置在70%70%的乙醇中。脱钙液对抗原破坏较为严重，所的乙醇中。脱钙液对抗原破坏
5、较为严重，所以脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控以脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。制在最低的限度。第八页，本课件共有82页四、组织脱水四、组织脱水五、组织透明五、组织透明六、组织浸蜡及包埋六、组织浸蜡及包埋六、六、切片切片 第九页，本课件共有82页举例举例 ：小动物组织脱水、透明和浸蜡时间：小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75%75%乙醇乙醇30min30min，85%85%乙醇乙醇30min30min，95%95%乙醇乙醇1h1h，1h1h，过夜或过夜或2h2h；无水乙醇；无水乙醇、和和各各30min30min；二甲苯；二甲苯15min15min，10min10mi
6、n，10min10min；石蜡；石蜡30min30min，石蜡，石蜡30min30min，石蜡，石蜡1-2h1-2h。第十页，本课件共有82页 总之，提高切片质量须注意制片过程总之，提高切片质量须注意制片过程中的每一个环节，特别是组织固定，可以中的每一个环节，特别是组织固定，可以说固定是高质量制片的基础，脱水更关键，说固定是高质量制片的基础，脱水更关键，只有充分的固定组织，才不会影响整个脱只有充分的固定组织，才不会影响整个脱水、透明、浸蜡以及切片、甚至包括染色水、透明、浸蜡以及切片、甚至包括染色的全过程，才能制作出合格的高质量的切的全过程，才能制作出合格的高质量的切片。片。第十一页，本课件共有
7、82页七、防脱片的制备七、防脱片的制备 防脱玻片的处理各个实验室间一般多采用不防脱玻片的处理各个实验室间一般多采用不同的粘附剂如同的粘附剂如APESAPES（3-3-氨丙基三乙氧基硅烷）、氨丙基三乙氧基硅烷）、HistogripTMHistogripTM或或Poly-L-LysinePoly-L-Lysine。目前通用的。目前通用的是是SigmaSigma公司的多聚左旋赖氨酸（公司的多聚左旋赖氨酸（Poly-L-Poly-L-lysinelysine）或硅化片，不论是免疫组化还是原）或硅化片，不论是免疫组化还是原位杂交该粘附剂都具有极好的防脱片效果。位杂交该粘附剂都具有极好的防脱片效果。第十二
8、页，本课件共有82页 APES APES：现用现配。将洗净的玻片放入以现用现配。将洗净的玻片放入以1:501:50比例丙酮稀释的比例丙酮稀释的APESAPES中，停留中，停留20-3020-30秒钟，取秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的去未结合的APESAPES，置通风橱中晾干即可。用，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。第十三页，本课件共有82页HistogripTMHistogripTM：将洗净
9、的玻片放入以将洗净的玻片放入以1:501:50比例比例丙酮稀释的丙酮稀释的HistogripHistogrip液中，停留液中，停留1-21-2分钟，分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60 60 烤箱烘烤一小时，装盒备用。烤箱烘烤一小时，装盒备用。Poly-L-LysinePoly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放将洗净、干燥的载玻片放入以入以1:101:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡液中，浸泡5 5分钟，分钟，6060烤箱烘烤烤箱烘烤1 1小时或室小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具温过夜
10、干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。均为非玻璃制品。第十四页，本课件共有82页八、烤片八、烤片 切片在切片在56-6056-60恒温箱里烤片至少恒温箱里烤片至少1 1小时小时才不至于脱片，迈新实验室推荐才不至于脱片，迈新实验室推荐58-6058-60恒温箱里烤片恒温箱里烤片2 2小时。也有的实验室在小时。也有的实验室在58-6058-60恒温箱里过夜烤片。但高温烤片恒温箱里过夜烤片。但高温烤片对抗原有破坏，原因是在高温干燥条件对抗原有破坏，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。下可以加速组织切片中抗原的氧化。第十五页，本课件共有82页九、切片保存九、切片保存切片后的组
11、织在室温下长期保存抗原可以切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。在实验中迈新实验室发现蜡块切片损失。在实验中迈新实验室发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况，尤其核染色结果会出现减弱或阴性情况，尤其核表达的抗原丢失更多。表达的抗原丢失更多。第十六页，本课件共有82页究其原因可能与空气中的氧化作用有关，究其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可免抗原损失以便长期保存，也可44冰箱冰箱冷藏保存，提醒科研单位在连续性课题冷藏保存，提醒
12、科研单位在连续性课题实验中注意切片的保存实验中注意切片的保存。第十七页，本课件共有82页染色中应注意的问题染色中应注意的问题第十八页，本课件共有82页一、脱蜡和水化一、脱蜡和水化 免疫组化的脱蜡步骤与常规免疫组化的脱蜡步骤与常规H&EH&E脱蜡步骤相脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&EH&E常规脱常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。色结果的异常。第十九页，本课件共有82页二、抗体选择二、抗体选择第二十页，本课件共有82页 首首先先确确定定一一抗抗种种属属来来源源能能否否适适应应标标本本来来源源（人人
13、或或动动物物组组织织），能能否否适适应应标标本本处处理理形形式式（冰冰冻冻、石石蜡蜡），一一抗抗单单克克隆隆抗抗体体（鼠鼠、兔兔）和和多多克克隆隆抗抗体体（兔兔、马马、羊羊等等）及及二二，三三抗抗的的配配套套连连接接，不不同同方方法法连连接接方方式式不不同同（S-PS-P、二二步步法法等等），购购买买商商品品化化抗抗体体应应尽尽量量购购买买原原液液，质质量量高高，保保存存时时间间长长，而而即即用用型型抗抗体体则则现现买买现用，不可长期保存。现用，不可长期保存。第二十一页，本课件共有82页多抗和单抗的比较多抗和单抗的比较均一性，单抗的均一性很强均一性，单抗的均一性很强稳定性，单抗的稳定性较差稳定
14、性，单抗的稳定性较差特异性，单抗的特异性强特异性，单抗的特异性强重复性，单抗的重复性好重复性，单抗的重复性好第二十二页，本课件共有82页抗体的稀释方法抗体的稀释方法v直接测定法直接测定法v从以上结果分析，可以选择从以上结果分析，可以选择1:2001:4001:2001:400之间的浓度之间的浓度 稀释浓度特异强度背景染色1:50 +1:100 +1:200 +1:400 +第二十三页，本课件共有82页抗体的最佳稀释度抗体的最佳稀释度 由于各种抗体效价不同，组织中抗原强由于各种抗体效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为
15、最佳，因其既以取得中等阳性稀释度为最佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。用于抗原性弱的标本。第二十四页，本课件共有82页抗体滴片技术抗体滴片技术 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。要领：甩净组织周围的水。要领：甩净组织周围的水。抗体滴片图示：抗体滴片图示：第二十五页，本课件共有82页三、抗原修复三、抗原修复 第二十六页，本课件共有82页常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程中会形成醛
16、键，导致蛋白交联封闭了组织中会形成醛键，导致蛋白交联封闭了组织中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，打开醛键暴露抗原，增加细胞和组织的通打开醛键暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修复有复有酶消化、微波修复、高压处理酶消化、微波修复、高压处理等。等。第二十七页，本课件共有82页1、微波修复、微波修复 本本实实验验室室微微波波修修复复应应用用最最多多，特特
17、点点是是简简单单、有有效效，主主要要根根据据微微波波发发射射高高频频能能量量，组组织织经经微微波波幅幅射射后后，会会加加速速组组织织内内部部分分子子高高速速运运动动，抗抗原原可可完完全全被被暴暴露露出出来来，用用于于浆浆或或部部分分核核抗抗原原，膜膜抗抗原原不不用用或或短短时时间间应应用用。在在0.01M 0.01M PH6.0PH6.0柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液微微波波修修复复时时，温温度度控控制制在在95-10095-100之之间间维维持持1010分分钟钟，不不足足或或超超过过100达达不到抗原修复最佳效果。不到抗原修复最佳效果。第二十八页，本课件共有82页第二十九页，本课件共有82页子宫内
18、膜子宫内膜PR染色，修复良好染色，修复良好 子宫内膜子宫内膜PR染色，修复不足染色，修复不足第三十页，本课件共有82页2、酶消化、酶消化 p其作用是以化学的方式使醛键断裂，其作用是以化学的方式使醛键断裂，暴露抗原决定暴露抗原决定族族，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色，避抗原最大限度的结合，增强特异性染色，避免非特异性染色，注意有些抗原显示必须先免非特异性染色，注意有些抗原显示必须先行消化，有些不需要反而破坏抗原性，使阳行消化，有些不需要反而破坏抗原性，使阳性率下降，须消化的组织或细胞抗原，也要性率下降，须消化的组织或细胞抗
19、原，也要视抗原在切片中的封闭程度而定。对某些组视抗原在切片中的封闭程度而定。对某些组织抗原经一种酶消化后，可能结果仍不理想，织抗原经一种酶消化后，可能结果仍不理想，此时可采用双消化法，消化的时间与固定的此时可采用双消化法，消化的时间与固定的时间成反比。时间成反比。第三十一页，本课件共有82页v胰胰蛋蛋白白酶酶，用用于于胞胞浆浆抗抗原原，此此酶酶较较温温和和，浓浓度度及及消消化化时时间间易易控控制制，常常用用0.05%0.1%,PH7.8,37消消化化2030或或更更长长，微微波波37可短时消化。可短时消化。v胃胃蛋蛋白白酶酶，用用于于间间质质抗抗原原，常常用用0.2%PH2.5左左右右，消消化
20、化2030或或更更长长，消消化化后后切切片片应应充充分分洗洗涤涤，否否则则对对组组织织中中抗抗原原会会进进行行缓缓慢慢消消化化，破坏组织结构破坏组织结构第三十二页，本课件共有82页第三十三页，本课件共有82页3 3、高压处理、高压处理家家用用压压力力锅锅，大大小小尺尺寸寸根根据据需需要要而而定定，1000W电电炉炉，多多用用于于核核抗抗原原修修复复，针针对对微微波波修修复复多多阴阴性性，进进行行高高压压处处理理为为阳阳性性，如如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。效果好。将将1500ml3000ml的的柠柠檬檬酸酸盐盐缓缓冲冲液液（工工作作液液）注注入入不不锈锈钢钢压压力力锅锅中中加
21、加热热至至沸沸腾腾。切切片片置置于于金金属属架架上上，放放入入锅锅内内，使使切切片片位位于于液液面面以以下下，盖盖锅锅压压阀阀。当当压压力力锅锅开开始始慢慢慢慢喷喷气气时时（约约加加热热56分分钟钟后后），计计时时12分分钟钟，然然后后将将压压力力锅锅端端离离热热源源，冷冷水水冲冲至至室室温温后后，取取下下气气阀阀，打打开开锅锅盖盖，取取出出切切片片，蒸蒸馏馏水水洗洗后后，PBS洗洗2分分钟钟3，下下接接免免疫疫组化染色步骤。组化染色步骤。第三十四页，本课件共有82页加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开度地提高，其机理推测可能是
22、加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。是十分清楚。第三十五页，本课件共有82页第三十六页，本课件共有82页4.4.抗原修复液的选择抗原修复液的选择 加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等等,目前首目前首选选柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），），优点是染色背景清晰，优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体适合于大多数抗体,Tris和和EDTA两种修复液对部分两种修
23、复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。使用不当易造成假阳性结果的判断。第三十七页，本课件共有82页值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，的抗体，柠檬酸缓冲液（柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于外某些抗体适用于EDTA和和Tris缓冲修复液，一缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择般抗原比较难于表达的抗体多选择EDTA和和Tris缓缓冲修复液。
24、冲修复液。第三十八页，本课件共有82页四、内源性过氧化物酶的灭活四、内源性过氧化物酶的灭活u若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶的封闭处理。性过氧化物酶的封闭处理。u因坏死组织、中性粒细胞及红细胞等均存在丰因坏死组织、中性粒细胞及红细胞等均存在丰富的内源性过氧化物酶，其活性稳定、强，能富的内源性过氧化物酶，其活性稳定、强，能与过氧化氢反应，可使二氨基联苯胺（与过氧化氢反应，可使二氨基联苯胺（DABDAB）还）还原产生棕色反应物与免疫原产生棕色反应物与免疫HRPHRP标记特异性染色相同，标记特异性染色相同，称之为假阳性。称之为假阳性。u故应
25、在染色前将内源酶封闭、消除，常用故应在染色前将内源酶封闭、消除，常用3%H3%H2 2O O2 2，浓度适中，过低达不到阻断作用，过高破坏细胞表浓度适中，过低达不到阻断作用，过高破坏细胞表面抗原，时间控制在面抗原，时间控制在10151015分钟。分钟。第三十九页，本课件共有82页蜕膜组织部分胞核蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞阳性，血管内红细胞过氧化物酶过氧化物酶显色显色第四十页，本课件共有82页坏死组织着色坏死组织着色第四十一页，本课件共有82页内源性生物素内源性生物素肾小管肾小管第四十二页，本课件共有82页vIgG交交叉叉反反应应常常引引起起非非特特异异性性背背景景着着色色，因因不不
26、同同种种系系动动物物分分子子结结构构相相似似，抗抗一一种种动动物物IgG可可与与另另一一种种动动物物IgG交交叉叉反反应应，如如：二二抗抗羊羊抗抗鼠鼠或或羊羊抗抗兔兔血血清清可可与与人人组组织织切切片片上上人人IgG结结合合，呈呈假假阳阳性性，用用二二抗抗同同种种动动物物正正常常血血清清封封闭闭某某些些非非特特异异性性结结合合位位点点，（正正常常血血清清可可提提供供白白蛋蛋白白，与与组组织织内内非非特特异异蛋蛋白白结结合合，含含天天然然抗抗体体中中IgG的的FC段段与与待待检检标标本本FC段段结结合合），一一般般用用10%正正常常血血清清封闭组织封闭组织1015分钟。分钟。五、正常血清封闭五、
27、正常血清封闭第四十三页，本课件共有82页抗体与内源性抗体与内源性IgIg交叉反应：交叉反应：第四十四页，本课件共有82页 六、免疫组化技术掌握共同条件六、免疫组化技术掌握共同条件1 1 免疫组化染色中免疫组化染色中PHPH值和离子浓度对最终结果值和离子浓度对最终结果有影响，磷酸缓冲液（有影响，磷酸缓冲液（PBSPBS）PHPH值中性及弱碱值中性及弱碱性条件性条件(PH7.8)(PH7.8)及低离子强度及低离子强度0.01-0.02M0.01-0.02M，有，有利于免疫复合物形成，而酸性条件及高离子利于免疫复合物形成，而酸性条件及高离子强度有利于分解。通常采用强度有利于分解。通常采用0.01M
28、PH7.2-0.01M PH7.2-7.47.4缓冲液作为反应环境洗涤液。缓冲液作为反应环境洗涤液。第四十五页，本课件共有82页 2.PBS 2.PBS洗涤技术洗涤技术（1 1）洗涤的目的）洗涤的目的 保证离子浓度和保证离子浓度和PHPH值。值。减少非特异反应（抗体不可靠很纯）减少非特异反应（抗体不可靠很纯）（2 2）方法：洗三次，每次）方法：洗三次，每次5 5分钟分钟。第四十六页，本课件共有82页3、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育）、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育）湿湿盒盒孵孵育育，以以防防抗抗体体的的蒸蒸发发和和干干片片。室室温温25或或37孵孵育育451h或或更更长长时时间间或或转转
29、4过过夜夜。通通过过预预实实验验，选选择择合合适适稀稀释释度度，孵孵育育时时间间与与其其成成正正比比。孵孵育育时时避避免免干燥，否则会使抗体活性减低或消失。干燥，否则会使抗体活性减低或消失。第四十七页，本课件共有82页胞浆着色胞浆着色一抗过浓或交叉反应：一抗过浓或交叉反应：p63（乳腺）（乳腺）第四十八页，本课件共有82页七、正确设计实验对照七、正确设计实验对照第四十九页，本课件共有82页u免疫组化染色结果分析的质量取决于正确使免疫组化染色结果分析的质量取决于正确使用各种对照，进行常规免疫组化鉴别诊断需用各种对照，进行常规免疫组化鉴别诊断需设阴性（空白）、阳性、自身、设阴性（空白）、阳性、自身
30、、Vimentin阳阳性性对照。对照。1阴性对照阴性对照u不含靶抗原的组织切片与待检切片进行同样不含靶抗原的组织切片与待检切片进行同样处理，结果应呈阴性处理，结果应呈阴性。u用用PBS替代第一抗体，即空白对照。替代第一抗体，即空白对照。第五十页，本课件共有82页2阳性对照阳性对照 用已证实含有靶抗原组织切片与待检标本进行同样处理用已证实含有靶抗原组织切片与待检标本进行同样处理进行免疫组化染色，结果应为阳性，阳性对照达到目的进行免疫组化染色，结果应为阳性，阳性对照达到目的有两点：有两点：(1)预期得到阴性结果，必须有阳性对照，对肿瘤鉴别预期得到阴性结果，必须有阳性对照，对肿瘤鉴别诊断较为重要，当
31、病理形态诊断与免疫组化结果相反诊断较为重要，当病理形态诊断与免疫组化结果相反时，需用类似肿瘤标本（已知阳性片）作阳性对照。时，需用类似肿瘤标本（已知阳性片）作阳性对照。(2)证明染色技术可靠性，即阴性可靠性，它不是由于标证明染色技术可靠性，即阴性可靠性，它不是由于标本处理使细胞内抗原丧失，方法错误、技术不熟练造成本处理使细胞内抗原丧失，方法错误、技术不熟练造成假阴性。假阴性。第五十一页，本课件共有82页p阳性对照的标本阳性对照的标本1、多组织切片、多组织切片2、“腊肠腊肠”“春卷春卷”切片切片3、组织芯片、组织芯片4、阑尾、阑尾2mm第五十二页，本课件共有82页第五十三页，本课件共有82页3自
32、身对照自身对照 根据组织内有不同细胞，抗原成分复杂特点，抗根据组织内有不同细胞，抗原成分复杂特点，抗体只作用于一种细胞或某种抗原，阴性部位可作体只作用于一种细胞或某种抗原，阴性部位可作为阳性自身对照，应阳性部位可作被检部位阳性为阳性自身对照，应阳性部位可作被检部位阳性对照，如区别血管源性和非血管源性肿瘤，用第对照，如区别血管源性和非血管源性肿瘤，用第八因子相关抗原检测，血管可作阳性对照，正常八因子相关抗原检测，血管可作阳性对照，正常上皮可作检测角蛋白自身对照。此对照用途广，上皮可作检测角蛋白自身对照。此对照用途广，要在结果阳性、阴性分明，背景清晰情况下才能要在结果阳性、阴性分明，背景清晰情况下
33、才能作自身对照。作自身对照。第五十四页，本课件共有82页举例：举例：Vimentin阳性对照阳性对照 vVimentin在免疫组化中作为阳性对照是由在免疫组化中作为阳性对照是由Battifora提出，他提出在每次实验中增加提出，他提出在每次实验中增加Vimentin染色作为染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。程度来进行分析。第五十五页，本课件共有82页vVimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其优选几乎在任何组织中都有表达，尤其优选于活
34、检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组于活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是过度固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中是过度固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况马林固定后抗原表达敏感性情况。第五十六页，本课件共有82页第五十七页，本课件共有82
35、页Vimentin染色结果染色结果第五十八页，本课件共有82页八、八、IHC结果的呈现方式结果的呈现方式常用的显色体系为辣根过氧化物酶常用的显色体系为辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）、碱性）、碱性磷酸酶（磷酸酶（Alkalinephasphotase,AP）和葡萄）和葡萄糖氧化酶（糖氧化酶（Glucoseoxidase,GOD）。常用显色剂有常用显色剂有AEC砖红色砖红色NBT/BCIP蓝紫色蓝紫色DAB棕黄色或棕褐色棕黄色或棕褐色 第五十九页，本课件共有82页HRP的特点是：（的特点是：（1）酶催化的底物）酶催化的底物H2O2是特异是特异的，所形成的产物易
36、于观察；（的，所形成的产物易于观察；（2）反应过程和沉淀）反应过程和沉淀物是稳定的。物是稳定的。其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体可使终产物呈现不同的颜色，选用不同的电子供体可使终产物呈现不同的颜色，如如AEC、DAB。第六十页，本课件共有82页DAB显色原理DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺 氧化聚合吲哚胺多聚体 氧化环化苯乙肼聚合体第六十一页，本课件共有82页lDAB显色的优点：背景清晰，阳性物鲜艳易辨显色的优点：背景清晰，阳性物鲜艳易辨；切片可脱水透明故适合于照相及半永久保存。切片可脱水透明故适合
37、于照相及半永久保存。l缺点：容易氧化，需新鲜配置；有一定的致癌性，缺点：容易氧化，需新鲜配置；有一定的致癌性，注意防护。注意防护。第六十二页，本课件共有82页AEC显色的优缺点显色的优缺点vAEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）即为）即为3-氨基氨基-9-乙基咔唑乙基咔唑v优点：室温下较稳定，较安全优点：室温下较稳定，较安全v缺点：不能进行脱水等处理，且时间长易褪色，不缺点：不能进行脱水等处理，且时间长易褪色，不宜照相。宜照相。第六十三页，本课件共有82页NBT/BCIP染色染色vNBT（硝基蓝四氮唑）（硝基蓝四氮唑）BCIP（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷吲哚磷酸盐）是
38、酸盐）是AP的最佳底物组合之一，显色反应产物为蓝的最佳底物组合之一，显色反应产物为蓝紫色。紫色。vASO-AP+BCIPPH=9.5BCI-OH+PiBCI-OH+NBT 蓝紫色 ASO 等位基因特异的寡核苷酸第六十四页，本课件共有82页免疫组化标准化照片免疫组化标准化照片CK10CD44v6ER第六十五页，本课件共有82页应用免疫组化进行科研设计应用免疫组化进行科研设计第六十六页，本课件共有82页1、采用新抗体，这是最简单的方法、采用新抗体，这是最简单的方法2、旧抗体新用途、旧抗体新用途3、采用新方法（如量子点免疫荧光技术）、采用新方法（如量子点免疫荧光技术）4、同时应用多种抗体进行普通免疫
39、染色或双、同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究两种或两种以上的抗原协同重免疫染色研究两种或两种以上的抗原协同表达，只要选用合理，也会获得新发现。表达，只要选用合理，也会获得新发现。第六十七页，本课件共有82页思考题以检测肝细胞癌组织某一蛋白的表达以检测肝细胞癌组织某一蛋白的表达为例，说说怎样进行实验且实验结果为例，说说怎样进行实验且实验结果理想？理想？第六十八页，本课件共有82页双重和多重标记染色的意义在同一组织或细胞切片上，同时或先后显示两在同一组织或细胞切片上，同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分或其它物质，即为种或两种以上的抗原成分或其它物质，即为双双重或多重标记重或多重
40、标记。采取该方法能同时观察不同抗。采取该方法能同时观察不同抗原或分泌其它物质的各类细胞、组织之间的原或分泌其它物质的各类细胞、组织之间的相互关系，以及抗原物质在细胞内合成、转相互关系，以及抗原物质在细胞内合成、转运及代谢的途径，把形态和功能研究更好地运及代谢的途径，把形态和功能研究更好地结合起来。结合起来。第六十九页，本课件共有82页免疫组化的双重染色技术免疫组化的双重染色技术v可用于显示某组织中的两种不同的抗原可用于显示某组织中的两种不同的抗原v采用经亲和层析纯化并生物素化的二抗与链霉菌素采用经亲和层析纯化并生物素化的二抗与链霉菌素卵白素过氧化物酶和链霉菌素卵白素碱性卵白素过氧化物酶和链霉菌
41、素卵白素碱性磷酸酶交联，其敏感性和特异性均较高。磷酸酶交联，其敏感性和特异性均较高。v采用两种不同的底物采用两种不同的底物/色素色素/酶系统包括酶系统包括BCIP/NBT碱性磷酸酶和碱性磷酸酶和AEC/过氧化物酶，前者显色为紫黑过氧化物酶，前者显色为紫黑色，后者为深红色。色，后者为深红色。v采用两种不同激发波长的量子点如采用两种不同激发波长的量子点如QD605、QD545，前者显色为橙红色，后者为深绿色，前者显色为橙红色，后者为深绿色第七十页，本课件共有82页第七十一页，本课件共有82页注意事项选择选择双重染色双重染色的一抗时，应避免两种一抗的定位（胞的一抗时，应避免两种一抗的定位（胞核、胞浆
42、、胞膜）重复。核、胞浆、胞膜）重复。选择的两种抗体的抗原修复的方法（高压、微波修复选择的两种抗体的抗原修复的方法（高压、微波修复抗原或酶消化等）应尽量相同。抗原或酶消化等）应尽量相同。在进行双重染色之前，必须首先对所选择的一抗分在进行双重染色之前，必须首先对所选择的一抗分别进行单独染色的预实验。预实验的操作条件必须别进行单独染色的预实验。预实验的操作条件必须与双染时的实验条件相同。观察实验结果，抗体定与双染时的实验条件相同。观察实验结果，抗体定位正确后，再进行双染实验。位正确后，再进行双染实验。实验前要脱蜡彻底，实验中要冲洗充分，严格控制操实验前要脱蜡彻底，实验中要冲洗充分，严格控制操作步骤，
43、尽量避免非特异性背景着色。作步骤，尽量避免非特异性背景着色。第七十二页，本课件共有82页一、检测PCNA抗原的表达v可用免疫组织化学方法如S-P法检测大肠癌组织中的抗原表达 以检测人大肠癌组织中以检测人大肠癌组织中PCNA抗原和酸性粘液为例抗原和酸性粘液为例第七十三页，本课件共有82页二、AB染色检测粘液的性质u在动物体和人体中的各种腺体及许多器官组织都在动物体和人体中的各种腺体及许多器官组织都能制造或分泌粘液物质，由于物质中能制造或分泌粘液物质，由于物质中含酸含酸基的基的不同不同,而又分为中性粘液物质而又分为中性粘液物质(neutralmucosubstance)、酸性粘液物质、酸性粘液物质
44、(acidmucosubstance),和混合性粘液物质和混合性粘液物质(mixedmucosubstance),也可称为中性粘多糖、酸性也可称为中性粘多糖、酸性粘多糖和混合性粘多糖。粘多糖和混合性粘多糖。第七十四页，本课件共有82页u酸性粘多糖中含有氨基己糖酸性粘多糖中含有氨基己糖,并含有各种酸根和部并含有各种酸根和部分不含酸根的成分称为酸性粘多糖。此种粘多糖分不含酸根的成分称为酸性粘多糖。此种粘多糖还可分为硫酸化和非硫酸化两类还可分为硫酸化和非硫酸化两类(两型两型)。第七十五页，本课件共有82页u强硫酸化粘多糖主要见于皮肤强硫酸化粘多糖主要见于皮肤,动脉和肺、软骨、角动脉和肺、软骨、角膜和
45、肥大细胞膜和肥大细胞;弱硫酸化粘多糖多见于领下腺弱硫酸化粘多糖多见于领下腺,结肠、结肠、气管和支气管的杯状细胞。非硫酸化粘多糖气管和支气管的杯状细胞。非硫酸化粘多糖,多见于眼多见于眼球、球、脐带脐带,还有气管、支气管还有气管、支气管,肠道杯状细胞肠道杯状细胞,唾液唾液腺的粘液细胞。腺的粘液细胞。第七十六页，本课件共有82页u粘液物质用于一般粘液性疾病粘液物质用于一般粘液性疾病;肿瘤方面的胃癌肿瘤方面的胃癌,粘液瘤和粘液肉瘤、软骨粘液样纤维瘤粘液瘤和粘液肉瘤、软骨粘液样纤维瘤,横纹横纹肌肉瘤肌肉瘤,动脉粥样硬化和胶原病及慢性胃炎的肠动脉粥样硬化和胶原病及慢性胃炎的肠上皮化生等。在显示粘液物质中上
46、皮化生等。在显示粘液物质中,一般选用一般选用AB法作为鉴别诊断的重要指标。法作为鉴别诊断的重要指标。第七十七页，本课件共有82页染色的基本原理是因为阿尔辛蓝染色的基本原理是因为阿尔辛蓝或爱先蓝或爱先蓝(alcianblue,AB)分子中带正电荷分子中带正电荷的盐键能够与酸性粘液物的盐键能够与酸性粘液物质中带负电荷的酸性基因进行结合。质中带负电荷的酸性基因进行结合。第七十八页，本课件共有82页爱先蓝爱先蓝(AB)是一种水溶性的多价碱性染料是一种水溶性的多价碱性染料,它呈它呈现蓝色主要是由于结构中有铜的存在。当采用现蓝色主要是由于结构中有铜的存在。当采用3%的乙酸作用溶剂时的乙酸作用溶剂时(pH=
47、2.5)它能与硫酸、羧酸它能与硫酸、羧酸及其盐类的酸性蛋白黏多糖形成盐键及其盐类的酸性蛋白黏多糖形成盐键,从而将它们从而将它们染成蓝色。染成蓝色。第七十九页，本课件共有82页染色步骤v(1)DAB显色后的切片显色后的切片蒸蒸馏馏水冲洗水冲洗3min3次。次。v(2)1爱先蓝爱先蓝（PH2.5），滴染），滴染10min，流水洗，流水洗，蒸蒸馏馏水冲洗水冲洗2min2次次v(3)梯度酒精梯度酒精脱水脱水,二甲苯透明二甲苯透明,中性树胶封中性树胶封固固。结果结果酸性粘液物质呈蓝色酸性粘液物质呈蓝色第八十页，本课件共有82页第八十一页，本课件共有82页感感谢谢大大家家观观看看2/28/2023第八十二页，本课件共有82页