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1、关于免疫学检测方法第一页，本课件共有68页第二页，本课件共有68页第三页，本课件共有68页检测技术种类检测技术种类 一、免疫学检测免疫学检测a 免疫凝集试验免疫凝集试验a 免疫沉淀试验免疫沉淀试验a 酶联免疫试验酶联免疫试验a 荧光免疫技术荧光免疫技术a 免疫电镜技术免疫电镜技术a 免疫印迹试验免疫印迹试验第四页，本课件共有68页第五页，本课件共有68页细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价凝集法测定哈维氏弧菌抗体
2、的效价 管号管号1 12 23 34 45 56 67 7磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液0.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.90.91.01.0兔抗兔抗X X菌血清菌血清0.10.10.1(10.1(1)0.1(20.1(2)0.1(0.1(3)3)0.1(0.1(4)4)0.1(50.1(5)0.00.01.1.稀释抗体稀释抗体2.2.玻片凝集法玻片凝集法A.A.用用1ml1ml移液枪取移液枪取6 6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴磷号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的
3、X X菌液。菌液。B.B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。C.C.后取后取5 5、4 41 1号管的溶液逐个重复号管的溶液逐个重复1 1、2 2步骤。步骤。D.D.取有凝集块变为无凝集块时取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。第六页，本课件共有68页第七页，本课件共有68页第八页，本课件共有68页第九页，本课件共有68页沉淀凝集反应沉淀凝集反应第十页，本课件共有68页第十一页，本课件共有68页第十二页，本课件共有68页第十三页，本课件共有68页第十四页，本课件共有68
4、页双向免疫扩散沉淀线示意图双向免疫扩散沉淀线示意图第十五页，本课件共有68页琼扩反应第十六页，本课件共有68页第十七页，本课件共有68页第十八页，本课件共有68页中和实验第十九页，本课件共有68页荧光免疫技术 荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫化学和荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术的高度精确血清学的高度特异性和敏感性与显微技术的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学及实验室诊断提性相结合，为免疫学、临床组织化学及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的、并有其独特风格的供了一项其它方法尚不能取代的、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛应
5、用于细菌、病毒、原虫技术。目前，该技术已广泛应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相应病的诊断，血清抗体的检查，以及真菌等的鉴定和相应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复病理组织学抗原、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的合物病理的研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，研究等方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解决，敏感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。结果判定的客观性不足，技
6、术程序也比较复杂。第二十页，本课件共有68页1 1、原理、原理 荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。荧光免的光能，发射出波长较照射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免疫组织化学技术和荧光测定疫技术可分为荧光免疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体技术属于前者，它是利用
7、某些荧技术。荧光抗体技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化学方法与特异性抗体结合，形成的免光素通过化学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又可此借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和补体荧光抗体法。光抗体法。第二十一页，本课件共有68页荧光色素o异硫氰酸荧光素（FITC）o四乙基罗丹明（RB200）o四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)第二十二页，本课件共有68页1、荧光抗体染色方法、荧光抗体染色方法
8、 直接法直接法 间接法间接法2、荧光抗体技术的应用、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用其它方面的应用第二十三页，本课件共有68页间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。室温晾干。（2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体，加在血细胞抗原上。37湿盒中孵育45min。（3）0.01M PBS洗三次，每次5min。（4）加第二抗体IgG-FITC，37湿盒中孵育45min。（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。（6）甘油封片，荧光镜下观
9、察，拍照。第二十四页，本课件共有68页间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病第二十五页，本课件共有68页间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒第二十六页，本课件共有68页第二十七页，本课件共有68页第二十八页，本课件共有68页第二十九页，本课件共有68页直接ELISA第三十页，本课件共有68页间接ELISA第三十一页，本课件共有68页间接酶联免疫吸附试验间接酶联免疫吸附试验操作步骤如下：操作步骤如下：（1 1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。3737湿盒中孵育湿盒中孵育60min60m
10、in。（2 2）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（3 3）加）加AP-IgG AP-IgG 为第二抗体，为第二抗体，3737湿盒中孵育湿盒中孵育45min45min。（4 4）0.01M PBS0.01M PBS洗三次，每次洗三次，每次5min5min。（5 5）加）加NBT/BCIPNBT/BCIP底物缓冲液发色底物缓冲液发色10min10min，（6 6）出现颜色加终止液终止反应。）出现颜色加终止液终止反应。（7 7）用酶标分析仪在）用酶标分析仪在405nm,405nm,处测定各孔的吸光度，计算处测定各孔的吸光度，计算P PN N（样品光吸收值
11、与阴（样品光吸收值与阴性对照的值），判定性对照的值），判定ELISAELISA反应结果。大于反应结果。大于2.12.1时可判断为阳性。以最大时可判断为阳性。以最大显色至阳性的显色孔显色至阳性的显色孔50%50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。第三十二页，本课件共有68页第三十三页，本课件共有68页图 DOT BLOT方法筛选结果图。第三十四页，本课件共有68页免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布第三十五页，本课件共有68页细胞免疫化学法检测病毒感染第三十六页，本课件共有68页四、四、Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。是蛋白水平检测
12、，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤原理及步骤 样品样品 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS-PAGE )转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质第三十七页，本课件共有68页West Blot 第三十八页，本课件共有68页图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果第三十九页，本课件共有68页第四十页，本课件共有68页免疫电镜技术免疫电镜技术（免疫电镜技术（immune electron microscopic techniqueimmune electron micros
13、copic technique）是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子水平。主要有以下几种技术。水平。主要有以下几种技术。铁蛋白抗体法铁蛋白抗体法酶标记抗体法酶标记抗体法重金属标记抗体法重金属标记抗体法第四十一页，本课件共有68页图 胶体
14、金标记免疫电镜结果(A)(D)bar=200 nm;(B)(C)bar=100 nm第四十二页，本课件共有68页胶体金免疫技术o胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所有的大分子物质都可被金标记，而且标记后大分子物质活性不发生改变。o当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原抗体结合处为黑褐色的颗粒。第四十三页，本课件共有68页 斑点免疫金渗滤法（斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用）的应用 与研究进展与研究进展 是是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检世纪八十年代发展起来的一种免疫学
15、检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和和HIV等。等。第四十四页，本课件共有68页斑点免疫金渗滤法原理斑点免疫金渗滤法原理：NCM为固相载体-通过渗滤-抗原与抗体在膜上快速反应-标记的胶体金堆积显色。胶体金胶体金抗体抗体抗原抗原NCM吸水垫吸水垫第四十五页，本课件共有68页 临床应用：临床应用：v 间接法测抗体：间接法测抗体：NCM 抗原-样品抗体-金标抗抗体显色v 夹心法测抗原夹心法测抗原：NCM多抗-样品抗原-金标单抗显色。第四十六页，本课件共有68页 直接法检测抗原
16、直接法检测抗原 NCM病毒病毒-金标单抗显色金标单抗显色 DIGFA步骤简化、时间缩短。第四十七页，本课件共有68页v DIGFA检测操作程序检测操作程序a.2l检测样品-NCM-直径2mm点-晾干；100l封闭液，渗入；100l的金标抗体，渗入；e.100l 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20），渗入；检测结果：红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴性红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴性。阳性代表检测样品中有病毒，阴性则无。第四十八页，本课件共有68页 DIGFA检测结果检测结果,红色斑点的为病毒阳性红色斑点的为病毒阳性,无红色斑点的为病毒阴性。无红色斑点的为病毒阴性。The
17、 result of DIGFA,red dot shows there is WSSV,otherwise,there is no WSSV.第四十九页，本课件共有68页 免疫金标层析法的应用与研究进展免疫金标层析法的应用与研究进展 免疫金层析法快速诊断试纸条是免疫金层析法快速诊断试纸条是2020世纪世纪9090年代以来在单克隆抗体技术、胶体金年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术 医学：医学：医学：医学：乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白T、HCGHCG 兽医
18、：兽医：猪瘟抗体猪瘟抗体 食品：食品：食品：食品：克伦特罗（瘦肉精）、氯霉素克伦特罗（瘦肉精）、氯霉素 其他：其他：饲料中的磺胺类药物残留物、转基因产品第五十页，本课件共有68页o检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标单抗单抗-抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处的抗体会识别先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗该复
19、合物中抗原，反应的结果便形成了金标单抗+抗原抗原+包被单抗的夹心结构，最终是金标单抗上的胶体金包被单抗的夹心结构，最终是金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前行应的金标单抗则仍继续层析前行,当到达点预先包被在当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金标单抗被其结合住，从而在此质控线羊抗鼠抗体处时，金标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不色线，结果是：检测线显示红色表
20、示样品阳性；检测线不显示红色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有显示红色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标单效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是金标单抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。抗、或是羊抗鼠抗体失活，检测结果无效。第五十一页，本课件共有68页该试纸条构成:载体板7；在该载体板7的两端部，分别设有加样端4吸水层和手持端1吸水层；在该载体板7中部段设有硝酸纤维膜的检测层2，在该检测层2与加样端4吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块3，该层块3一端部分设置在加样端4吸水层之下，其另一端部分设置在检测层2之上；
21、在与该层块3延续的检测层2上设有检测线6和质控线5，该检测线6和质控线5处分别包被有抗病毒单抗和羊抗鼠IgG。第五十二页，本课件共有68页 用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。直接化学发光免疫分析第五十三页，本课件共有68页发光Y YY YY Y磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体Y
22、 YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后-夹心法（1）加入H2O2（pH10）直接化学发光的机理第五十四页，本课件共有68页磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点已结合的抗原和抗体与未结合部分的易分离磁微粒技术第五十五页，本课件共有68页五、聚合酶链反应（五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）PCR是模拟体内是模拟体内DNA复制复制条件，应用条件，应用DNA聚合酶反聚合酶反应，特异性扩增某一应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化片段的技术。体外程序化的的DNA合成技术。
23、合成技术。Kary B.Mullis第五十六页，本课件共有68页第五十七页，本课件共有68页PCR第五十八页，本课件共有68页ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3:Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATC
24、TCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA第五十九页，本课件共有68页原原 理：理：1)合成待扩增区域两端已知序列，与模板合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；长度；2)反应体系：反应体系：DNA模板，模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，聚合酶，buffer3)反应程序：反应程序：变性变性 (9495oC)复性复性 延伸延伸 (3755 oC)(7072 oC)72 oC延伸延伸10min 30-35c
25、ycles DNA扩增扩增100万倍万倍第六十页，本课件共有68页PCR扩增第六十一页，本课件共有68页PCR特点及应用特点及应用：优点：优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板）微量的模板DNA即可扩增大量产物。即可扩增大量产物。应用：应用：（1）基因组）基因组DNA分析；分析；（2）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。）遗传病的诊断。缺点：缺点：（1）需靶）需靶DNA序列的信息；序列的信息；（2）产物短小，）产物短小，DNA复制不精确。复制不精确。第六十二页，本课件共有68页原位杂交技术o是一种能够从形态学上证
26、明特异性的DNA和RNA存在于制备的个别细胞，组织部分，单细胞或染色体中的技术。o原理是含有互补序列（探针）的被标记的单链DNA或RNA片段在适当的条件下与细胞的DNA或RNA杂交形成稳定的杂交体。第六十三页，本课件共有68页o间接标记：将半抗原（如生物素或地高辛）附着于探针上，然后用标记的结合蛋白（如亲和素）检测或者用特异性的抗体检测靶探针杂交体。第六十四页，本课件共有68页冰冻切片冰冻切片4多聚甲醛固定多聚甲醛固定酸处理酸处理蛋白酶蛋白酶K消化消化后固定后固定预杂交预杂交碱变性碱变性加入变性探针，加入变性探针，38杂交杂交12 16 h 漂洗漂洗显色显色中性红衬染中性红衬染脱水，封片脱水，封片原位杂交原位杂交第六十五页，本课件共有68页预杂交（预杂交（65，2 h）加入碱性磷酸酶标记的抗加入碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体抗体 样品变性样品变性点样点样固定固定杂交过夜杂交过夜洗膜洗膜平衡膜平衡膜显色显色观察结果观察结果斑点杂交法（斑点杂交法（Dot-Blot）第六十六页，本课件共有68页通过原位杂交技术检测感染LCDV牙鲆的囊肿细胞、肾、肠和鳃。阳性部位有蓝色沉积物（箭头所示），bar=50 m。第六十七页，本课件共有68页感感谢谢大大家家观观看看2/28/2023第六十八页，本课件共有68页