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1、关于分子克隆的工具酶第一页，本课件共有182页切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质第二页，本课件共有182页任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶限制性内切酶修饰酶修饰酶第三页，本课件共有182页第一节第一节限制性内切酶限制性内切酶Restrictionendonuclease第四页，本课件共有182页一、限制与修饰Restrictionandmodification50年代初，发现hostcontrolledspecific
2、ity噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。第五页，本课件共有182页E.coliKE.coliBE.coliCKBC第六页，本课件共有182页E.coliKE.coliBE.coliCKBC11110-410-410-410-411第七页，本课件共有182页说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤C5甲基-胞嘧啶第八页，本课件共有182页2.限制酶的发现限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶需要A
3、TP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点远离识别位点1000bp以上第九页，本课件共有182页1970年美国约翰霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶第十页，本课件共有182页5.GTPyPuAC.33CAPuPyTG.5GTCGACGTTAACGTCAACGTTGACYRPy表示嘧啶，Pu表示嘌呤第十一页，本课件共有182页5.GAATTC.33CTTAAG.5EcoRI第十二页，本课件共有182页3.
4、限制酶的命名限制酶的命名宿主宿主属名第一字母、种名头两个字母属名第一字母、种名头两个字母菌株或型号菌株或型号序号序号罗马字罗马字HindIIEcoRI第十三页，本课件共有182页例如：例如：Hin Hin d d H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae（流感嗜血杆菌），（流感嗜血杆菌），：表示菌系为型血清型；：表示菌系为型血清型；：表示分离到的第三个限制酶。：表示分离到的第三个限制酶。EcoEco RIRIE Escherichia scherichia cocolili RIRI EcoRIEcoRI表示基因位于表示基因位于Escheric
5、hia coliEscherichia coli中的抗药性中的抗药性R R质粒上质粒上 HinHin ddH Haemophilusaemophilus ininfluensae fluensae d d SacSac I(II)I(II)Streptomyces achromogenes I I()第十四页，本课件共有182页第第类酶类酶（切割部位无特异性切割部位无特异性）：如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg+等辅助因子第第类酶（切割部位有特异性类酶（切割部位有特异性）：如EcoRI(大肠杆菌)、Hind(嗜血杆菌)，分子量
6、较小(约20000-100000)，作用时需Mg+存在4 4、限制性内切酶的分类：、限制性内切酶的分类：III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：切点不专一，往往不在识别位点内部。NEB；Invitrogen公司；promega普洛麦格；TakaRa.第十五页，本课件共有182页二、限制酶的识别序列二、限制酶的识别序列2 2、识别特定碱基顺序、识别特定碱基顺序：2 2、1 1 回文对称序列回文对称序列（palindrome，从两个方从两个方向阅读其序列相同的序向阅读其序列相同的序列）。列）。1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率 6 碱基酶 稀有切割
7、限制酶第十六页，本课件共有182页R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T S=C or G W=A or TH=A or C or T B=C or G or T V=A or C or G D=A or G or TN=A or C or G or T第十七页，本课件共有182页 EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-53 3、型限制性核酸内切酶的切割方式型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和和-CCTCAGCGGAGTCGBbvcI I
8、第十八页，本课件共有182页三、限制酶产生的末端种类三、限制酶产生的末端种类 1.1.粘性末端粘性末端 ）-端突起，端突起，）-端突起，个数为或个核苷酸端突起，个数为或个核苷酸第十九页，本课件共有182页2.平末端平末端SmaI5-CCCGGG-35-CCCGGG-33-GGGCCC-53-GGGCCC-5在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIIIGGCC EcoRVGATATC XmnIGAANNNNTTC第二十页，本课件共有182页3.非对称突出端非对称突出端来自非对称识别序列来自非对称识别序列CCTCAGCBbvCIGGAGTCG第二十一页，本课件共有182页简并序列AccIGT/M
9、KACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC第二十二页，本课件共有182页间隔序列DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG第二十三页，本课件共有182页4.同裂酶同裂酶1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶限制酶2.特点：特点：1）识别相同顺序）识别相同顺序2）切割位点的异同）切割位点的异同 KpnIGGTACCAsp718GGTACC SstICCGCGGSacICCGCGG第二十四页，本课件共有182页同序同切这些酶识别序列和切割位置都相同HindIIHincIIGTY/RACHpaIIHap
10、IIC/CGGMobISau3AI/GATC第二十五页，本课件共有182页同序异切KpnIGGTAC/CAcc65IG/GTACCAsp718IG/GTACCAatIIGACGT/CBsaHIGR/CGYC识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同第二十六页，本课件共有182页“同功多位”EcoRIG/AATTCApoIR/AATTYHpaIGTT/AACHincIIGTY/RAC许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoR识别和切割位点为GAATTC，Apo识别和切割位点为RAATTY，后者可识别前者的序列。第二十七页，本课件共有182页其它SalIG/TCGACAccIGT/
11、MKACHincIIGTY/RAC第二十八页，本课件共有182页许多不同的限制酶来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。5 5、同尾酶（、同尾酶（isocaudamerisocaudamer）：）：GATC 4个核苷酸组成的粘性末端平端同裂酶第二十九页，本课件共有182页四、四、DNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割
12、活性。双酶切PCR产物第三十页，本课件共有182页2hr20hrAccICCGGTCGACCGG00HindIIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG10%75%EcoRIGGAATTCC9090第三十一页，本课件共有182页PstI GCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAG(N)149090CTGCAG(N)2000第三十二页，本课件共有182页1、保护碱基 限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基
13、。PCR引物设计时，为保护5端外加的内切酶识别位点，使酶切完全而添加.第三十三页，本课件共有182页 比如设计引物5端导入酶切位点的时候,一般导入34个;导入的碱基,最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好).别的就没什么了.加几个和加哪几个的问题 http:/ 载体的酶切位点也会碰到，相临的2个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。第三十五页，本课件共有182页第三十六页，本课件共有182页第三十七页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCC
14、TGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base第三十八页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base第三十九页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPst
15、IEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base第四十页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base第四十一页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficienc
16、y XhoI97%1base PstI37%1base第四十二页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstIEcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base第四十三页，本课件共有182页EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI第四十四页，本课件共有182页
17、EcoRIinitialcutL1TMUS29cleavageefficiency XhoI97%1base PstI37%1base.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstIXhoI:1 EcoRI100%PstI:1 EcoRI88%第四十五页，本课件共有182页五、位点偏爱(sitepreferences)单位酶:在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1小时，使1gDNA完全消化所需的酶量DNA第四十六页，本课件共有182页某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割
18、效率的现象称作位点偏爱。第四十七页，本课件共有182页*1975EcoRI切割phage(Lambda)中的5个位点，并不是随机的，靠近右端的位点，比分子中间的位点切割快10倍。1.现象第四十八页，本课件共有182页*有4个SacII位点三个在中央一个在右臂（Right-terminus）at40,386中央三个快50倍第四十九页，本课件共有182页NEB检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍的范围上，但有许多酶有较大的差异,如NarI,NaeISacIIGGCGCC,GCCGGC,CCGCGG第五十页，本课件共有182页(1)pBR322含4个NarI位点1单位酶1hr(标准条件)将两个位
19、点完全切割但是另外两个位点50单位,16小时不能完全切割完全第五十一页，本课件共有182页(2)NaeI在pBR322也有4个位点，其中两个易切割，有一个有点慢,第四个慢50倍。在DNA上NarI和NaeI各都有一个位点，但是过量的酶只能完成部分酶切。第五十二页，本课件共有182页2.原因(1)在切割DNA之前需要同时与两个识别位点相作用第五十三页，本课件共有182页plasmidPlasmid/SalIPlasmid/EagI第五十四页，本课件共有182页六、酶切反应条件任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件第五十五页，本课件共有182页(一)缓冲液1.常规缓冲液pH,Mg+,DTT,B
20、SA(10X)Mg2+的作用是提供二价的阳离子。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。第五十六页，本课件共有182页pH7.0-7.9(at25)Tris-HCl,乙酸Tris-HCL的作用在于，使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。离子强度：NaCl高中低100mM50mM0第五十七页，本课件共有182页Mg+10mMMgCl2,MgAcDTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)1mM100g/mlBSA少数需要第五十八页，本课件共有182页不同酶具有不同Buffer各公司设立几种常用BufferNEBuffer1NEBuff
21、er2NEBuffer3NEBuffer4BufferABufferBBufferHBufferLRoche第五十九页，本课件共有182页对DNA进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量NaCl和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化）。第六十页，本课件共有182页2.通用缓冲体系Phamacia法玛西亚One-Phor-Allbufferplus,OPA+第六十一页，本课件共有182页3.注意事项a.取少量酶(方法or稀释)b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积d.反应时间的延长e.
22、分装（对于多个反应）第六十二页，本课件共有182页(二)反应温度大多数为37一部分为50-65少数25-30高温作用酶于37时活性多数10-50%TaqI(65)10%,ApoI(50)50%第六十三页，本课件共有182页(三)反应时间1hrormore许多酶延长其反应时间可减少酶的用量16hrEcoRI0.13(1/8)HindIII(1/8)KpnI(1/4)BamHI(1/2)HaeIII(1/1)第六十四页，本课件共有182页(四)反应终止1.EDTA终10mMEDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应2.加热37酶6520minotherwise8020min第六十五页，本课件共有18
23、2页不失活在8020min的酶37：Bg1IIHpaIPvuII65：Tth111ITspRI50：Bc1I第六十六页，本课件共有182页3.其它DNA纯化(苯酚,试剂盒)第六十七页，本课件共有182页七、星星活性(staractivity)非特异性切割在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性1.概念第六十八页，本课件共有182页实际上星星活性是限制内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。ApoI、AseI、BamHI、BssHII、EcoRI、EcoRV、HindIII、Hinf1、KpnI、PstI、PvuII、SalI
24、、ScaI、TaqI、XmnI第六十九页，本课件共有182页2.酶的特异性变化方式与酶的种类和所应用的条件有关最普遍的活性变化1个碱基的变化识别位点外层碱基的随意性以及单链缺口第七十页，本课件共有182页3.引起星星活性的因素高浓度甘油（5%）酶过量（100U/g）低离子强度（pH8.0)第七十一页，本课件共有182页有机溶剂PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane用其它二价阳离子代替Mg+Mn+，Cu+，Co+,Zn+第七十二页，本课件共有182页不同的酶对上述条件的敏感
25、性不一样PstI比EcoRI对高pH更敏感但后者对甘油浓度更敏感星星活性在绝大多数情况下，是可控制的第七十三页，本课件共有182页4.抑制星星活性的条件（措施）减少酶的用量，避免过量酶切,减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶济或乙醇提高离子强度到100150mM(如果不会抑制的话)降低反应pH至pH7.0使用Mg+作为二价阳离子第七十四页，本课件共有182页1.外因外因外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应加酶、操作是否恰当、反应
26、体积的选择以及反应时间的长短等等。时间的长短等等。九、影响活性的因素九、影响活性的因素第七十五页，本课件共有182页2.“内因内因”位点偏爱性位点偏爱性 甲基化甲基化 底物的构象底物的构象构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割DNA相比，EcoR、Pst、Sal需要至少2.5-10倍的酶来切割pBR322的超螺旋DNA。PaeRT与Xho切割相同的序列（CTCGAG），但如果5端为CT则 PaeRT不能切割。第七十六页，本课件共有182页十、十、酶切位点的引入（酶切水平）第七十七页，本课件共有182页1.产生的产生的5突出端补平后连接突出端补平后连接EcoRIGAATT
27、CCTTAAG第七十八页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIEcoRIPstI第七十九页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoIPstI第八十页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstI第八十一页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstI第八十二页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGC
28、TCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAA第八十三页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAA第八十四页，本课件共有182页.CTCGAGGAATTCCTGCAG.GAGCTCCTTAAGGACGTC.XhoI PstIAATTTTAAAceIATTAATXmaIGAANNNNTTC第八十五页，本课件共有182页2.同尾末端的连接同尾末端的连接BamHI(G/GATCC)+BclI(T/GATCA)AlwI(GGATC4/5)第八十六页，本课件共有182页3.平端连接平端连接PvuI
29、I(CAGCTG)+EcoRV(GATATC)MobI(GATC)第八十七页，本课件共有182页十一、十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性GC%酶切位点出现的机率BamHIGGATCCEcoRIGAATTC第八十八页，本课件共有182页在基因组中，碱基对的排列是非均匀的因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的平均片段大小在E.coliAscI(GGCGCGCC)20kbNotI(GCGGCCGC)200kbEcoRI/HindIII5kbSpeI(ACTAGT)60kb第八十九页，本课件共有182页细菌基因组在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所
30、以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少酵母基因组G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNAorTyelements)，富含G+C的识别序列就特别少第九十页，本课件共有182页哺乳动物细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的第九十一页，本课件共有182页第二节第二节甲基化酶MethylaseMethylationmethyltransferase第九十二页，本课件共有182页一、一、甲基化酶的种类在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多数都有三个位点
31、特异性的DNA甲基化酶第九十三页，本课件共有182页1.Dam甲基化酶甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基第九十四页，本课件共有182页 PvuIIBamHIBclIBglIIXhoIIMboISau3AI识别位点中含GATC序列ClaI(1/4)XbaI(1/16)TaqI(1/16)MboII(1/16)HphI(1/16)部分识别序列含GATC序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列第九十五页，本课件共有182页有些限制酶对有些限制酶对Dam甲基化敏感甲基化敏感不能切割相应的序列不能切割相应的序列BclI,ClaI,MboI,XbaI等等不敏感的有不敏感的有BamHI,Sa
32、u3AI,BglII,PvuI等等第九十六页，本课件共有182页一般哺乳动物一般哺乳动物DNA不会在不会在A-N6上甲基化上甲基化当需要在敏感位点上完全切割当需要在敏感位点上完全切割DNA时，时，必须从必须从dam-E.coli中提取中提取DNA第九十七页，本课件共有182页2.Dcm甲基化酶甲基化酶识别识别CCAGG或或CCTGG序列序列在第二个在第二个C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基第九十八页，本课件共有182页EcoRII/BstNICCA(T)GG二者识别序列相同，但切点不同二者识别序列相同，但切点不同EcoRII受受dcm甲基化作用影响甲基化作用影响BstNI可避免这一影响可避
33、免这一影响第九十九页，本课件共有182页受影响酶有：受影响酶有：Acc65IGGTACCAlwNIApaIGGGCCCEcoRIIEaeI等等不受影响酶有：不受影响酶有：KpnI GGTACCBanIIBg1IBstNINarIGGCGCC等等第一百页，本课件共有182页二、二、甲基化对限制酶切的影响1.修饰酶切位点HincIIGTCGACGTCAACGTTGACGTTAACM.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割第一百零一页，本课件共有182页BamHIGGATCCM.MspIm5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG，那么M.
34、MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割第一百零二页，本课件共有182页 构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA用M.EcoRI甲基化酶处理，然后加上合成的EcoRI接头当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割第一百零三页，本课件共有182页2.产生新酶切位点TCGATCGAAGCTAGCTTaqITaqIM.TaqITCGA*TCGA*AGCT*AGCT DpnI第一百零四页，本课件共有182页第三节第三节DNA聚合酶DNApolymerase催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性第一百零五页，本课件共有182页第一百零
35、六页，本课件共有182页真核细胞有4种DNApoly：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出提出，与细胞增生无关。：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。第一百零七页，本课件共有182页原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关I单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长II与低分子脱氧核苷酸链的延长有关III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I EcoliDNApolymeraseI第一百零八页，本课件共有182页1.活
36、性活性单链多肽(109kDa)三种活性 53DNA聚合酶活性底物:模板(ssDNA),引物（带3OH基）或5突出DsDNAMg2+dNTPDNApolyI第一百零九页，本课件共有182页53外切核酸酶活性底物:dsDNA or DNA:RNA杂交体活性：从5端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性)Mg2+DNApolyI+dNTP第一百一十页，本课件共有182页35外切酶活性底物：3-OH dsDNA or ssDNA活性：从3-OH端降解DNA，可被53聚合活性封闭。Mg2+DNApolyI+dNTPMg2+DNApolyI+dNTPProofreading
37、第一百一十一页，本课件共有182页反应平衡过量dNTP平端第一百一十二页，本课件共有182页2.用途切口平移法标记DNANicktranslation（所有DNApoly中只有此有此活性）第一百一十三页，本课件共有182页 Mg2+,低限量DNase IdNTP DNApoly I产生切口切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5-3方向平移若有放射性dNTP,则可标记成探针第一百一十四页，本课件共有182页 用于cDNA克隆中的第二链即单纯的DNA聚合活性但由于有5-3外切活性，已不再使用，而改用Klenow酶和反转录酶第一百一十五页，本课件共有182页 末端标记（交换或置换反应）Mg2+
38、,DNApolyI-P32dATPA*TT4 DNApolyT7 DNApoly 更好第一百一十六页，本课件共有182页二、Klenow酶E.coliDNApolymeraseIlargefragmentKlenowfragment在蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解,从全酶中除去53外切活性片段，而聚合活性和35外切活性不受影响，或基因工程而得76kDa第一百一十七页，本课件共有182页大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的KlenowKlenow片段片段KlenowKlenow聚合酶或聚合酶或KlenowKlenow大片段酶大片段酶大肠杆菌DNA聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶全酶全酶 大
39、片段 Klenow 小片段具有5 3的聚合活性和3 5核酸外切酶活性，5 3的核酸外切酶活性枯草杆菌蛋白酶第一百一十八页，本课件共有182页1.活性共两种,同 DNApoly I2.作用 补平3凹端，注意要用 dNTP 抹平3凸端，注意必须加足量dNTP T4和T7具更强3-5外切活性。末端标记 A置换反应 同前,同样被T4poly代替 B补平3-凹端的过程进行标记第一百一十九页，本课件共有182页第一百二十页，本课件共有182页第一百二十一页，本课件共有182页 cDNA克隆中合成第二链随机引物标记DNA测序（Sanger双脱氧链末端终止法）被T7取代，Taq等PCR酶。PCR反应被Taq等
40、取代在体外诱变中，用于从单链模板合成dsDNA仅利用DNA合成活性第一百二十二页，本课件共有182页三、T4噬菌体DNA聚合酶 T4 DNA polymerase来源于T4 phage感染的E.coli 114kDa第一百二十三页，本课件共有182页1.活性由噬菌体基因编码的，具有两种酶催活性具有两种酶催活性，即53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。与Klenow酶相似，但35外切活性强200倍 第一百二十四页，本课件共有182页2.用途 补平或标记3 凹端 必须有高浓度dNTP（末端标记）置换反应 必须有高浓度dNTP(一种)末端标记第一百二十五页，本课件共有182页 标记DNA片段 即利
41、用外切活性产生了3凹端 再补平（用标记的dNTP）第一百二十六页，本课件共有182页第一百二十七页，本课件共有182页T4 DNA T4 DNA 聚合酶和取代合成法标记聚合酶和取代合成法标记DNADNA片段片段第一百二十八页，本课件共有182页四、T7噬菌体DNA聚合酶T7 DNA polymerase来源于T7 phage感染的E.coli为两种紧密结合的蛋白质复合体(基因5蛋白和宿主的硫氧还蛋白)第一百二十九页，本课件共有182页T7DNApoly为持续合成能力最强的一个 平均长度要大得多,在测序时具有优势活性/功能与T4DNApoly、Klenow类似 但3 5外切活性为Klenow的1
42、000倍用途:A.替代T4的功能B.长模板的引物延伸第一百三十页，本课件共有182页修饰的 T7 DNA polymerase99%35外切活性被除去（V1.0）完全除去（V2.0）用于测序反应（测序酶）Sequenase USB Biochemical第一百三十一页，本课件共有182页1.1.特点：特点：分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生栖热菌，分子量为94,00094,000，最适反应温度，最适反应温度7575，对对9595高温具良好稳定性，该酶不存在高温具良好稳定性，该酶不存在3355外切酶活性外切酶活性2.2.用途：用途：主要用于主要用于DNADNA的体外扩增，经的体外扩增，经252
43、5次循环后才进入酶的反应稳次循环后才进入酶的反应稳定期，一个定期，一个DNA DNA 分子因而可被扩增分子因而可被扩增41064106倍倍 DNADNA扩增技术又称为扩增技术又称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，它包括以，它包括以下三个步骤：下三个步骤：DNADNA模板变性模板变性(95)(95)与与DNADNA引物退火引物退火(45)(45)引物延引物延伸伸(75)(75)五五.Taq DNA.Taq DNA聚合酶聚合酶 耐热DNA聚合酶第一百三十二页，本课件共有182页六、反转录酶 Reverse transcriptaseReverse transcriptase依赖于RNA的DNA聚合酶
44、1种类 来自AMV禽成髓细胞瘤病毒Mo-MLV(M-MuLV)Moloney鼠白血病病毒5 3合成DNA无3 5外切活性第一百三十三页，本课件共有182页第一百三十四页，本课件共有182页 AMV二链多肽(62kDa/94kDa)具53DNA聚合活性具很强的RNA酶H活性(降解与DNA杂交的RNA)在反应开始时,引物和mRNA模板杂交体可成为RNaseH的底物,此时模板的降解和cDNA的合成相竞争第一百三十五页，本课件共有182页反应终止时，RNase H 可在正在增长的 DNA链近3端切割模板 趋向于抑制cDNA的产量并限制其长度但在42(鸡的正常体温),能有效发挥DNA合成作用，能有效地拷
45、贝较复杂的mRNA 早期提纯过程中易被内切酶污染,cDNA不超过1kb,现已解决第一百三十六页，本课件共有182页HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit是用于从TotalRNA或mRNA高保真合成cDNA的2StepRT-PCR试剂盒。反转录反应使用了TaKaRa独自开发的反转录酶PrimeScriptRTase，该酶是一种新型的RNaseH-型反转录酶，无RNaseH活性，不会分解模板RNA，能够有效合成长链的1st-strandcDNA。本反转录酶具有极强的延伸能力，即使对有复杂二级结构的RNA，在42条件下也能得到良好的反应效果，无需进行高温反转录反应，因为高温
46、的反转录反应会导致RNA的降解。PCR反应选用兼具高保真和高效扩增性能的PrimeSTARHSDNAPolymerase，可以很好地应用于cDNA克隆等对保真性要求高的实验。使用本试剂盒扩增得到的PCR产物几乎都为平滑末端，可克隆于平滑末端的载体中。第一百三十七页，本课件共有182页 M-MuLVM-MLV逆转录酶是一种依赖于RNA和DNA的DNA聚合酶。它可以单链RNA、DNA或RNA-DNA杂合链为模板，以RNA或DNA为引物启动DNA合成。该酶带有针对RNA-DNA杂合链中RNA的RNaseH活性。本产品来源于带有编码莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶的pol基因片段的E.col
47、i菌株。单肽84kDaRNaseH活性弱利于合成较长cDNA第一百三十八页，本课件共有182页2用途 cDNA克隆测转录起始点（引物延伸法）5突出DNA的补平测序反应(当用DNApolyI,Klenow或测序酶不理想时)其它RT-PCRRNA二级结构第一百三十九页，本课件共有182页3.活性 53DNA聚合活性（Mg+）RNAorDNA模板及带3OH的RNA或DNA引物RNaseH活性RNaseH-突变第一百四十页，本课件共有182页4.注意事项 无35外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500个bases会有一个误掺入。为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP。单链拷贝，也可双链
48、合成（自身序列为引物，但效率低）,50g/ml放线菌毒D，抑制第二链合成。第一百四十一页，本课件共有182页七、末端转移酶来源于小牛胸腺,存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNApoly在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端T,C首选Co2+A,G首选Mg2+Terminaltransferase第一百四十二页，本课件共有182页1.底物DNA,可短至3个核苷酸,3突出低离子强度时,平端或3凹出端DNA亦可但效率低2.用途在3端加同聚尾，cDNA或载体，用于克隆，或标记末端标记ddNTP(标记的)第一百四十三页，本课件共有182页 37 15m
49、in 随时间的延长尾亦长。3.同尾的长度第一百四十四页，本课件共有182页第四节第四节RNA聚合酶RNApolymerase来源于噬菌体感染宿主后所产生第一百四十五页，本课件共有182页SP6噬菌体聚合酶 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株T3或T7噬菌体聚合酶 来源于感染的大肠杆菌第一百四十六页，本课件共有182页1.活性这些RNA聚合酶实际上为转录过程中RNA合成的酶，识别DNA中特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。与DNA聚合酶不同，无需引物，但识别特异性位点第一百四十七页，本课件共有182页2.用途 体外：将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体,如pGEM-3Z
50、载体(2.74kb,p13)中，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA，从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA，体外剪接反应的底物第一百四十八页，本课件共有182页第一百四十九页，本课件共有182页 体内：用于表达外源基因A.Ecoli先构建宿主菌，将T7 poly RNA基因置于 lacUV5 启动子之下，插入到噬菌体中，感染E.coli建立稳定的溶原菌Ecoli BL21(DE3)：lacUV5启动子+T7RNA聚合酶基因，置于噬菌体DE3区，该区整合于染色体的BL21处。第一百五十页，本课件共有182页若将T7噬菌体启动子控制的目的基因经质粒载体导入该宿主菌中在IPTG(异丙基