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1、关于有机物定量分析2023/3/1有机定量分析1第一页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析2pro是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是要含的元素是C、H、O、N、S、P另外还有一些微量元素另外还有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的。对于不同的pro，它的组成和结构不同，但从分析数，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的据可以得到近似的pro的元素组成百分比。的元素组成百分比。元素
2、组成百分比：元素组成百分比：元素元素CHONSP百分比百分比50723160-30-3一般来说，一般来说，pro的平均含氮量为的平均含氮量为100/16，所以在用凯氏定氮法定，所以在用凯氏定氮法定量量pro时，将测得的总氮时，将测得的总氮%乘上乘上pro的换称参数的换称参数K=6.25即为该物质的即为该物质的pro含量。但当测定的样品其含氮的系数与上面含量。但当测定的样品其含氮的系数与上面100/16相差较大时，采相差较大时，采用用6.25将会引起显著的偏差。将会引起显著的偏差。一一蛋白质的定量分析方法蛋白质的定量分析方法 第二页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析3对于氮含量换算成
3、对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用含量的等数，历来采用6.25，这个，这个数值是以数值是以pro平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定食品种类不同，差别是很大的，我们在测定pro时，应该是不同的时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换称等数：食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换称等数：蛋蛋=6.25，肉，肉=6.25，牛乳，牛乳=6.38，稻米，稻米=5.95，大麦，大麦=5.83，玉米，玉米=6.25，小麦，小麦=5.83，麸皮，麸皮=6.31，面粉，面粉=
4、5.70。如果手册上查不到的样品则可用如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。采用的换算等数以何物代替。近几年，国际组织认为近几年，国际组织认为6.25的换算等数太高，特别是对蛋品、肉的换算等数太高，特别是对蛋品、肉品及鱼类，贝类等动物性食品，根据以氨基酸组成总量计算的比品及鱼类，贝类等动物性食品，根据以氨基酸组成总量计算的比6.25要低的多。要低的多。关于氮关于氮-pro换算等数换算等数第三页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析4pro的测定方法分为两大类：的测定方法分为两大类：一类一类是利用是利用pro的共性，即含
5、氮量，肽链和折射率测定的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量含量.另一类另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定定pro含量。含量。但是食品种类很多，食品中但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出准酸液吸收
6、，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pro的含量。的含量。根据食品中根据食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。微量法，但它们的基本原理都是一样的。第四页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析5这种方法是这种方法是1883年年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用发明，当时凯氏只使用H2SO4来分来分解试样，来定量谷物中的解试样，来定量谷物中的pro，他只知用，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用分解有机氮化合物生成氨的
7、反应历程，所以只使用H2SO4分解分解试样，需要较长时间，后来由试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是加入改进，他改进的办法是在消化时加入在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的来硫酸沸点的330上升到上升到400，所以速度也就加快了，凯氏定氮法，所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。至今仍在使用。我们在检验食品中我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含等数，
8、得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。(一一)凯氏定氮法凯氏定氮法第五页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析6首先第一个步骤是消化：首先第一个步骤是消化：（1）消化：）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的机物，使有机物中的C、H氧化为氧化为CO2和和H2O蒸汽逸出，而蒸汽逸出，而pro则分解氮，则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。在消化过程中添加硫酸钾在
9、消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330，而添加，而添加硫酸钾后，温度可达硫酸钾后，温度可达400，加速了整个反应过程。，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否
10、则温度太高，生成的硫加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。第六页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析7（2）蒸馏：）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过
11、量，二是要防止样液中氨气逸出。是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。(3)吸收与滴定：吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色
12、反应，它有吸收氨的作用。的作用。第七页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析8MRMOMR(凯氏定氮法)NaOHHCl第八页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析9凯氏定氮装置凯氏定氮装置1.安全管安全管2.导管导管3.汽水分离器汽水分离器4.塞子塞子5.进样口进样口6.冷凝管冷凝管7.吸收吸收瓶瓶8.隔热液套隔热液套9.反应管反应管10.蒸汽发生器蒸汽发生器1.消化样品消化样品2.浓浓H2SO43.CuSO45H2O4.K2SO4样样品品空空白白2.蒸蒸NH3第九页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析10计算：计算：N（V2-V1）14.01总氮量总氮量%=-100
13、Wpro%=总氮总氮%K乳制品乳制品K=6.38（N=15.7%）小麦粉小麦粉K=5.79（N=17.6%）动物胶动物胶K=5.6（N=18.0%）冰蛋冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品大豆制品K=6.0（16.7%）K=6.25则（则（N=16%）K-换称等数换称等数第十页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析11(1)消化时间一般约消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起小时左右即可，消化时间过长会引起氨的氨的损失损失。如样品中含赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需延。如样品中含赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需延长长12倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完倍。因
14、为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。全，往往导致总氮量偏低。注意事项注意事项(2)若样品中脂肪或糖较多时，消化时间要长些。还应注意若样品中脂肪或糖较多时，消化时间要长些。还应注意发生的大量泡沫，防止它溢出瓶外。须时时摇动，并减小火发生的大量泡沫，防止它溢出瓶外。须时时摇动，并减小火焰，甚至停止加热半小时底再用小火消化。焰，甚至停止加热半小时底再用小火消化。第十一页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析12在消化过程中为了加速分解过程，缩短消化时间，常在消化过程中为了加速分解过程，缩短消化时间，常加入下列物质：加入下列物质：样品的分解条件样品的分解条件功用是提
15、高溶液的沸点功用是提高溶液的沸点。K2SO4在消化过程中，随着硫酸的不断分解，水分的不断蒸发，在消化过程中，随着硫酸的不断分解，水分的不断蒸发，K2SO4的浓的浓度逐渐增大，则沸点升高，加速了对有机物的分解作用。度逐渐增大，则沸点升高，加速了对有机物的分解作用。K2SO4与硫酸的用量比值不宜过大，因温度过高，生成的硫与硫酸的用量比值不宜过大，因温度过高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨，使氮损失。酸氢铵也会分解，放出氨，使氮损失。第十二页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析13Cu2SO4为红色沉淀，当为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，完全消化后，反应停止，红色消失，变为
16、兰色，即为消化达到完全，兰色为变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色的颜色催化剂催化剂CuSO4:氧化汞和汞氧化汞和汞:氧化汞和汞是良好的催化剂氧化汞和汞是良好的催化剂氧化汞和汞都是剧毒物质，使用时必须有安全可靠的通氧化汞和汞都是剧毒物质，使用时必须有安全可靠的通风设备，还会污染环境，而且价格昂贵。风设备，还会污染环境，而且价格昂贵。第十三页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析14硒粉硒粉催化效能催化效能可大大缩短消化时问。可大大缩短消化时问。第十四页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析15(1)次氯酸钾和高锰酸钾次氯酸钾和高锰酸钾一般不宜使用这类强氧化剂。一般
17、不宜使用这类强氧化剂。次氯酸钾的催化作用强，由于其氧化性强，可将一部分氨进一步氧化成次氯酸钾的催化作用强，由于其氧化性强，可将一部分氨进一步氧化成氮而损失。若试样富含碳时，可使用高锰酸钾。氮而损失。若试样富含碳时，可使用高锰酸钾。(2)过氧化氢过氧化氢具有消化速度高，操作简便的优点，近常推荐采用具有消化速度高，操作简便的优点，近常推荐采用这种氧化剂。但在使用时要特别注意，须待消化液完全冷却后再加入数这种氧化剂。但在使用时要特别注意，须待消化液完全冷却后再加入数滴过氧化氢。滴过氧化氢。氧化剂氧化剂添加氧化剂可帮助有机物消化，但要防止氨进一少添加氧化剂可帮助有机物消化，但要防止氨进一少氧化为氮。一
18、般说来，若有足够量的其他还原剂，如碳，氧化为氮。一般说来，若有足够量的其他还原剂，如碳，则添加氧化则不致使测定结果偏低。则添加氧化则不致使测定结果偏低。第十五页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析16一、原理一、原理考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250以两种不同颜色存在即红色与蓝色，以两种不同颜色存在即红色与蓝色，当染色剂与蛋白质结当染色剂与蛋白质结合时，红色就转变为蓝色合时，红色就转变为蓝色。这种蛋白。这种蛋白质染色剂复合物有较高的消光系数。因此，质染色剂复合物有较高的消光系数。因此，用这种方法测定用这种方法测定蛋白质含量灵敏度比较高，染色剂和蛋白质的结合过程迅速，蛋白质含量灵敏度比较高
19、，染色剂和蛋白质的结合过程迅速，大大约约2分钟，而且蛋白质分钟，而且蛋白质染色剂复合物能在溶液中保持稳染色剂复合物能在溶液中保持稳定定1小时之久。小时之久。(二二)可溶性蛋白质的测定（考马斯亮蓝可溶性蛋白质的测定（考马斯亮蓝G-250法）法）第十六页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析17CoomassieDye-Based蛋白质定量蛋白质定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein-DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第十七页，本课件共有78页202
20、3/3/1有机定量分析18二、材料、仪器与试剂二、材料、仪器与试剂（一）材料：绿豆芽、马铃薯。（一）材料：绿豆芽、马铃薯。（二）仪器：分光光度计，分析天平，容量瓶、移液管、具塞（二）仪器：分光光度计，分析天平，容量瓶、移液管、具塞刻度试管。刻度试管。（三）（三）试剂试剂1考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250，溶于，溶于50ml90%乙醇乙醇中，加入中，加入85%正磷酸正磷酸100ml，最后加蒸馏水至，最后加蒸馏水至1000ml，此溶液可在常，此溶液可在常温下放置一温下放置一个月。个月。试剂试剂2蛋白质标准液：称取蛋白质标准液：称取1
21、00mg牛血清蛋白，溶于牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，制蒸馏水中，制成成100gml-1贮备液。贮备液。再按下表比例配制成每毫升分别含再按下表比例配制成每毫升分别含200g，400g，600g，800g，1000g蛋白标准液及每毫升分别含蛋白标准液及每毫升分别含20g，40g，60g，80g，100g蛋白的标准液。蛋白的标准液。表表1高浓度蛋白质标准液的配制高浓度蛋白质标准液的配制蛋白浓度蛋白浓度(gml-1)2004006008001000加贮备液加贮备液(ml)0.40.81.21.62.0加蒸馏水加蒸馏水(ml)1.61.20.80.40第十八页，本课件共有78页2023/3/1有
22、机定量分析19表表2低浓度蛋白质标准液的配制低浓度蛋白质标准液的配制蛋白浓度蛋白浓度(gmL-1)20406080100加贮备液加贮备液(mL)0.20.40.60.81.0加蒸馏水加蒸馏水(mL)9.89.69.49.29.0三、操作步骤三、操作步骤（一）标准曲线的制作（一）标准曲线的制作11001000gml-1蛋白标准曲线：准确吸取含有蛋白标准曲线：准确吸取含有200g，400g，600g，800g，1000g的牛血清蛋白标准液的牛血清蛋白标准液0.1ml,分别放入分别放入10ml刻度试管中，加入刻度试管中，加入5.0ml考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，将溶液混蛋白试剂，将溶液混
23、匀，匀，2分钟后在分钟后在595nm处测其消光处测其消光值，空白以蒸馏水代替标准液，值，空白以蒸馏水代替标准液，其它操作同上。其它操作同上。第十九页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析2020100gml-1蛋白标准曲线：蛋白标准曲线：准确吸取准确吸取0.5ml含含20g，40g，60g，80g，100g牛血清蛋白标牛血清蛋白标准液，分别放入准液，分别放入10ml具塞刻度具塞刻度试管中，加入试管中，加入5.0ml考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，其它操作同上。蛋白试剂，其它操作同上。以消以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，作标准曲线。光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，作标准曲线。
24、（二）样品中蛋白质浓度的测定：（二）样品中蛋白质浓度的测定：样品中蛋白质浓样品中蛋白质浓度的测定除加入标准溶液作为样品液外，度的测定除加入标准溶液作为样品液外，其余操作其余操作完完全相同，全相同，通过标准曲线即可查得每毫升溶液中蛋白质通过标准曲线即可查得每毫升溶液中蛋白质的含量。的含量。四、注意事项四、注意事项1在配制不同浓度蛋白质溶液时，比色管一要在配制不同浓度蛋白质溶液时，比色管一要事先干燥。事先干燥。2在分别吸取蛋白质溶液后应立即盖上塞子，避免水分蒸发影响在分别吸取蛋白质溶液后应立即盖上塞子，避免水分蒸发影响测定的结测定的结果。果。第二十页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析2
25、11原理：原理：pro及其降解产物的芳香环基及其降解产物的芳香环基，在紫外区在紫外区内对某一波长具内对某一波长具有一定的光有一定的光选择吸收选择吸收，在，在280nm下，光吸收与下，光吸收与pro浓度浓度（38mg/ml）成）成直线关系直线关系，因此，通过测定，因此，通过测定pro溶液的吸光溶液的吸光度，并参照事先用度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。蛋白质的含量。(三三)紫外分光光度法紫外分光光度法第二十一页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析222试剂：试剂：（1）0.1mol/l柠檬酸水溶液。柠檬酸水溶液。
26、（2）8mol/l脲脲（NH2）2CO的的2NNaOH溶液。脲的溶液。脲的2N氢氧化物氢氧化物（3）95%乙醇乙醇（4）无水乙醚无水乙醚3仪器仪器（1）紫外分光光度计（紫外分光光度计（2）离心机离心机4操作方法操作方法（1）标准曲线的绘制：）标准曲线的绘制：准确称取样品准确称取样品.2.00g，置于，置于50ml烧瓶中，加入烧瓶中，加入0.1mol/l柠柠檬酸水溶液檬酸水溶液30ml，搅拌，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中。玻璃离心管中。第二十二页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析23以每秒钟以每秒钟30005000转的速度离
27、心转的速度离心10分钟，分别吸出上清液分钟，分别吸出上清液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于于6个个10ml容量瓶中，每个容量瓶，容量瓶中，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果浑浊再次离心），取透分钟（如果浑浊再次离心），取透明液于比色皿中，在明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）下测定其吸光度。（做参比值）以事先用以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横坐标上氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量为横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定）样品测定准确称取试样准确
28、称取试样1.00g于于50ml烧杯中烧杯中加加0.1mol/l柠檬酸溶液柠檬酸溶液30ml搅拌搅拌10分钟分钟四层纱布过滤到离心管中四层纱布过滤到离心管中用用8mol/L脲的脲的NaOH溶液定容，摇匀后于溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。的含量。说明：说明：a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.温度对温度对pro水解有影响，操作温度应控制在水解有影响，操作温度应控制在2030。第二十三页，本课件共有78页2023/3/1有机定量
29、分析24原理：原理：双缩脲在碱性条件中，能与双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。结合成红紫色的络合物。pro分子中分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。(四四)双缩脲法双缩脲法-皮尼克法皮尼克法准确称样准确称样0.5g于于80ml离心管离心管加加1mlCCl4混合混合加加50ml酒石酸钾钠稳定酒石酸钾钠稳定剂剂盖上盖子离心盖上盖子离心10min（4000转转/分）
30、分）放置放置1小时小时吸混合液吸混合液15ml于于20ml离离心管中心管中离心到完全透明离心到完全透明取上清夜取上清夜5ml于于10ml容量瓶容量瓶加水定容加水定容于于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。含量。计算：计算：蛋白质蛋白质%=C/W100C-从标准曲线上查得得从标准曲线上查得得pro含量（含量（mg）W-测定样液时相当于样品重量（测定样液时相当于样品重量（mg）第二十四页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析25pro经水解或酶解可由大分子变成小的经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，成分，如水解后的产物
31、经胨，肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。最基本的物质。水解后的水解后的pro和水解前的和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。二二氨基酸总量测定氨基酸总量测定氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨
32、基种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。第二十五页，本课件共有78页
33、2023/3/1有机定量分析26一、原理一、原理氨基酸在氨基酸在碱性溶液碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝色化合物（除脯氨酸外均有此中能与茚三酮作用，生成蓝色化合物（除脯氨酸外均有此反反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最其最大吸收波长为大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。，故据此可以测定样品中氨基酸含量。茚三酮法测定氨基酸总量茚三酮法测定氨基酸总量二、主要仪器二、主要仪器分光光度计分光光度计三、试剂三、试剂1.2%茚三酮溶液茚三酮溶液：称取茚三酮：称取茚三酮1g于盛有
34、于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加热水的烧杯中使其溶解，加入入40mg氯化亚锡（氯化亚锡（SnCl2H2O）,搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，搅拌过滤（作防腐剂）。滤液置冷暗处过夜，加水至加水至50mL，摇匀备用。，摇匀备用。2.pH8.04磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾（：准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯于烧杯中，用中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。备用。准确称取磷酸氢二钠（准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏
35、水溶解后，于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定定量转入量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。取上述配好的磷酸二氢取上述配好的磷酸二氢钾溶液钾溶液10.0mL与与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即磷酸氢二钠溶液混合均匀即为为pH8.04的磷酸缓冲溶液。的磷酸缓冲溶液。第二十六页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析273.氨基酸标准溶液：氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯于烧杯中，先用少量水溶解后，中，先用少量水溶解后，定量转入定量转入100mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇
36、匀。容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。准确吸取此液准确吸取此液10.0mL于于100mL容量瓶中，容量瓶中，加水至标线，加水至标线，摇匀。摇匀。此为此为200gmL-1氨基酸标准溶液。氨基酸标准溶液。四、操作方法四、操作方法1.标准曲线绘制标准曲线绘制准确吸取准确吸取200gmL-1的氨基酸标的氨基酸标准溶液准溶液0.0mL，0.5mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL（相当于（相当于0g，100g，200g，300g，400g，500g，600g氨基酸），分别置于氨基酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为积为4.0m
37、L，然后加入茚三酮和磷酸，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各缓冲溶液各1mL，混合均匀，于水浴，混合均匀，于水浴上加热上加热15分钟，取出迅速冷至室温，加水分钟，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置至标线，摇匀。静置15分钟后，在分钟后，在5570nm波长下，以试剂空白为参比液测定波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘为纵坐标，绘制标准曲线。制标准曲线。第二十七页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析282.样品的测定样品的测定吸取澄清的样品溶液吸取澄清的样品溶液14mL，按
38、标准曲线制作步骤，在相同条件下测，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸定吸光度光度A值，用测得的值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸微克数。值在标准曲线上即可查得对应的氨基酸微克数。说明及注意事项说明及注意事项1.通常采用通常采用样品处理方法样品处理方法为：为：准确称取准确称取粉碎样品粉碎样品510g或吸取或吸取液体样品液体样品510mL，置于烧杯中，加入，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，左右活性炭，加热煮沸，过滤，用用3040mL热水洗涤活性热水洗涤活性炭，收集滤液于炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀容量瓶中，加水至标线，
39、摇匀备测。备测。2.茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使色，使用用前须进行纯化，方法如下：前须进行纯化，方法如下：取取10g茚三酮溶于茚三酮溶于40mL热水中，加入热水中，加入1g活性炭，摇动活性炭，摇动1分钟，静置分钟，静置30分分钟，钟，过滤。将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用过滤。将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤冷水洗涤结晶，置结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。干燥器中干燥，装瓶备用。3.空气中氧气干扰显色一步，抗坏血酸保护可以提高灵敏度。空气中氧气干扰显色一步，抗
40、坏血酸保护可以提高灵敏度。4.温度超过温度超过80容易褪色；适当延长温热时间效果较好。容易褪色；适当延长温热时间效果较好。第二十八页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析29三三碳水化合物的测定碳水化合物的测定碳水化合物是生物界三大物质之一（碳水化合物是生物界三大物质之一（Pro,Fat）,是自然界最是自然界最丰富的有机物质。碳水化合物主要存在于植物界，如谷类食物和水果丰富的有机物质。碳水化合物主要存在于植物界，如谷类食物和水果蔬菜的主要成分是蔬菜的主要成分是(CH2O)n。碳水化合物统称为糖类，它包含了。碳水化合物统称为糖类，它包含了单糖、低聚糖及多糖，是大多数食品中重要组成成分，也
41、是人单糖、低聚糖及多糖，是大多数食品中重要组成成分，也是人和动物体的重要能源。单糖、双糖、淀粉能为人体所消化吸收，和动物体的重要能源。单糖、双糖、淀粉能为人体所消化吸收，提供热能，果胶、纤维素维持人体健康具有重要作用。提供热能，果胶、纤维素维持人体健康具有重要作用。第二十九页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析30常用的混合糖的分离纯化方法常用的混合糖的分离纯化方法一一.提取提取常用溶剂有：常用溶剂有：水和乙醇水和乙醇，在提取糖类时，先将样品磨碎浸泡成溶液，若有脂，在提取糖类时，先将样品磨碎浸泡成溶液，若有脂肪的样品用肪的样品用石油醚石油醚提取，撤去其中的脂肪和叶绿素。提取，撤去其中
42、的脂肪和叶绿素。1.水作提取剂水作提取剂用水作提取剂，温度控制在用水作提取剂，温度控制在45-50，利用水作提取剂时，还有，利用水作提取剂时，还有pro、氨基酸、多、氨基酸、多糖、色素干扰，影响过滤时间，所以用水作提取剂应注意：糖、色素干扰，影响过滤时间，所以用水作提取剂应注意：1）温度过高：是可溶性淀粉及糊精提取出来）温度过高：是可溶性淀粉及糊精提取出来。2）酸性样品：酸性使糖水解（转化），所以酸性样品用碳酸钙中和，提取但应）酸性样品：酸性使糖水解（转化），所以酸性样品用碳酸钙中和，提取但应控制在中性。控制在中性。3）萃取的液体：有酶活性时，同样是使糖水解，加二氯化汞可防）萃取的液体：有酶活
43、性时，同样是使糖水解，加二氯化汞可防止（二氯化汞可抑制酶活性）止（二氯化汞可抑制酶活性）2.乙醇（水溶液）作提取液乙醇（水溶液）作提取液乙醇作提取液适用于含酶多的样品乙醇作提取液适用于含酶多的样品，这样避免，这样避免糖糖被水解。乙醇的浓度被水解。乙醇的浓度70-80。浓度。浓度过高，糖溶在乙醇中，用乙醇的目的，降低酶的作用，避免糖被酶水解。过高，糖溶在乙醇中，用乙醇的目的，降低酶的作用，避免糖被酶水解。第三十页，本课件共有78页31二二.澄清剂澄清剂1.作用：作用：沉淀一些干扰物质，沉淀一些干扰物质，使使提取液清亮透明，达到准确的测量提取液清亮透明，达到准确的测量糖类。（常用澄清剂来澄清）糖类
44、。（常用澄清剂来澄清）2.对澄清剂的要求：对澄清剂的要求：1）除干扰物质完全，不吸附被测物质糖）除干扰物质完全，不吸附被测物质糖2）过量澄清剂不影响糖的测量）过量澄清剂不影响糖的测量3）沉淀颗粒要小，操作简便）沉淀颗粒要小，操作简便4）不改变糖类的比旋光度及理化性质）不改变糖类的比旋光度及理化性质3.实验室常用的澄清剂实验室常用的澄清剂1）中性醋酸铅中性醋酸铅：适用于植物性的萃取液，它可除去蛋白质、丹宁、有机酸、果胶。：适用于植物性的萃取液，它可除去蛋白质、丹宁、有机酸、果胶。缺点：脱色力差，不能用于深色糖液的澄清，否则加活性炭处理。缺点：脱色力差，不能用于深色糖液的澄清，否则加活性炭处理。2
45、）碱性醋酸铅碱性醋酸铅适用深色的蔗糖溶液，可除色素，有机酸，蛋白质适用深色的蔗糖溶液，可除色素，有机酸，蛋白质缺点：沉淀颗粒大，可带走果糖。缺点：沉淀颗粒大，可带走果糖。（3）醋酸锌和亚铁氰化钾醋酸锌和亚铁氰化钾用于富含蛋白质的提取液用于富含蛋白质的提取液，常用于沉淀蛋白质，对乳制品最理想。主要是，常用于沉淀蛋白质，对乳制品最理想。主要是生成的亚铁氰酸锌（白色沉淀）与蛋白质共同沉淀。所以使动物性样品的沉生成的亚铁氰酸锌（白色沉淀）与蛋白质共同沉淀。所以使动物性样品的沉淀剂。淀剂。（4）Al(OH)3乳剂是辅助澄清剂。乳剂是辅助澄清剂。（5）CuSO4-NaOH这种澄清剂用于牛乳等样品这种澄清剂
46、用于牛乳等样品。第三十一页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析324澄清剂的用量澄清剂的用量在一般操作时，加澄清剂量多少一定要恰当，用量太少，达不到在一般操作时，加澄清剂量多少一定要恰当，用量太少，达不到澄清的目的，用量太多使分析结果产生误差，不同的物质，因干扰物质澄清的目的，用量太多使分析结果产生误差，不同的物质，因干扰物质种类和含量的不同，所以添加量也不同。过量以后，糖液中有种类和含量的不同，所以添加量也不同。过量以后，糖液中有Zn2+,Pb2+,等。等。过量的过量的Pb2+还原糖生成铅糖。这样使测得糖量降低。所以要加除铅还原糖生成铅糖。这样使测得糖量降低。所以要加除铅剂，防止生
47、成铅糖，降低糖的浓度。剂，防止生成铅糖，降低糖的浓度。三三常用的除铅剂常用的除铅剂K2CrO4(苯酸钾苯酸钾)；Na2CrO4(苯酸钠苯酸钠)；Na2HPO4(磷酸氢二钠磷酸氢二钠)；Na2SO4(硫酸钠硫酸钠)；使用时可加少量固体即可使用时可加少量固体即可第三十二页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析33糖的测定方法糖的测定方法对于糖的测定方法有很多，大致可分为三类对于糖的测定方法有很多，大致可分为三类1.物理法物理法，（1.旋光法旋光法,2.折光法折光法,3.比重法比重法,）2.物理化学法物理化学法,(1.点位法点位法,2极普法极普法,3.光度法光度法,4.色谱法色谱法)3.化学
48、方法化学方法,(1.斐林氏法斐林氏法.2.高锰酸钾法高锰酸钾法.3.碘量法碘量法.4.铁氰化钾铁氰化钾法法.5.蒽铜比色法蒽铜比色法.6.咔唑比色法咔唑比色法)共计三大种，在测定其他碳水化合物时，往往是使其水解为糖再进行测共计三大种，在测定其他碳水化合物时，往往是使其水解为糖再进行测定。定。第三十三页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析34还原糖是指具有还原性的糖类。葡萄糖分子中含有游离醛还原糖是指具有还原性的糖类。葡萄糖分子中含有游离醛基、果糖分基、果糖分子中含有游离酮基，子中含有游离酮基，乳糖和麦芽糖分子中含有游离乳糖和麦芽糖分子中含有游离的潜醛基，的潜醛基，它们都是还原糖。它们
49、都是还原糖。其他双糖（如蔗糖）、三糖乃至其他双糖（如蔗糖）、三糖乃至多糖（如糊精、淀粉等），其本身不具还原性，多糖（如糊精、淀粉等），其本身不具还原性，属于非还原性属于非还原性糖，但都可以通过水解而生成相应的还原性单糖，测定水解液糖，但都可以通过水解而生成相应的还原性单糖，测定水解液的还的还原糖含量就可以求得样品中相应糖类的含量。因此，原糖含量就可以求得样品中相应糖类的含量。因此，还原还原糖的测定是一般糖类定量的基础糖的测定是一般糖类定量的基础。还原糖的测定方法很多，其中最常用的有直接滴定法、高锰还原糖的测定方法很多，其中最常用的有直接滴定法、高锰酸钾滴定法、萨氏法、碘量法等。酸钾滴定法、萨氏
50、法、碘量法等。(一一)还原糖的测定还原糖的测定第三十四页，本课件共有78页2023/3/1有机定量分析35一原理一原理将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。酒石酸钾钠铜络合物。在加热条件下，以在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，待二价铜全的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色