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1、关于植物离体培养育种第一页，本课件共有86页组织培养的概念组织培养的概念组组织织培培养养（Tissue culture）是是指指用用无无菌菌方方法法使使植植物物体体的的离离体体器器官官、组组织织和和细细胞胞在在人人为为提提供供的的条条件件下下生生长长和和发发育育的的所所有有培培养养技技术术的的总总称称，也也称称之之为为离离体体培培养养（In vitro culture）。）。第二页，本课件共有86页利利用用植植物物体体的的器器官官、组组织织或或细细胞胞，通通过过无无菌菌操操作作接接种种于于人人工工配配制制的的培培养养基基上上，在在一一定定的的光光照照和和温温度度条条件件下下进进行行培培养养，使
2、使之之生生长长发发育育的的技技术术称为组织培养称为组织培养第三页，本课件共有86页按培养材料分为（按培养材料分为（Gamborg等等)：组织培养的类型组织培养的类型愈伤组织培养愈伤组织培养细细胞胞培培养养器器官官培培养养原生质体培养原生质体培养最为常见的组织培养最为常见的组织培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养单细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养花和幼果的部分组织的培养第四页，本课件共有86页类别 依外植体的不同划分 胚胎培养（embryo culture）未成熟或成熟了的胚器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子
3、叶、叶片、叶原基、花原基、或花果的未熟部分组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等细胞培养 单个游离细胞 （分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞）原生质体培养 除去细胞壁的原生质体第五页，本课件共有86页 植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。第六页，本课件共有86页发展简史发展简史1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。1902年，德国植物
4、学家Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论。1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。1934年，White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。第七页，本课件共有86页1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍
5、被广泛使用的MS培养基。1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。发展简史发展简史第八页，本课件共有86页植物组织培养在技术上的发展植物组织培养在技术上的发展q研究材料范围逐步扩大q培养方法逐步完善q培养基不断改进q实验手段逐步完备胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等；动物细胞+植物细胞/微生物原生质体固体培养发展到液体振荡或旋转培养悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养White培养基、培养基、MS培养基、培养基、MT培养基等
6、培养基等第九页，本课件共有86页植物组织培养在农业上的应用植物组织培养在农业上的应用q倍性育种：花药培养、胚乳培养倍性育种：花药培养、胚乳培养q突变体筛选：愈伤组织培养突变体筛选：愈伤组织培养q创造新种质：细胞融合创造新种质：细胞融合克服胚败育：胚培养克服胚败育：胚培养q植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产第十页，本课件共有86页组织培养的意义组织培养的意义 胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发育而早期败育的问题。胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，以克服不育性和不亲和性等障碍。细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲和系、雄性不育系的无性繁殖
7、，突变体的诱导与分离及种质的保存和运输等方面。花药及花粉培养 单倍体育种，加速获得纯二倍体。原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工作。第十一页，本课件共有86页愈伤组织愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？培养是最为常见的组织培养方式？愈伤组织（愈伤组织（Callus）：）：原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。团无序生长的薄壁细胞。原因：原因：1.大部分组织培养经历大部分组织培养经历callus再生途径长出植
8、株；再生途径长出植株；2.callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。可以用于悬浮培养和原生质体培养。第十二页，本课件共有86页第十三页，本课件共有86页第十四页，本课件共有86页按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培养、包按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培养、包埋培养等埋培养等按培养过程：初代培养、继代培养按培养过程：初代培养、继代培养组织培养的类型组织培养的类型第十五页，本课件共有86页q外植体外植体（Explants）由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官q初代培养（初代培养（Primarycultur
9、e）q继代培养（继代培养（Subculture）指外植体的最初培养指外植体的最初培养将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反复多次移植的培养，称为继代培养植的培养，称为继代培养第十六页，本课件共有86页生物学原理生物学原理 植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基础，它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基成分，可使其发育成完整的植株。细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。第十七页，本课
10、件共有86页植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都 具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。原理原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因潜在全能性的原因：基因表达的选择性 科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。生物学原理
11、生物学原理 第十八页，本课件共有86页植物细胞全能性的表达 脱分化脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。第十九页，本课件共有86页离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体植物植物组织组织培养培养过程过程第二十页，本课件共有86页植物组织培养特点植物组织培养特点培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制 组织
12、培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。生产。生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。总体来说成本的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
13、或脱病毒种苗。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。第二十一页，本课件共有86页技术用途技术用途q快繁：人工种子、茎尖培养快繁：人工种子、茎尖培养q脱毒：微芽嫁接、茎尖培养脱毒：微芽嫁接、茎尖培养q克服杂交不亲和：花药培养、细胞克服杂交不亲和：花药培养、细胞融合融合q种质资源
14、保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养第二十二页，本课件共有86页MSMS培培养养基基 它它是是19621962年年由由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为为培培养养烟烟草草细细胞胞而而设设计计的的。特特点点是是无无机机盐盐和和离离子子浓浓度度较较高高，为为较较稳稳定定的的平平衡衡溶溶液液。其其养养分分的的数数量量和和比比例例较较合合适适，可可满满足足植植物物的的营营养养和和生生理理需需要要。它它的的硝硝酸酸盐盐含含量量较较其其他他培培养养基基为为高高，广广泛泛地地用用于于植植物物的的器器官官、花花药药、细细胞胞和和原原生生质质体
15、体培培养养，效效果果良良好好。有有些些培培养养基基是是由由它它演演变变而来的。而来的。B B5 5培培养养基基 是是19681968年年由由GalmborgGalmborg等等为为培培养养大大豆豆根根细细胞胞而而设设计计的的。其其主主要要特特点点是是含含有有较较低低的的铵铵，这这可可能能对对不不少少培培养养物物的的生生长长有有抑抑制制作作用用。从从实实践践得得知知有有些些植植物物在在B B5 5培培养养基基上上生生长长更更适适宜宜，如如双双子子叶叶植植物物特特别是木本植物。别是木本植物。一、目前国际上流行的培养基及特点一、目前国际上流行的培养基及特点2 2 植物离体培养需要的基本条件植物离体培
16、养需要的基本条件第二十三页，本课件共有86页White培养基培养基 是是1943年由年由White为培养番茄根尖而设计的。为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作年又作了改良，称作White改良培养基，提高了改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。培养。N6培养基培养基 是是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，计的。其特点是成分较简单，KNO3和（和（NH4）2SO4含量高。在含量高。在国内已广泛应用于小麦
17、、水稻及其他植物的花药培养和其他国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。组织培养。KM8P培养基培养基 它是它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。融合的培养。第二十四页，本课件共有86页 包包括括无无机机成成分分和和有有机机成成分分。无无机机成成分分包包括括大大量量元元素素和和微微量量元元素素。有有机机成成分分主主要要包包括括糖糖类类、维维生生素素、氨氨基基酸酸和和酰酰胺胺类类、含含氮氮碱碱基基、生生长长
18、调调节节剂剂、自自然然复复合合物物（如如水水解解蛋蛋白白、酵酵母母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。培养基的基本成分培养基的基本成分第二十五页，本课件共有86页 植植物物对对无无机机盐盐类类的的需需求求具具有有广广泛泛的的一一致致性性，偶偶然然加加以以变变动动。一一般般多多采采用用蔗蔗糖糖。维维生生素素中中最最关关键键的的是是B1，一一般般用用量量为为0.1-0.4毫毫克克/升升。氨氨基基酸酸和和酰酰胺胺只只用用于于某某些些组组织织培培养养，而而在在器器官官增增殖殖阶阶段段加加入入腺腺嘌嘌呤呤也也可可能能是是需需要要的的。关键的有机成分主要
19、是激素和细胞分裂素。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。培养基成分的性质培养基成分的性质第二十六页，本课件共有86页 可可以以采采用用固固体体或或者者液液体体培培养养基基，根根据据不不同同植植物物和和不不同同培培养养阶阶段段而而定定。固固体体培培养养基基中中以以琼琼脂脂质质量量好好，配配制制时时可可以以通通过过调调节节pH值值来来达达到到适适合合的的凝凝胶胶状状态态即即可可。液液体体培培养养基基养养时时也有固定和搅动两种也有固定和搅动两种。培养基的物理性质培养基的物理性质第二十七页，本课件共有86页大量元素大量元素N、P、S、K、Ca、MgN：各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分各种氨
20、基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要成分Ca：细胞壁稳定细胞壁稳定Mg：酶及辅酶的成分酶及辅酶的成分微量元素微量元素Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo用量少，过多容易导致中毒用量少，过多容易导致中毒第二十八页，本课件共有86页激素激素v细胞分裂素细胞分裂素v赤霉素赤霉素v生长素生长素促进促进细胞分裂和分化不定芽细胞分裂和分化不定芽6-BA6-BA、KTKT、ZAZA、2iP2iP诱导细胞的分裂和根的分化诱导细胞的分裂和根的分化IBAIBA、IAAIAA、NAANAA、2,4-D2,4-DIBAIBA、IAAIAA和和IAAIAA诱导生根，诱导生根，2,4-D2,4-D诱导愈伤组织诱导愈伤组织抑制愈伤
21、组织形成，促进芽的形成抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GAGA3 3 第二十九页，本课件共有86页几种激素的配制方法几种激素的配制方法生长素生长素细胞分裂素细胞分裂素赤霉素赤霉素95%95%的酒精或的酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH或或KOHKOH0.50.5或或1mol/L1mol/L的的HCl+HCl+微热微热溶于水，溶于水，pH5.7pH5.7但不稳定，用但不稳定，用95%95%的酒精的酒精IAAIAA母液（母液（stock solutionstock solution）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），）每周制备新鲜备用，容易见光分解（几天内），也容易被
22、植株组织在几小时到几天内分解。生长素也容易被植株组织在几小时到几天内分解。生长素110-120110-120 C C稳定保存稳定保存1 1小时，小时，但但IAAIAA可以被低可以被低pHpH、光、氧和过氧化物破坏。、光、氧和过氧化物破坏。NAANAA和和2,4-D2,4-D比比IAAIAA稳定。稳定。CTKCTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。KTKT和和ZTZT在在120120 C C处理处理1 1小时仍能稳定存在，小时仍能稳定存在，BA100BA100 C C时时2020分钟。分钟。在碱性条件下，在碱性
23、条件下，GAGA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GAGA也变成也变成无活性的形式。无活性的形式。GAGA热不稳定，热不稳定，114114 C C处理处理2020分钟降低其活性达分钟降低其活性达90%90%，母液需制备，母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。新鲜的，并且采用过滤灭菌。第三十页，本课件共有86页激素配比模式生生长长素素与与细细胞胞分分裂裂素素的的比比例例决决定定着着发发育育的的方方向向，是是愈愈伤伤组组织织、长长根根还还是是长长芽芽。如如为为了了促促进进芽芽器器官官的的分分化化，应应除除去去或或降降低低生生长长素的浓度，或者调整培养
24、基中生长素与细胞分裂素的比例。素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高 有利于根的形成和愈伤组织的形成;适中 有利于根芽的分化;低 有利于芽的形成;生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素生长调节物质的使用甚微，一般用生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织培养表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂，细胞分裂素素0.0510mgL。第三十一页，本课件共有86页Growthme
25、diumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%The explant is completely covered with green shoots,and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant.No roots and no callus.Shoots developed on edges of upper surfac
26、e,and some root development has occuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet第三十二页，本课件共有86页NoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoor shoot development and no roots.Extensive callus generationP
27、oor shoot development and no rootsNAAreducedto0.1mg.l-1More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant第
28、三十三页，本课件共有86页NoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoor shoot development and no roots.Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAAreducedto0.1mg.l-1More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse developmen
29、t of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant第三十四页，本课件共有86页有机物质有机物质(Vitaminsandaminoacids)VitB1VitB6VitB3VitB5肌醇肌醇CHLHMEYE硫胺素硫胺素盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇烟酸烟酸泛酸钙泛酸钙水解酪蛋白水解酪蛋白(caseinhydrolysate)水解乳蛋白水解乳蛋白(lactoalbuminhydrolysate)麦芽提取物麦芽提取物(maltextract)酵母浸
30、出物酵母浸出物(yeastextract)促进细胞对培养基的反应第三十五页，本课件共有86页固化剂（固化剂（gellingagent）v琼脂琼脂来于来于seaweedseaweed对植物组织有一定的生理作用对植物组织有一定的生理作用用量一般为用量一般为7-10g/L7-10g/L，即，即0.7-1%0.7-1%（W/VW/V）太大，培养基过硬；太大，培养基过硬；太小，培养基不易凝固太小，培养基不易凝固不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。不同品牌的琼脂对外植体的反应也不一样。v其它其它gellingagent：Gelrite（脱乙酰吉兰糖胶）：（脱乙酰吉兰糖胶）：透明，透明，Pseudoman
31、as种发酵产物（多糖）种发酵产物（多糖）成分稳定。成分稳定。第三十六页，本课件共有86页碳源碳源营养物质营养物质渗透压稳定剂渗透压稳定剂类型类型蔗糖蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等葡萄糖、果糖、山梨醇、麦芽糖、淀粉等浓度浓度2-5%2-5%（W/VW/V）低浓度适合于原生质体培养低浓度适合于原生质体培养高浓度适合于胚和花药培养高浓度适合于胚和花药培养作用作用蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成蔗糖长时间高温处理会发生焦糖化，形成 蛋白黑素，抑制蛋白黑素，抑制细胞生长细胞生长第三十七页，本课件共有86页pHpH计计培养基的培养基的pHpH值：值：5.56v6：thegelmaybeto
32、ofirmv灭菌后灭菌后pH会降低会降低0.6-1.3v培养材料降低培养材料降低pH：产生有机酸，：产生有机酸，N利用利用测定方法测定方法vpH试纸试纸vpH计计pH调整方法调整方法v1N的的HCl和和NaOHv在加入在加入agar前调前调pH第三十八页，本课件共有86页培养基的选择和配制培养基的选择和配制选择选择择材料和种类而异择材料和种类而异参考前人的研究参考前人的研究MS培养基最为基本：培养基最为基本：高浓度的高浓度的N、K和和NH4+自己试验自己试验配制配制配母液（配母液（Stocksolution)取样取样加成分加成分测测pHok第三十九页，本课件共有86页母液的配制母液的配制大量元
33、素大量元素微量元素微量元素v浓缩浓缩1010倍（量加大倍（量加大1010倍）倍）v在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取100ml100mlv浓缩浓缩100100倍（量加大倍（量加大100100倍）倍）v在配制在配制1L1L培养培养基时，只取培养培养基时，只取10ml10ml第四十页，本课件共有86页以以KNO3为例为例1L培养基需要量为培养基需要量为19g。在配制母液时，增加在配制母液时，增加10倍量，为倍量，为190g。在母液中的。在母液中的浓度为浓度为190g/L，即，即0.19g/ml在配制培养基时，取在配制培养基时，取10ml，10ml0.19g/ml=19g第四十
34、一页，本课件共有86页无菌室无菌室培养室和接种室培养室和接种室室内灭菌可用室内灭菌可用2%2%新洁尔敏擦洗新洁尔敏擦洗75%75%乙醇喷雾乙醇喷雾UVUV照射照射2020分钟分钟第四十二页，本课件共有86页培养基培养基灭菌方法灭菌方法v高温高压蒸气灭菌高温高压蒸气灭菌v过滤灭菌过滤灭菌121121C C，1.1kg/cm1.1kg/cm2 2,15-20,15-20分钟，时间过长，培养基成分分钟，时间过长，培养基成分易变性失效易变性失效在高温高压下易分解的培养基和激素类在高温高压下易分解的培养基和激素类第四十三页，本课件共有86页器皿和接种工具的灭菌器皿和接种工具的灭菌解剖刀、镊子、剪刀等工具
35、采用干热灭菌法，解剖刀、镊子、剪刀等工具采用干热灭菌法，用烘箱灭菌，用烘箱灭菌，120 C120 C时时1 1小时小时外植体的灭菌原则外植体的灭菌原则充分灭菌，但不能损伤外植体充分灭菌，但不能损伤外植体不同外植体，灭菌要求不一样不同外植体，灭菌要求不一样第四十四页，本课件共有86页常用方法常用方法v75%乙醇乙醇v氯化汞（升汞）氯化汞（升汞）v次氯酸钠次氯酸钠表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸表面杀菌，具湿润和杀菌作用，浸3030秒秒常用浓度常用浓度0.1%0.1%处理处理5-105-10分钟，有残毒分钟，有残毒浓度浓度2-10%2-10%，时间，时间15-3015-30分钟，对植物无害分钟，对植
36、物无害第四十五页，本课件共有86页培养所需环境条件培养所需环境条件光照强度光照强度：一般而言，愈伤组织的形成并不需要光照；培养前期1000-4000lx，后期10000 lx。光照时数光照时数：不同培养的组织其光照时间不同，如烟 草愈伤组织采用1000 lx 16小时/日培养；而花椰菜组织培养则以4000 lx 9小时/日 光照为宜。光质光质：一般采用日光灯作为光源。组织培养中关键 的器官形成作用，是种光形态发生现象，是受光敏色素控制的。温度温度：一般习惯将培养物置于恒温下，通常应用的温度 为25OC 左右。光光第四十六页，本课件共有86页3 通过花药及花粉培养的单倍体育种单倍体植物在育种上的
37、意义单倍体植物在育种上的意义 概念：凡是具有配子体的染色体数的植物称为单倍体植物。单倍体一倍体，是一个“半倍体”。单倍体在自然界普遍存在，1922年发现了曼陀罗的单倍体植株，但自然发生率很低（0.0020.02%）。人工诱导单倍体在育种上的用途人工诱导单倍体在育种上的用途从单倍体的染色体加倍即可获得纯合的二倍体，也可获得纯合的多倍体，育种途径快速。有利于远缘杂种新类型的培育和稳定。单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进程。第四十七页，本课件共有86页起始于20世纪40年代，最初研究目的是调节和控制从花粉母细胞到成熟花粉的生长发育。大约经过半个世纪的发展，通过花药和花粉培养诱导形成单倍
38、体植物，目前在世界范围内已得到普及，已从170多种植物成功地诱导形成花粉起源植株或愈伤组织，以茄科、十字花科蔬菜作物研究居多。在曼陀罗、番茄、麝香百合、银杏、烟草、矮牵牛等植物上都较早诱导成功单倍体植物。第四十八页，本课件共有86页花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术 1.花药培养技术流程图花药培养技术流程图切下花蕾切下花蕾消毒消毒1010分钟分钟冲洗两次冲洗两次花药接种培养花药接种培养愈伤组织或胚状体愈伤组织或胚状体再生培养再生培养完整植株完整植株第四十九页，本课件共有86页 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术2.花粉培养花粉培养 的花粉分离和培养方法的花粉分离和培养方法机机械械分分离离培
39、培养养法法（包括液体培养基培养法和固体培养基培养法）；散落花粉散落花粉（shed pollen）培养法培养法。第五十页，本课件共有86页花药培养和花粉培养之比较花药培养和花粉培养之比较 统统计计表表明明，通通过过花花药药培培养养获获得得单单倍倍体体的的植植物物种种类类或或品品种种较较多多；设设备备上上要要求求简简单单。花花粉粉培培养养有有花花药药培培养养不不能能比比拟拟的的优优点点完完全全排排除除了了花花药药组组织织的的干干扰扰，避避免免花花粉粉与与花花药药组组织织的的体体细细胞胞形形成成分分裂裂和和增增殖殖的的竞竞争争，更更有有利利于于花花粉粉植植株株的的形形成成，所所诱诱导导形形成成的的胚
40、胚状状体体、愈愈伤伤组组织织及及植植株株均均来来自自花花粉粉，可可省省略略对对其其鉴鉴定定的的程程序序；在在诱诱导导形形成成单单倍倍体体的的同同时时，若若结结合合突突变变体体筛筛选选和和进进行行基基因因操作研究时，花粉培养更具优势。操作研究时，花粉培养更具优势。第五十一页，本课件共有86页花药培养技术花药培养技术1964年年Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；南洋金花花药培养发育成胚；1967年年Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；花药培养获得烟草植株；花药培养方法：花药培养方法：接种了花药的培养基一般在24-27OC，光照为2000lx，每天14小时培养。大
41、约经过20-30天，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织转移至分化培养基上培养，便可以进一步分化再生出完整植株来。第五十二页，本课件共有86页花药材料的选取花药材料的选取 选材关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体培选材关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雌发育。花药，均有可能诱导离体孤雌发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。或单核中晚期。第五十三
42、页，本课件共有86页花药培养技术步骤花药培养技术步骤选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾取下花蕾3-5度低温冷处度低温冷处理理3-10天天取花药取花药镜检镜检消毒接消毒接种培养种培养再生再生第五十四页，本课件共有86页花粉培养花粉培养50年代开始裸子植物花粉培养，获得愈伤组织；年代开始裸子植物花粉培养，获得愈伤组织；50、60年代被子植物花粉培养失败；年代被子植物花粉培养失败；1974年年Nitsch等次曼陀罗和烟草花粉获得植株等次曼陀罗和烟草花粉获得植株花粉培养的优点花粉培养的优点q从少量花粉获得大量花粉植株；从少量花粉获得大量花粉植株；q避免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子发育避
43、免花药壁产生的体细胞愈伤组织干扰，直接观察小孢子发育过程；过程；第五十五页，本课件共有86页花粉培养技术步骤花粉培养技术步骤v药壁向花粉提供营养物质；药壁向花粉提供营养物质；v通过药壁吸收、贮存和转化培养通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质基中的外源物质选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾取下花蕾（镜检）（镜检）预培养数天预培养数天取花药取花药接种接种分离分离花粉花粉低温预处理低温预处理消毒消毒过滤离心过滤离心再生再生第五十六页，本课件共有86页影响花药（粉）培养的因素影响花药（粉）培养的因素q供体基因型差异和发育差异供体基因型差异和发育差异甜椒、天竺葵甜椒、天竺葵旺盛植株，早期花蕾旺盛植株
44、，早期花蕾q花药（花粉）的生理状态花药（花粉）的生理状态q花粉发育期花粉发育期四分体期、小孢子早期、中期和四分体期、小孢子早期、中期和晚期（单核靠边期）晚期（单核靠边期）、有、有丝分裂期和双核花粉期丝分裂期和双核花粉期 利用花粉和花药培养于育种时，需足量供选择单倍体植株。故利用花粉和花药培养于育种时，需足量供选择单倍体植株。故如何提高诱导形成率十分重要。培养条件很关键如何提高诱导形成率十分重要。培养条件很关键。第五十七页，本课件共有86页q培养前低温预处理培养前低温预处理q培养基与培养方式的影响培养基与培养方式的影响花药、花粉培养前和培养初期的短期高温、低温、离心、花药、花粉培养前和培养初期的
45、短期高温、低温、离心、减压等。减压等。3-53-5 C3-10C3-10天，提高小孢子反应能力：曼陀罗、天，提高小孢子反应能力：曼陀罗、天仙子、柑桔天仙子、柑桔花药培养采用最多的培养基为花药培养采用最多的培养基为MSMS。我国科学工作者研制的。我国科学工作者研制的N6N6和马铃薯培养基；和马铃薯培养基；液体悬浮培养比固体培养基好；液体悬浮培养比固体培养基好；细胞分裂素有利于花粉胚形成；细胞分裂素有利于花粉胚形成；早期要求高蔗糖浓度：早期要求高蔗糖浓度：5-10%5-10%第五十八页，本课件共有86页再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍再生植株倍性和单倍体植株的保存及其加倍 在通过花花药药培培
46、养养获得的再生植株中，除单倍体植株外，非单倍体出现的频率与植物种类、再生途径以及培养基的成分有关。一般来说，在通过胚状体途径获得的再生植株中，其单倍体植株占有率较高。但种类不同也存在差异。例如从烟草花药再生植株几乎全部是单倍体植株，而在大白菜和油菜上，单倍体植株则分别占74%和22%。在经过愈伤组织、器官分化途径所获得的再生植株中，倍性变化更为常见。如在水稻的花药培养中，再生植株的倍性变化为x5x。第五十九页，本课件共有86页1.再生植株的倍性再生植株的倍性随着培养基中植物激素浓度的增加也会降低从中再生植株的单倍体占有率。为为什什么么有有此此倍倍性性变变化化？单倍体植株当然来自花粉。二倍体或多
47、倍体植株则较复杂，可能是花粉的自然加倍，可能来自花药组织的体细胞及其变异。鉴定方法：观察后代遗传性状是否分离；同工酶分析；分子标记技术等。花花粉粉培培养养再再生生的的植植株株倍倍性性也也有有变变化化，但由于操作上完全排除了体细胞的干扰，形成二倍体或多倍体均来自花粉的自然加倍。所以，可直接用于育种实际。第六十页，本课件共有86页2.单倍体植株的保存和加倍 单倍体植株不能正常结实，为了保持所获得的单倍体材料，常用的方法是将无菌苗的茎尖培养在无激素或低浓度激素的培养基上并定期转移。然而，单倍体非最终育种目标，需要染色体加倍。方法有：A.单倍体植株组织培养再生 切取单倍体植株的茎、叶等组织进行培养，可
48、获加倍植株。B.人工处理诱导加倍 常用秋水仙素处理，洗静后转移到新培养基中诱导植株再生。具体方法有培养细胞的处理；试管小苗的处理；顶芽、腋芽处理；花轴处理等。第六十一页，本课件共有86页4 组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早和比较广泛的。1904年就有十字花科的萝卜、辣根的胚培养苗问世。茎尖培养近年发展快，观赏植物如兰花、非洲菊和经济作物如甘蔗采用组织培养进行生产性的大量繁殖。果树上利用茎尖和腋芽培养进行砧木的快速繁殖，如苹果矮化砧的1茎尖，8月可繁殖60000株。石刁柏、花椰菜、木立花椰菜等快繁，比传统方法大大提高繁殖系数。第六十二页，本课件共有86页自交不亲和系也可通过
49、组织培养方式大量繁殖，可免蕾期授粉之人工和防止自交衰退。无性繁殖作物的“无病苗”生产，据此取得重大进展。马铃薯、芋、大蒜、姜、柑橘等茎尖脱毒。组织培养技术进行种质资源的保存可节省空间，方法简便，繁殖潜力大，避免田间种植的天然杂交，结合低温和超低温的冷冻贮藏，对于保存遗传资源和运输、交换都很方便。第六十三页，本课件共有86页组织培养技术的主要阶段组织培养技术的主要阶段 组织和器官培养技术包括实验室设计、建造和设备；培养基的配制；表面灭菌和接种；试管苗出瓶移栽及后期管理。整个过程分三个阶段：1.无无菌菌培培养养的的建建立立 主要考虑选择外植体、培养基和环境条件的性质。2.培养养再再生生植植株株 利
50、用诱导产生愈伤组织和利用茎尖培养诱生不定新梢等途径。3.准准备备将将再再生生植植株株移移栽栽入入土土 包括新梢插条的生根、植株的锻炼和使植株由异样状态变为自养状态。第六十四页，本课件共有86页是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养，包括茎段、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、花托、茎尖、球茎、叶片、子叶、花序、花瓣、子房、花药、花托、果实、种子等。果实、种子等。此处指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种此处指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官器官 组织以及愈伤组织的培养。组织以及愈伤组织的培养