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1、实验实验4 动植物细胞器分离、制备与观察动植物细胞器分离、制备与观察 I 线粒体制备与活性鉴定【目的目的】1掌握分离制备动物和植物细胞线粒体的方法。2对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理原理】n线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过藕联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。n将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细
2、胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。n悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在04，避免酶失活。n细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还
3、原成无色。n詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动、植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染部分本身具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆集下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞的死亡。鼠肝线粒体的分离鼠肝线粒体的分离【材料材料】鼠肝脏或猪肝脏。【实验用品实验用品】1试剂：(1)0.25 molL蔗糖+0.01 molL三羟甲基氨基甲烷(Tris)一盐酸缓冲液(pH 7.4)：0.1 molL三羟甲基氨基甲烷溶液 10
4、 mL 0.1 molL盐酸 8.4 mL 加双蒸水到100 mL，再加蔗糖使浓度为0.25 molL。(2)0.34 molL蔗糖+0.01 molL Tris一盐酸缓冲液(pH7.4)，配法同上。(3)1詹纳斯绿B(Janus green B)染液，称取50 mg詹纳斯绿B液溶于5mL生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为1原液。(4)姬姆萨染液(Giemsa)：称取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、纯甲醇33 mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒入混匀，56左右保温2 h，使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为Giemsa原液，保存于棕
5、色瓶。使用时吸出少量用115molL磷酸缓冲液作1020倍稀释。(5)115 molL磷酸缓冲液 (pH 6.8)：115 molL磷酸二氢钾(KH2PO4)50 mL115 molL磷酸氢二钠(Na2HPO4)50 mL(6)卡诺(Cornay)固定液：无水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL(7)生理盐水2器具：n解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。【实验步骤实验步骤】1制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2 g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖溶液洗涤数次。
6、然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。2差速离心：将0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。分离细胞核：鼠肝匀浆700g离心10 min 沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(1)洗涤(0.25 molL预冷蔗糖溶液5 mL洗涤2次，每次1000g离心15 min。沉淀(细胞核及质膜碎片)上清液(2)与上清(1)合并分离线粒体：混合上清液10000g离心10 min沉淀(线粒体)上清液(弃去)洗涤加预
7、冷的0.25 molL蔗糖溶液10 mL，10000g离心10 min沉淀(纯化的线粒体)上清液(弃去)3活性鉴定：(1)细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40)检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2)线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1詹钠斯绿溶液染液，10 min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。玉米线粒体的分离玉米线粒体的分离n从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。n分
8、离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二价阳离子，Ca2除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。【材料材料】玉米黄化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)。【实验用品实验用品】1试剂：（1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白蛋白(BSA)。50mmol/L的Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)配法：50mL0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tri
9、s)溶液与42mL 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100mL。（2）保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)（3）20次氯酸钠(NaClO)溶液。（4）1詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。2器材：温箱、冰箱、纱布、瓷研钵、冷冻控温高速离心机。【实验步骤实验步骤】1玉米种子用20次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30min，再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内，保持湿度，置温箱28于暗处培育23d。待芽长到12cm长时剪下约15g，放041h。2加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆。3用多层纱布过滤，滤液经700g离心10min。除去核和杂质沉淀。4取上清液10
10、000g离心10min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。5沉淀为线粒体，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在04进行。6线粒体的观察：取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。【注意事项注意事项】n实验全过程要求在04进行，如果使用非冷冻控温的离心机，一般只宜分离细胞核和线粒体，同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织、缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。【实验报告实验报告】n绘制线粒体示意图。II 叶绿体的分离与荧光观察叶绿体的分离与荧光观察【目的目的】了解叶绿体分离的一般原理和方法
11、，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。【原理原理】叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(035 molL氯化钠或04 molL蔗糖溶液)中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000 rmin离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000 rmin离心，可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。在室温下进行分离要迅速。n某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停
12、止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光(称为自发荧光)，如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光(称为间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。【材料材料】菠莱叶片。【实验用品实验用品】1试剂：蒸馏水，0.35 molL氯化钠溶液，0.01吖啶橙。2器材：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。【实验步骤实验步骤】1选取新
13、鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35 molL氯化钠溶液45mL中，置入组织捣碎机或研钵中。2利用组织捣碎机低速(5000 rmin)匀浆35 min，或研磨成匀浆。3用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4取滤液4 mL在1000 rmin下离心2 min，弃去沉淀。5将上清液在3000 rmin下离心5 min弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。6沉淀用0.35 molL氯化钠溶液悬浮。7取叶绿体悬液l滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加l滴0.01吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。8观察叶绿体的形态结构、测量510个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。【实验报告实验报告】n绘制普通光学显微镜下观察的叶绿体形态示意图，记录荧光显微镜观察的现象，分析结果。