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1、第五章第五章 分子标记分子标记遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记分子标记分子标记分子标记分子标记分子标记在家畜育种的应用分子标记在家畜育种的应用分子标记在家畜育种的应用分子标记在家畜育种的应用 近近10年来，分子遗传学和分子生物学年来，分子遗传学和分子生物学有了突飞猛进的发展，主要表现在：有了突飞猛进的发展，主要表现在：大量大量DNA水平上的分子遗传标记及其检测水平上的分子遗传标记及其检测技术；技术；DNA序列测定技术；序列测定技术；转基因技术；转基因技术；核移植（体细胞克隆）技术；核移植（体细胞克隆）技术；大量的分子标记提供的信息可用于：大量的分子标记提供的信息可用于：QTL的检测；的检测；标
2、记辅助选择；标记辅助选择；标记辅助基因导入；标记辅助基因导入；标记辅助杂种优势利用；标记辅助杂种优势利用；标记资源保存；标记资源保存；研究品种起源与发展；研究品种起源与发展；亲子鉴定；等等。亲子鉴定；等等。研究最多研究最多第一节遗传标记的概念第一节遗传标记的概念概念：概念：遗传标记是指那些可准确鉴别的能遗传标记是指那些可准确鉴别的能反映个体特异性的遗传特征，是一类与目反映个体特异性的遗传特征，是一类与目标基因紧密连锁，易于从表现型上直观鉴标基因紧密连锁，易于从表现型上直观鉴别的等位基因。通过对标记性状的直接选别的等位基因。通过对标记性状的直接选择，从而实现对目标基因的间接地选择。择，从而实现对
3、目标基因的间接地选择。理想的标记应具备：理想的标记应具备：高多态性高多态性，多态是指标记在群体中有多种基因型，多态是指标记在群体中有多种基因型 ，多态程度高，个体之间在标记上就能表现出差异，多态程度高，个体之间在标记上就能表现出差异，所提供的信息也就越多；所提供的信息也就越多；数量多，而且均匀地覆盖整个基因组；数量多，而且均匀地覆盖整个基因组；对它的测定不受年龄、性别、环境等因素的限制；对它的测定不受年龄、性别、环境等因素的限制；共显性共显性，能够准确判别所有可能的基因型，能够准确判别所有可能的基因型。传统的标记有：传统的标记有：1、形态学标记：、形态学标记：主要指一些具有鲜明外部特征的质量性
4、状，主要指一些具有鲜明外部特征的质量性状，并可以通过表型来推断其基因型，如毛色、有无犄角等；并可以通过表型来推断其基因型，如毛色、有无犄角等；2、细胞学标记、细胞学标记：是指染色体形态、数目和结构的变异，：是指染色体形态、数目和结构的变异，用具有异常染色体的个体与具有正常染色体的个体杂交或用用具有异常染色体的个体与具有正常染色体的个体杂交或用染色体替换等手段，可对一些基因进行定位；染色体替换等手段，可对一些基因进行定位；3、生化标记：、生化标记：是在血液或乳中的蛋白质（包括酶）的多是在血液或乳中的蛋白质（包括酶）的多态性，这些多态性可通过免疫反应或电泳技术反映出来，并态性，这些多态性可通过免疫
5、反应或电泳技术反映出来，并由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工酶等。酶等。传统标记的主要缺陷传统标记的主要缺陷：多态性和数量有限。：多态性和数量有限。第二节第二节 分子标记分子标记（molecular marker）1980 Botstein 限制性片段长度的多型性限制性片段长度的多型性 1981 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)1982 VNTR(various number of tandem repeats)19831985 K.B.Mullis 基于聚合酶链式
6、反应的多型基于聚合酶链式反应的多型性性1984 PCR-based polymorphsm19851996 E.Lander 单核苷酸多型性单核苷酸多型性1986 SNP(single nucleotide polymorphism)全基因全基因DNA测序测序是揭示是揭示DNA多型性的最清晰，最多型性的最清晰，最全面的方法，是研究基因功能，揭示生命奥秘的重全面的方法，是研究基因功能，揭示生命奥秘的重要途径要途径。开发开发RFLP及以及以PCR为基础的分子标记技术为基础的分子标记技术，对目，对目的基因进行分子标记的精细定位，并将分子标记应的基因进行分子标记的精细定位，并将分子标记应用于遗传改良的
7、辅助选择中，仍是分子技术育种和用于遗传改良的辅助选择中，仍是分子技术育种和现代农业体系中十分重要与有效的领域。现代农业体系中十分重要与有效的领域。分子标记具有明显的优越性：分子标记具有明显的优越性：直接以直接以DNADNA的形式表现，在各个组织、各发育时期均的形式表现，在各个组织、各发育时期均可检测，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问可检测，不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题；题；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要专门创多态性高，自然存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；造特殊的遗传
8、材料；表现为中性，即不影响目标形状的表达，与不良性状表现为中性，即不影响目标形状的表达，与不良性状无必然的连锁；无必然的连锁；共显性。共显性。分子标记是传统遗传标记的补充和发展分子标记是传统遗传标记的补充和发展。RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms限制性酶切片段长度多态性，是指用限制性内切酶限制性酶切片段长度多态性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组酶切不同个体的基因组DNADNA后，所得的含有同源序列后，所得的含有同源序列的酶切片段在长度上所存在的差异。的酶切片段在长度上所存在的差异。差异的产生是由于差异的产生是由于DNADNA序列
9、中个别碱基的变异而造成序列中个别碱基的变异而造成某个限制性内切酶酶切位点的产生或丢失。某个限制性内切酶酶切位点的产生或丢失。最早开发的最早开发的DNADNA标记。标记。特点特点:无表型效应无表型效应;共显性共显性双亲的两个以上分子量不同的多态性片双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在段均在F F1 1中表现中表现;种族特异性种族特异性;标记范围遍及全基因组标记范围遍及全基因组;但所需但所需DNADNA量大量大,检测步骤繁琐检测步骤繁琐,检测时间相对较长检测时间相对较长（一般需（一般需10-1410-14天）天）,耗费成本高耗费成本高,需利用放射性同需利用放射性同位素。位素。可将可将RFLP标
10、记转化为标记转化为PCR-RFLP标记标记CAPs又称又称PCR-RFLPPCR-RFLP即利用特定引物进行即利用特定引物进行PCRPCR扩增，将扩增，将PCRPCR产物用限制产物用限制性内切酶酶切，检测酶切片段大小差异，观察其性内切酶酶切，检测酶切片段大小差异，观察其多态性。多态性。RAPDrandomly amplified polymorphic DNA-randomly amplified polymorphic DNA-随机扩随机扩增多态性增多态性DNADNA是基于是基于PCRPCR技术的分子标记，它是用随机序列组成技术的分子标记，它是用随机序列组成的寡核苷酸作为引物，通过专门的的寡
11、核苷酸作为引物，通过专门的PCRPCR反应扩增所反应扩增所获得的长度不同的多态性获得的长度不同的多态性DNADNA片段。片段。RAPD原理图原理图遵循孟德尔方式遗传；遵循孟德尔方式遗传；随机引物分子已成为商品，数量几乎无限；随机引物分子已成为商品，数量几乎无限；一次反应可检测一次反应可检测1-101-10位点；位点；以显性为主，不受环境影响，无上位性；以显性为主，不受环境影响，无上位性；成本低，成本低，DNADNA用量少，检测时间短（一般用量少，检测时间短（一般1010小时），小时），灵敏度高，灵敏度高，重复性差。重复性差。AFLPAmplified Fragment Length Polym
12、orphism-Amplified Fragment Length Polymorphism-扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性是指通过特定引物和是指通过特定引物和DNADNA多聚酶链式反应复制多聚酶链式反应复制并扩增不同个体基因组并扩增不同个体基因组DNADNA模板后，所得扩增模板后，所得扩增片段在长度上的差异。片段在长度上的差异。不同个体的不同个体的DNADNA序列存在差异，在复制特定的序列存在差异，在复制特定的DNADNA序列时所需的引物也可能不同，同一引物可诱导序列时所需的引物也可能不同，同一引物可诱导某一个体的某一个体的DNADNA片段得以复制，而在另一个体中就片段得以复制，而在另
13、一个体中就可能不能诱导。可能不能诱导。AFLPAFLP技术结合了技术结合了RFLPRFLP与与RAPDRAPD的特点，揭示的遗传的特点，揭示的遗传多型性十分丰富，一次反应可检测数十条，多型性十分丰富，一次反应可检测数十条，AFLPAFLP为共显性标记，成为目前较为经济，有效，快速为共显性标记，成为目前较为经济，有效，快速的一种分子标记技术。的一种分子标记技术。AFLP分析步骤分析步骤:选用识别选用识别4 4碱基酶切位点的内切酶碱基酶切位点的内切酶MseIMseI和识别和识别6 6碱基酶碱基酶切位点的切位点的EcoRIEcoRI（按概率计算，前者识别的酶切位点较（按概率计算，前者识别的酶切位点较
14、后者多）共酶解总后者多）共酶解总DNADNA；加入人工合成的并能与加入人工合成的并能与MseIMseI，EcoRIEcoRI两端点连接的接头两端点连接的接头分子，再加入分别与两端特异靶序列（包括两端接头分子，再加入分别与两端特异靶序列（包括两端接头序列，酶切位点序列以及在序列，酶切位点序列以及在33端延伸的端延伸的3 3个随机碱基）个随机碱基）互补的引物分子进行互补的引物分子进行PCRPCR扩增。扩增。由于不同试材酶切位点序列及其毗邻序列的突变，就由于不同试材酶切位点序列及其毗邻序列的突变，就会在会在PCRPCR扩增中表现出扩增中表现出M-EM-E片段长度的多型性，即称为片段长度的多型性，即称
15、为扩增片段长度的多态性（扩增片段长度的多态性（AFLPAFLP）。）。特点特点用于用于AFLPAFLP分析的限制性内切酶与选择性碱基组合分析的限制性内切酶与选择性碱基组合的数目和种类很多的数目和种类很多,AFLP,AFLP可以产生的标记数目是无可以产生的标记数目是无限的；限的；AFLPAFLP的多态性高，一次的多态性高，一次PCRPCR反应可以同时检测多个反应可以同时检测多个遗传位点；遗传位点；共显性；共显性；模板用量少，对模板浓度的变化不敏感；模板用量少，对模板浓度的变化不敏感；扩增的片段较短，分辨率高；扩增的片段较短，分辨率高；利用特定引物扩增，退火温度高，假阳性低，可利用特定引物扩增，退
16、火温度高，假阳性低，可靠性高；靠性高；扩增片段与基因组的单一位置相对应，可作为遗扩增片段与基因组的单一位置相对应，可作为遗传图谱和物理图谱的位标；传图谱和物理图谱的位标；分析成本高分析成本高 VNTRvariable number tandem repeat-variable number tandem repeat-可变数目串状重可变数目串状重复复.在真核生物基因组中，存在许多串状重复序列，例如在真核生物基因组中，存在许多串状重复序列，例如CACACA.CACACA.或或GTGTGT.GTGTGT.。由于重复单位的重复次数在个体间有很大差异，因而由于重复单位的重复次数在个体间有很大差异，因而
17、可作为一种标记，而不同的重复次数就构成了不同的可作为一种标记，而不同的重复次数就构成了不同的等位基因。等位基因。按重复单位的大小，可分为微卫星标记和小卫星标记。按重复单位的大小，可分为微卫星标记和小卫星标记。VNTR （串联重复的数目变异）（串联重复的数目变异）探针探针P1P3P2P45 repeats6 repeats7 repeats8 repeatsSSR （简单序列的重复）（简单序列的重复）(Simple Sequence Repeats)随着基因组测序的发展随着基因组测序的发展 密度增加，定位准确密度增加，定位准确 检测快速，重复性好检测快速，重复性好 SSR标记将成为基因定位和标记
18、将成为基因定位和MAS 的重要技术之一的重要技术之一原理原理1974年，年，Skinner等在寄居蟹的基因组中发现了含等在寄居蟹的基因组中发现了含TAGG重复单位的简单重复序列。重复单位的简单重复序列。随后在人、动物和酵母的基因组中发现了的大量的简单随后在人、动物和酵母的基因组中发现了的大量的简单重复序列，因其重复单位比小卫星短，故称为微卫星重复序列，因其重复单位比小卫星短，故称为微卫星（microsatellite）。）。一般认为一般认为微卫星是由微卫星是由16bp碱基为核心序列组成一个碱基为核心序列组成一个重复单位，头尾相连的串联序列。重复单位，头尾相连的串联序列。微卫星序列存在于真核生物
19、的基因组中，呈多拷贝均匀微卫星序列存在于真核生物的基因组中，呈多拷贝均匀分布。分布。微卫星由于其微卫星由于其本身核心序列的重复次数不同本身核心序列的重复次数不同而表现出而表现出多多态性态性;微卫星位点两端的微卫星位点两端的侧翼序列侧翼序列多是较保守的单拷贝序列，多是较保守的单拷贝序列，侧翼序列使某一微卫星特异地定位于染色体的某一部位。侧翼序列使某一微卫星特异地定位于染色体的某一部位。其特点其特点:共显性的遗传标记；共显性的遗传标记；丰富的多态性。丰富的多态性。可以根据可以根据侧翼序列侧翼序列设计一对特异的引物，扩增出每设计一对特异的引物，扩增出每个位点的序列，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，个位点的序
20、列，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较比较扩扩增产物的增产物的大小大小，即可检测出不同个体在每个微卫星，即可检测出不同个体在每个微卫星位点的多态性。位点的多态性。20Nt特异引物特异引物STSSequence-tagged SitesSequence-tagged Sites序列标签位点序列标签位点基因组中长度为基因组中长度为200200500bp500bp，且核苷酸顺序已知，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列用的单拷贝序列用PCRPCR技术将其专一扩增出来。技术将其专一扩增出来。STSSTS引物获得主要来自引物获得主要来自RFLPRFLP单拷贝的探针序列，微单拷贝的探针序列，微卫星序列，卫星序列，Alu
21、Alu因子，表达基因序列及人造酵母染因子，表达基因序列及人造酵母染色体或粘粒的插入末端序列。色体或粘粒的插入末端序列。SNP（单核苷酸多型性）（单核苷酸多型性）single nucleotide polymorphism 是指在单个核苷酸上的突变所引起的多态。是指在单个核苷酸上的突变所引起的多态。SNP标记技术是九十年代末发展起来的第三代分子标记技术是九十年代末发展起来的第三代分子标记。标记。采用采用SNP技术可将不同试材等位技术可将不同试材等位DNA分子区段间分子区段间的任一点突变序列检测出来。的任一点突变序列检测出来。由于这一技术要求的仪器设备昂贵，合成的探针数由于这一技术要求的仪器设备昂
22、贵，合成的探针数量大，成本高，目前难以广泛应用。量大，成本高，目前难以广泛应用。基本原理基本原理是根据已知的某一是根据已知的某一DNA分子的核苷酸序列序列，分子的核苷酸序列序列，以矩阵（以矩阵（array）方式在芯片）方式在芯片(chips)上，依次上，依次点入合成的点入合成的15（或（或20或或25）个碱基的探针（每）个碱基的探针（每次移动一个碱基），并对每一探针在第次移动一个碱基），并对每一探针在第7（或（或11或或13）碱基分别替换成）碱基分别替换成A,T,C,G，合成，合成4个探个探针为一组，与被荧光标记的总针为一组，与被荧光标记的总DNA进行分子杂交。进行分子杂交。在被替换的碱基位点
23、上，可被互补杂交的在被替换的碱基位点上，可被互补杂交的chip位位点会显示出明显的荧光（图点会显示出明显的荧光（图）。）。单核苷酸多型性单核苷酸多型性 SNP(single nucleotide polymorphism)总总DNA（DNA片段）序列测定片段）序列测定例：例：人线粒体人线粒体DNA片段片段 16569 bp探针合成探针合成 p15.7 p20.11 p25.13 p15.7 ATCCTGATCGGGTAG ATCCTGTTCGGGTAG ATCCTGCTCGGGTAG ATCCTGGTCGGGTAG DNA 5 TGAACTGTATCCGACAT.3Primer(p15.7)3
24、 t g a c a t A gg c t g t a g t g a c a t C gg c t g t a g t g a c a t G gg c t g t a g t g a c a t T gg c t g t a gT G A A C T G T A T C C G A C A TACGT该样本该样本DNA序列；序列；A C T T G A C A T A G G C T G T AT G A A C T G T A T C C G A C A TACGT该样本该样本DNA序列；序列；A C T T G A C A T G G G C T G T APyro-sequencin
25、gPCR-SSCPPCRSSCP是基于是基于PCR的单链构象多态性的单链构象多态性(single-stranded comformation polymorphism)分析技分析技术。术。基本原理：经基本原理：经PCR扩增的扩增的DNA片段在片段在变性剂（如甲酰胺）变性剂（如甲酰胺）或低离子浓度或低离子浓度下，经下，经高温高温处理使之处理使之解链解链并并保持在单链状态保持在单链状态下下，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当，然后于一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，当DNA发生碱基置换突变（点突变）时，会造成单链构象发生碱基置换突变（点突变）时，会造成单链构象不同不同，通过显色或显
26、影在凝胶上显示出带型的差别，即多，通过显色或显影在凝胶上显示出带型的差别，即多态性。态性。与与PCRRFLP相比，相比，PCRSSCP可以检测所有的点突可以检测所有的点突变，包括变，包括PCRRFLP能够检测的酶切位点的突变。能够检测的酶切位点的突变。SSCP原理图解原理图解影响影响SSCP显示的因素显示的因素PCR扩增的特异性要强扩增的特异性要强。设计引物时要使引物能。设计引物时要使引物能与与DNA模板特异性结合，而且引物之间不能形成模板特异性结合，而且引物之间不能形成二聚体，引物内最好不要存在发夹结构，还要选二聚体，引物内最好不要存在发夹结构，还要选择一个合适的退火温度。择一个合适的退火温
27、度。PCR扩增的产量要高扩增的产量要高。PCR扩增的片段不宜过长扩增的片段不宜过长。一般以。一般以100300bp为宜，此时为宜，此时SSCP检出率约为检出率约为99；但；但当当DNA片段为片段为300450bp时，其检出率约为时，其检出率约为89。2012.555电泳最能清楚电泳最能清楚的表现出差异的表现出差异SSCP结果分析结果分析只有一处点突变的情况下，正常个体和突变纯合个体在只有一处点突变的情况下，正常个体和突变纯合个体在双链双链DNA完全变性时，应该只有两条电泳条带，突变完全变性时，应该只有两条电泳条带，突变杂合子有杂合子有4条带；条带；但大多由于变性不完全，因此在这些带的前方还有一
28、条但大多由于变性不完全，因此在这些带的前方还有一条带是没有变性的双链带是没有变性的双链DNA。杂合子有时只有。杂合子有时只有3条带，第条带，第4条带在凝胶上常与第条带在凝胶上常与第3条带聚在一起难以区分。条带聚在一起难以区分。实验过程中特别注意设置对照：包括上样缓冲液中不加实验过程中特别注意设置对照：包括上样缓冲液中不加变性剂，未经变性处理的变性剂，未经变性处理的PCR产物作为对照，和已知具产物作为对照，和已知具有点突变的片段长度相似的有点突变的片段长度相似的DNA作为对照。作为对照。野生型野生型 杂合型杂合型 突变型突变型PCR扩增扩增,得到更多特异得到更多特异DNA片段片段变性变性中性聚丙
29、烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳应用应用遗传图谱的构建遗传图谱的构建数量性状位点定位数量性状位点定位分子标记辅助选择分子标记辅助选择：通过与目标基因紧密：通过与目标基因紧密连锁的分子标记判断目标基因的存在。连锁的分子标记判断目标基因的存在。遗传多样性评估遗传多样性评估系谱确证系谱确证猪氟烷基因的早期选择猪氟烷基因的早期选择氟烷麻醉剂氟烷麻醉剂氟烷敏感反应阳性猪在应激的条件下会导致恶性氟烷敏感反应阳性猪在应激的条件下会导致恶性高热综合征（高热综合征（MHSMHS）。）。应激时猪体温骤然升高至应激时猪体温骤然升高至42424545，呼吸急促，呼吸急促，心跳过速，肌肉僵直，后肢强直，肌体内水及电
30、心跳过速，肌肉僵直，后肢强直，肌体内水及电解质代谢紊乱，肌肉中乳酸大量聚积，严重时可解质代谢紊乱，肌肉中乳酸大量聚积，严重时可引起代谢酸中毒或心力衰竭而骤然死亡。引起代谢酸中毒或心力衰竭而骤然死亡。恶性高热综合征与兰尼定受体基因恶性高热综合征与兰尼定受体基因(ryr1)(ryr1)有关。有关。由由兰尼定受体基因突变造成兰尼定受体基因突变造成的。的。兰尼定受体是骨骼肌细胞内肌浆网上控制钙离子（兰尼定受体是骨骼肌细胞内肌浆网上控制钙离子（CaCa2+2+）进出肌纤维的通道，应激敏感猪的基因突变）进出肌纤维的通道，应激敏感猪的基因突变改变了兰尼定受体结构，影响了受体的正常功能，改变了兰尼定受体结构，
31、影响了受体的正常功能，使通道关闭及泵的作用受到抑制。使通道关闭及泵的作用受到抑制。在刺激因子作用下入氟烷麻醉下造成钙离子的大量在刺激因子作用下入氟烷麻醉下造成钙离子的大量析出，引起电解质紊乱，出现肌肉强直，体温剧烈析出，引起电解质紊乱，出现肌肉强直，体温剧烈升高等恶性高热综合征，并且析出的钙离子激活过升高等恶性高热综合征，并且析出的钙离子激活过量的糖原酵解，使肌糖原酵解过程加速，引起肌肉量的糖原酵解，使肌糖原酵解过程加速，引起肌肉pHpH的异常变化，导致劣质肉的发生。的异常变化，导致劣质肉的发生。RYR1的的PCRRFLP分析分析RYR1的的cDNA C1843 T1843,使受体蛋白使受体蛋
32、白Arg615 Cys615，导致限制性内切酶识别位点的改变，导致限制性内切酶识别位点的改变，HhaI（GCG C）HgiAi（GTGCT C）。）。步骤：步骤：1、采取猪的新鲜血液，提取、采取猪的新鲜血液，提取DNA；2、利用特定的氟烷基因的引物，进行、利用特定的氟烷基因的引物，进行PCR扩增；扩增；3、限制性内切酶、限制性内切酶HhaI或或CfoI（同裂酶）（同裂酶）对对PCR产物进产物进行酶切；行酶切；4、结果分析。、结果分析。氟烷检测氟烷检测结果分析结果分析：出现：出现一条带一条带（659bp）,RYR1基因型基因型 T/T (halnn);出现出现二条带二条带（493bp、166bp），），RYR1基因型基因型C/C (halNN);出现出现三条带三条带（659bp、493bp、166bp），），RYR1基因型基因型T/C (halNn)。M123659bp493bp166bp SSCP(单链构象的多型性单链构象的多型性)(Single Strand Conformation Polymorphism)家家 猪猪 氟氟 烷烷 基基 因因 SSCP 图图 谱谱