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1、Cloning VectorsCloning Vectors二、基因工程的基本程序二、基因工程的基本程序载体质粒载体质粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞选出含有重选出含有重组组DNADNA的细的细胞扩增胞扩增表达表达abbAAb第六章第六章分子克隆常用的分子克隆常用的载体载体l第一节质粒载体l第二节噬菌体载体l第三节真核细胞的克隆载体第一节质粒载体l一、质粒的基本特性l二、质粒的分离纯化方法l三、质粒载体的选择l四、大肠杆菌质粒载体l五、多种功能的衍生质粒的组建一、质粒的基本特性l1质粒l2质粒的命名l3质粒的种类l4质粒的复制类型l5质
2、粒的分子生物学特征二、质粒的分离纯化方法l1氯化铯溴乙锭浮密度超速离心密度梯度分离法（图6-3）l2.Triton和PEG化学提取法l3煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNAl4碱变性法抽提质粒DNAl质粒的存在形式：呈共价闭合环状超螺旋的SC构型（cccDNA）松弛开环的OC型（ocDNA）松弛线性的L构型（cDNA）基本步骤：细菌生长和质粒的扩增菌体收获和溶菌质粒纯化氯化铯浮密度分离法当各种DNA分子在有饱和溴乙锭染料存在下进行氯化铯密度梯度离心时，与共价闭环状分子结合的染料要大大少于与开环状或线状DNA的结合，因此，在氯化铯梯度离心中质粒DNA与染料相结合后生成的条带是在较高的密度范围内，而
3、断裂为线状的染色体DNA与溴乙锭结合较多，生成的条带是低密度范围。所以，离心后形成2条带，上面的条带主要是染色体DNA及少量开环状质粒DNA，下面的带则是共价闭合环状质粒DNA。碱变性法抽提质粒DNA该法也是一种快速抽提质料DNA的方法。其分离原理，大肠杆菌的染色体约有4700KB长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的PH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链便分离成单链，而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢链被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当PH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是
4、小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。三、质粒载体的选择作为理想的质粒载体，应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；（3）在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征，（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。四、大肠杆菌质粒载体l1pSC101质粒载体l2pBR322质粒载体分别由pMB1(ori)、pSF2124(Ampr)和Psc101(Tetr)三种质粒通过载体改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性基因的理想的基因克隆载体。Ampr
5、（Scal、PvuI、PstI切点）Tetr（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切点）五、多种功能的衍生质粒的组建五、多种功能的衍生质粒的组建l（一）、带有不同种类抗性基因的质粒载体l（二）、高拷贝数质粒pAT153l（三）、正选择质粒l（四）、多功能质粒-PUC质粒带有不同种类抗性基因的质粒载体lpBR328是从pBR322改建成的质粒，大小为4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、Pvu和BalI的单一酶切位点。除了pBR328外，pBR325也有类似结构。lpAT153是由pBR322质粒改造而成，这种质粒的拷贝数比pBR
6、322高1.53倍。它的大小是3.6kb,选择标记有氨苄青霉素抗性基因Ampr和四环素抗性基因Tetr、单一切点的限制性内切核酸酶有Pva、Pst、BamH、Cla、Sal、EcoR、Hind。正选择质粒lpTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环素的抗性基因（Tetr）前有噬菌体的PR启动子，同时在这种载体中还带有噬菌体编码CI蛋白质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单一的Hind和Bcl切点，若利用其中任何一个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表现
7、出对四环素的抗性，达到正选择的效果。第二节噬菌体载体l一、噬菌体的一般生物学特性l二、噬菌体载体l三、粘性质粒l四、单链DNA噬菌体载体l烈性噬菌体l温和噬菌体l溶源化细菌l溶源化l原噬菌体二、噬菌体载体l（一）DNA分子l(1)噬菌体基因结构：如图6-11、6-12lCos位点位点（Cohesive-endsite）：DNA为线状双链分子，两端各有几个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。l(2)噬菌体DNA的复制l（二）噬菌体的类型l插入型载体l替换型载体l(三)噬菌体载体的应用l1.转染作用l转染转染：由宿主细胞捕获
8、噬菌体或病毒DNA的过程。l转导转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。l转化转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。l2.DNA的体外包装l（四）常用噬菌体l凯伦噬菌体载体l这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。lCharon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。lCharon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。三、粘性质粒粘性质粒（Cosmid）带有噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后
9、，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。在酵母细胞中常用的载体的共同特点l这些载体，它们共同的特点是：（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体，如图6-19。第三节真核细胞的克隆载体l一、在酵母细胞中克隆基因
10、常用的载体（共同特点）1.整合型载体（YIP）2.复制型载体（YRP）3.附加体型载体（YEP）l二、植物基因克隆的载体Ti质粒l三、动物细胞基因克隆的载体整合型载体（YIP）lYIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。复制型载体（YRP）lYRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母
11、的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（ShuttleVector），（如图6-20）穿梭载体在基因工程中广泛使用。YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。附加体型载体（YEP）lYEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2m质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2m质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2m质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体PYF92（如图6-21）就是由酵母的2m质粒、pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。YEP型载体对酵母具有很高的
12、转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。载 体载体载体（Vector）：能携带外源基因导入受体细胞，这种运载工具称载体。1.克隆载体克隆载体:具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。2.表达载体表达载体:不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、pKK223-33.载体的种类：质粒、噬菌体衍生物（COS、M13）、动物病毒。共同特征：自主复制易于扩增分离纯化有非必需区有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点多克隆位点：一个载
13、体上的某一个区域含有多个单一酶切位点有选择标记基因有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列）质粒l本质是细菌染色体以外的遗传物质，是一种简单的，环状DNA分子，能自主复制。l命名：前一个小写p代表质粒，后两个大写英文字母代表发现者或实验室，数字代表编号，如pBR322质粒。l种类种类：lF质粒：使宿主染色体上的基因随其一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。lR质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生素抗性基因lCol质粒：有编码大肠杆菌素基因质粒的类型和特性l传递类型：l接合型：含有转移基因，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。如：F质粒、部分R、Col质粒l非接合型：不含有转移基因，质粒不
14、能从一个细胞转移到另一个细胞。如：部分R、Col质粒（安全常用）l复制类型：严紧型：低拷贝1-3个拷贝/菌l松弛型：高拷贝10-60个拷贝/菌l特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代子代）l特性特性：CopA和CopB基因l1.复制：负调控lRI质粒：repA基因表达复制lPSC101：正调控是由ori复制子向左单向复制l2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。PUC18PUC19l分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。Triton和PEG化学提取法lTriton和PEG处理法，此法简单，不用昂贵的氯化铯，不必长
15、时间的超速离心，费用较低，分离效果也很好，此法大体过程如下：l培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增离心沉淀菌体。在TE缓冲液中悬浮加入溶菌酶和去污剂Triton部分裂解菌体35000r/min离心除去菌体，留上清液上清液用酚处理除去蛋白质用乙醇初步沉淀DNA将DNA悬浮于TE缓冲液中加聚乙二醇（PEG6000），在4下过夜10000r/min离心15分钟DNA沉淀悬浮后再用乙醇沉淀将DNA沉淀悬浮即得到提纯的质粒DNA。煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNAl该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒DNA时常用的一种方法。将菌液移入1.5ml塑料管，离心去上清，先用Triton和新鲜配制的溶菌酶处理细胞，1
16、00加热60秒种裂解细菌细胞。将裂解液放置冰浴2分钟，离心5分钟，根据不同的复性特性，从而去除染色体DNA及细胞碎片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加入异丙醇，置于室温20-30分钟，离心取沉淀，70%乙醇洗两次，最后悬浮于TE，即为提纯的质粒DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿抽提步骤，使实验在2小时内完成。多功能质粒-PUC质粒l多功能质粒-PUC质粒是由pBR322改建成的带有LacZ基因的PUC质粒。LacZ上有多克隆位点，插入外源基因后在X-gal平板上使原先的蓝斑变成白斑。插入型载体l有单一酶切位点便于外源DNA插入的称为插入型载体。gt10gt11l若CI插入外源基因溶菌透
17、明噬斑l若不插入外源基因溶源混浊斑l若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑l若LacZ无插入基因IPTG/X-gal平板有蓝斑替换型载体替换型载体的基因组中具有成对的限制酶位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被插入的外源DNA片段所取代，亦称取代型载体。由于噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基氏(McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,或是在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoR片段被外源DNA所取代，那么形成的重组体噬菌体在上述的两种指示培养基中都只能产生出无色的噬菌斑。应用指示性培养基可对这种重组体方便
18、的筛选出来。如图3-15单链DNA噬菌体载体lM13单链DNA噬菌体为细线状DNA，呈单链环状包装在线状蛋白外壳中。载体有多聚接头，可进行LacZ插入失活白斑筛选。可应用于克隆基因，测序，基因突变的诱变技术。三、动物细胞基因克隆的载体lSV40病毒lSV40病毒载体(1)取代型重组病毒载体l晚期区段取代载体l早期区段取代载体(2)重组的病毒-质粒载体SV40病毒lSV40病毒呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。l受纳细胞（permissivecell）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒，产生CPE。l非受纳细胞（nonpermissivecell）：不产生感染性病毒
19、颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变。l基因结构。如图6-25早期表达区编码大T抗原和小t抗原（即肿瘤蛋白质或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因组的复制和调节。小t抗原的功能不详。晚期表达区合成Vp1、Vp2、Vp3，包装释放(1)取代型重组病毒载体l取代型的重组病毒载体（recombinantVirusVector）,其特点是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。(2)重组的病毒
20、-质粒载体l由大T抗原、复制子和pBR322构成pac10载体。在细菌中扩增提取基因重组质粒，转染小鼠细胞5-6天后可高拷贝扩增、进而高表达基因产物（如图6-30）。另外微型病毒复制子-质粒载体，可用特殊细胞来克隆和表达（如图6-31）。晚期区段取代载体lSV40晚期基因被外源DNA取代后，失去合成外壳蛋白功能，若加入一种温度敏感（ts）的辅助病毒tsA58（它是一种在41下便不能合成T抗原的突变体），与缺乏了整个晚期区段功能的SV40病毒，可以互补，这两种病毒混合感染时，仍然能够增殖。重组体病毒能提供此种T抗原，tsA58则可以复制，并合成出外壳蛋白质，这样就能在受纳细胞中扩增表达。如图6-26、6-27、6-28早期区段取代载体l这种载体被外源基因取代早期基因而缺失大T抗原，可由COS细胞提供大T抗原，故可利于重组病毒在COS细胞中增殖和扩增。l包装有限制，DNA全长48kb，包装外源基因限制全长105-75（即512823kb）包装限制范围为12-23kb。Theend