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1、高春生化药物常用分析方法第一页，本课件共有81页1.1.生化药物概念生化药物概念2.2.生化药物的分类生化药物的分类3.3.蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定4.4.电泳法电泳法5.酶的测定酶的测定第二页，本课件共有81页1生化药物的概念生化药物的概念v生生化化药药物物是是运运用用生生物物化化学学的的研研究究成成果果，把把生生物物体体产产生生的的各各种种基基本本物物质质用用于于预预防防、诊诊断断和和治治疗疗疾疾病病的的一一大大类类药药物物。包包括括从从动动物物、植植物物、微微生生物物等等生生物物体体中中提提取取分分离离的的天天然然物物质质及及部部分分化化学学合合成成产产物物。通通常常所所说说的的
2、生生化化药药物物是是专专指指在在生生物物体体内内起起重重要要生生理理作作用用的的生生命命基基本本物物质质。如如：氨氨基基酸酸、多多肽肽、蛋蛋白白质质、核核酸酸及及其其降降解解物物、酶酶与与辅辅酶酶、维维生生素、激素、糖与脂类等一大类药物。素、激素、糖与脂类等一大类药物。第三页，本课件共有81页2.生化药物的分类生化药物的分类v(1)按其来源分：生化药物按其来源按其来源分：生化药物按其来源不同可分为植物生化药物、动物生化不同可分为植物生化药物、动物生化药物、微生物生化药物及合成生化药药物、微生物生化药物及合成生化药物。物。v(2)按其化学性质及作用分：可分为氨按其化学性质及作用分：可分为氨基酸、
3、多肽、蛋白质、核酸及其降解物基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、激素、维生素、糖、脂、酶与辅酶、激素、维生素、糖、脂、有机酸等。有机酸等。第四页，本课件共有81页3.蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定v3.1氨基酸及蛋白质的显色反应氨基酸及蛋白质的显色反应v3.2凯氏定氮法凯氏定氮法v3.3福林福林-酚试剂法酚试剂法v3.4双缩脲法双缩脲法v3.5紫外吸收法紫外吸收法第五页，本课件共有81页v3.1氨基酸及蛋白质的显色反应氨基酸及蛋白质的显色反应v3.1.1茚三酮反应茚三酮反应 v3.1.2 双缩脲反应双缩脲反应 v3.1.3 与酚试剂的反应与酚试剂的反应第六页，本课件共有81页v3.
4、1.1茚茚三三酮酮反反应应：蛋蛋白白质质在在pH57之之间间，与与茚茚三三酮酮丙丙酮酮溶溶液液加加热热煮煮沸沸时时即即出出现现蓝蓝紫紫色色。此此反反应应用用于于蛋蛋白白质质的的定定性性与与定定量量。此此反反应应的的灵灵敏敏度度为为1g。凡凡具具有有氨氨基基、能能放放出出氨氨的的化化和和物物几几乎乎都都有有此此反反应应，故故可可用用于于多肽与蛋白质及氨基酸的定性与定量分析。多肽与蛋白质及氨基酸的定性与定量分析。第七页，本课件共有81页v3.1.2 双双缩缩脲脲反反应应：蛋蛋白白质质溶溶液液加加入入氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液后后，逐逐滴滴加加入入0.5%硫硫酸酸铜铜溶溶液液，则出现紫色或紫红色。则出
5、现紫色或紫红色。v原原理理 当当脲脲（尿尿素素）加加热热（约约180），两两分分子子脲脲缩缩合合，放放出出一一分分子子氨氨而而形形成成双双缩缩脲脲，然然后后在在碱碱性性溶溶液液中中与与铜铜离离子子结结合合生生成成复复杂杂的的紫紫红红色色化化合合物物。蛋蛋白白质质或或二二肽肽以以上上的的多多肽肽分分子子中中，含含有有多多个个与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似的的肽肽键键，因因此此也也有有双双缩缩脲脲反反应应。肽肽键键越越多多反反应颜色越深。氨基酸无此反应。应颜色越深。氨基酸无此反应。第八页，本课件共有81页v3.1.3 与与酚酚试试剂剂的的反反应应：蛋蛋白白质质分分子子中中的的酪酪氨氨酸酸、色色氨
6、氨酸酸 能能与与含含有有磷磷钨钨酸酸磷磷鉬鉬酸酸化化合合物物的的酚酚试试剂剂起起反反应应。在在碱碱性性条条件件下下后后者者被被还还原原成成蓝蓝色色物物质质。颜颜色色的的深深浅浅与与蛋蛋白白质质的的量量成成正正比比，所所以以可可作作为为蛋蛋白质的比色测定方法。白质的比色测定方法。第九页，本课件共有81页v3.2凯氏定氮法凯氏定氮法v3.2.1原理原理v3.2.2试剂和仪器试剂和仪器v3.2.3操作步骤操作步骤v3.2.4注意事项注意事项 第十页，本课件共有81页v3.2凯氏定氮法凯氏定氮法v3.2.1原理原理 每每一一种种蛋蛋白白质质都都有有其其恒恒定定的的含含氮氮量量一一般般为为1517.6%
7、，平平均均为为16，因因此此只只要要测测得得样样品品中中的的含含氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量。氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量。定定氮氮法法的的基基本本原原理理是是将将蛋蛋白白质质用用浓浓硫硫酸酸分分解解，并并使使其其中中的的氮氮变变成成铵铵盐盐状状态态，再再与与浓浓碱碱作作用用，放放出出的的氨氨被被酸酸吸吸收收，滴滴定定剩剩余余的的酸酸，计计算算出出含含氮氮量量。微微量量凯凯氏氏定定氮氮法法最最低低可可测测出出0.05毫毫克克氮氮，相当于相当于0.3毫克左右蛋白质。毫克左右蛋白质。蛋白质含量蛋白质含氮量蛋白质含量蛋白质含氮量100/16蛋白质含氮量蛋白质含氮量6.25第十
8、一页，本课件共有81页v3.2.2.试剂和仪器试剂和仪器v1微微量量定定氮氮仪仪器器装装置置全全套套：包包括括蒸蒸汽汽发发生生器器、冷冷凝凝蒸蒸汽汽收收集集器器、微量定氮蒸馏瓶、小型冷凝管。微量定氮蒸馏瓶、小型冷凝管。v2消化炉（电炉）消化炉（电炉）v3浓硫酸浓硫酸v4.氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（40%）v5消消化化剂剂：硫硫酸酸铜铜及及硫硫酸酸钾钾按按1:4（w/w）至至1：5比比例例，研研细细充分混匀。充分混匀。v6标准标准0.010N盐酸和盐酸和0.010N氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液。v7指示剂指示剂0.1%甲基红乙醇溶液。甲基红乙醇溶液。v82硼酸吸收液硼酸吸收液第十二页，本课件共有
9、81页3.2.3凯氏定氮凯氏定氮法一般步骤 消化消化蒸馏蒸馏滴定滴定返回第十三页，本课件共有81页v3.2.4.注意事项注意事项v1必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。v2消消化化初初期期瓶瓶内内物物质质碳碳化化变变黑黑，并并产产生生泡泡沫沫，要要特特别别注注意意控控制制火火力力，微微火火加加热热，不不能能让让黑黑色色物物质质上上升升到到颈颈部部，否否则则将将严严重重影影响响样样品品的的测测定定结结果果。当当混混合合液液停停止止冒冒泡泡，气气体体逸逸出出也也较较均均匀匀时时，可可适适当当加加大大火火焰焰，使使瓶瓶内内液液体体微微沸沸而
10、而不不致致跳跳荡荡。硫硫酸酸溶溶液液逐逐步步从从棕棕黑黑色色变变成成澄澄清清。由由于于消消化化液液澄澄清清并并不不说说明明消消化化一一定定完完成成，为为保保证证反反应应充充分分完完成成，继继续续沸沸腾腾1小小时时。反反应应终终了了，溶溶液液应应呈呈淡淡蓝蓝色色或或无无色色透透明明，若若带带有有黄黄色色表表示示消消化化末末完完全全。如如果果蛋蛋白白质质样样品品中中含含赖赖氨氨酸酸或或组组氨氨酸酸较较多多，则则消消化化时间要延长时间要延长1-2倍。倍。第十四页，本课件共有81页v3消消化化完完毕毕，静静置置使使冷冷，仔仔细细加加入入少少量量蒸蒸馏馏水水，洗洗涤涤管管壁壁。因因实实验验室室中中空空气
11、气往往往往含含有有极极微微量量的的氨氨，每每次次分分析析时时都都要要另另做做空空白白对对照照，即即一一切处理与样品管相同，但不加蛋白质样品。切处理与样品管相同，但不加蛋白质样品。v4蒸馏前要先蒸洗蒸馏前要先蒸洗15分钟以上。分钟以上。v5小小心心加加样样，避避免免样样品品污污染染凯凯氏氏瓶瓶口口部部和和颈颈部。部。第十五页，本课件共有81页v6使使用用凯凯氏氏定定氮氮仪仪时时，开开关关甲甲、乙乙的的掌掌握握与与实实验验成成败败很很有有关关系系，在在加加样样时时，开开关关甲甲一一定定要要开开启启着着，而而且且一一定定要要使使蒸蒸汽汽发发生生后后才才能能关关闭闭，否否则则会会发发生生样样品品倒倒吸
12、吸现现象象。开开关关乙乙也也要要关关闭闭及及时，防止氨逸出。时，防止氨逸出。v7蒸蒸馏馏时时，保保持持火火力力稳稳定定，否否则则易易发发生生倒倒吸吸现象。现象。第十六页，本课件共有81页v8氨氨气气蒸蒸馏馏时时，为为了了使使所所有有硫硫酸酸铵铵分分解解为为氨氨，必必须须加加入入足足量量40%氢氢氧氧化化钠钠，加加入入时时要要水水平平缓缓慢慢，以以免免产产生生剧剧烈烈反反应应而而导导致致瓶瓶内内酸酸液液倒倒吸吸和和氨氨的的损损失失，碱碱加加入入后后，有有铜铜氨氨离离子子、氢氢氧氧化化铜铜或或氧氧化化铜铜等等化化合合物物生生成成，溶溶液液呈呈蓝蓝色色或或褐褐色色。并并有有胶胶状状沉沉淀淀产产生生，
13、这这是是正正常常现现象象，反反之之，如如果果不不变变，说说明明碱碱液可能不够。液可能不够。第十七页，本课件共有81页v9如如果果测测定定的的不不是是纯纯蛋蛋白白质质，可可能能含含有有非非蛋蛋白白氮氮，必必须须分分别别测测定定蛋蛋白白氮氮和和非非蛋蛋白白氮氮。非非蛋蛋白白氮氮的的测测定定可可以以将将样样品品制制成成均均浆浆或或抽抽提提液液，用用三三氯氯醋醋酸酸或或钨钨酸酸等等沉沉淀淀剂剂将将蛋蛋白白质质沉沉淀淀出出来来，按按总总氮氮法法测测定定上上清清液液的的含含氮氮量，便得到非蛋白质氮。量，便得到非蛋白质氮。第十八页，本课件共有81页v3.3福林福林-酚试剂法酚试剂法v3.3.1原理原理v3.
14、3.2试剂试剂v3.3.3操作步骤操作步骤v3.3.4 3.3.4 注意事项注意事项第十九页，本课件共有81页v3.3福林福林-酚试剂法酚试剂法v3.3.1.原理：原理：v福福林林-酚酚试试剂剂法法是是测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度应应用用最最广广泛泛的一种方法。的一种方法。v福福林林-酚酚试试剂剂（Folin-phenolreagent）的的显显色色原原理理包包括括两两步步反反应应：第第一一步步是是在在碱碱性性条条件件下下蛋蛋白白质质与与铜铜作作用用生生成成蛋蛋白白质质铜铜复复合合物物；第第二二步步是是蛋蛋白白质质铜铜复复合合物物还还原原磷磷鉬鉬酸酸磷磷钨钨酸酸试试剂剂，生生成成蓝蓝色色物物质
15、质。在在一一定定条条件件下下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。蓝色强度与蛋白质的量成正比例。第二十页，本课件共有81页本本法法的的优优点点是是操操作作简简便便，灵灵敏敏度度高高。缺缺点点是是有有蛋蛋白白质质特特异异性性的的影影响响，即即不不同同蛋蛋白白质质的的显显色色强强度度稍稍有有不不同同；标标准准曲曲线线也也不不是是严严格格的的直直线形式。线形式。v本法的可测定范围是每毫升本法的可测定范围是每毫升25-250微克蛋白微克蛋白质。质。第二十一页，本课件共有81页v3.3.2.试剂试剂v试试 剂剂 A：（1）4 碳碳 酸酸 钠钠 溶溶 液液；（2）0.2mol/L氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液；（3）
16、1硫硫酸酸铜铜溶溶液液（4）2酒酒石石酸酸钾钾钠钠溶溶液液（或或其其钾钾盐盐或或钠钠盐盐）。临临用用前前将将（1）与与（2）等等体体积积混混合合，（3）与与（4）等等体体积积混混合合，然然后后这这两两种种试试剂剂按按50：1的的比比例例混混合合，即即成福林酚试剂成福林酚试剂A。第二十二页，本课件共有81页v试试剂剂B：在在1.5升升容容积积的的磨磨口口流流瓶瓶中中加加入入100克克钨钨酸酸钠钠，25克克钼钼酸酸钠钠及及700毫毫升升蒸蒸馏馏水水，再再加加50毫毫升升85%磷磷酸酸，100毫毫升升浓浓盐盐酸酸充充分分混混和和，接接上上回回流流冷冷凝凝管管小小火火流流10小小时时。回回流流结结束束
17、后后，加加入入150克克硫硫酸酸锂锂，50毫毫升升蒸蒸馏馏水水及及数数滴滴液液体体溴溴，开开口口继继续续沸沸腾腾15分分钟钟以以便便驱驱除除过过量量的的溴溴，冷冷却却后后溶溶液液呈呈黄黄色色，（如如仍仍呈呈绿绿色色，左左须须再再重重复复滴滴加加液液体体溴溴的的步步骤骤）稀稀至至1升升，过过滤滤，过过滤滤置置于于棕棕色色试试剂剂瓶瓶中中保保存存。使使用用时时用用标标准准氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定，以以酚酚酞酞为为指指示示剂剂，然然后后适适当当稀稀释释（约约加加水水1倍倍）使使最最终终的的酸酸浓度为浓度为1mol/L。第二十三页，本课件共有81页v3.3.3操作步骤操作步骤v（1）1ml待待测测样样
18、品品溶溶液液（适适当当稀稀至至约约含含25-250微微克克蛋蛋白白质质），加加5ml试试剂剂A混混合合，室室温温下下放放置置10分分钟钟后后加加0.5ml试试剂剂B，立立即即混混和和均均匀匀，30分分钟钟后后，以以不不含含蛋蛋白白质质试试剂剂空空白白对对照照比色。可选用波长比色。可选用波长650nm或或660nm。第二十四页，本课件共有81页v（2）标准曲线制备：）标准曲线制备：v在在各各试试管管中中分分别别加加牛牛血血清清白白蛋蛋白白溶溶液液（250微微克克/毫毫升升）0、0.2、0.4、0.6、0.8和和1.0毫毫升升，并并分分别别加加蒸蒸馏馏水水补补充充到到1毫毫升升（即即各各管管中中分
19、分别别含含蛋蛋白白质质量量0、50、100、150、200和和250微微克克）。以以后后加加试试剂剂及及比比色色等等操操作作步步骤骤与与样样品品操操作作相相同。同。第二十五页，本课件共有81页v3.3.4.3.3.4.注意事项注意事项v(1)(1)牛血清白蛋白的含量明确。牛血清白蛋白的含量明确。v(2)(2)福林酚试剂福林酚试剂B B在酸性条件下比较稳定，在酸性条件下比较稳定，而福林酚试剂而福林酚试剂A A在碱性条件下与蛋白质作在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。所以加入用生成碱性的铜蛋白质溶液。所以加入福林酚试剂福林酚试剂B B这一步混和速度要快，使还这一步混和速度要快，使还原反
20、应产生在磷鉬酸磷钨酸试剂被破坏原反应产生在磷鉬酸磷钨酸试剂被破坏之前，否则会使显色程度减弱之前，否则会使显色程度减弱。v(3)反应时间及反应温度严格控制。反应时间及反应温度严格控制。v(4)按照化学实验的要求精密操作。按照化学实验的要求精密操作。第二十六页，本课件共有81页v3.4双缩脲法双缩脲法v3.4.1原理原理v3.4.2试剂试剂v3.4.3操作步骤操作步骤v3.4.4 3.4.4 注意事项注意事项第二十七页，本课件共有81页v3.4.双缩脲法双缩脲法v3.4.1原理原理v双双缩缩脲脲（NH2CONHCONH2）是是两两分分子子脲脲经经180左左右右加加热热，放放出出一一分分子子氨氨后后
21、所所得得到到的的产产物物。在在强强碱碱性性溶溶液液中中，双双缩缩脲脲与与CuSO4形形成成紫紫色色，称称为为双双缩缩脲脲反反应应。凡凡具具有有两两个个酰酰胺胺基基或或两两个个直直接接连连接接的的肽肽键键，或或通通过过一一个个中中间间碳碳原原子子相相连连的的肽肽键键，这这类类化化合物都有双缩脲反应。合物都有双缩脲反应。第二十八页，本课件共有81页v双双缩缩脲脲法法是是测测定定蛋蛋白白质质浓浓度度常常用用方方法法之之一一，它它除除了了操操作作简简便便、迅迅速速外外，最最大大的的优优点点是是受受蛋蛋白白质质的的特特异异性性影影响响较较小小，但但灵灵敏敏度度差差，所所需需样样品品量量大大。利利用用铜铜
22、复复合合物物有有紫紫外外吸吸收收的的特特性性，使使双双缩脲方法能在数十微克水平进行测定。缩脲方法能在数十微克水平进行测定。第二十九页，本课件共有81页v3.4.2试剂试剂v碱碱性性铜铜试试剂剂0.175克克硫硫酸酸铜铜溶溶解解于于约约15毫毫升升水水中中，置置于于一一100毫毫升升容容量量瓶瓶中中，加加入入30毫毫升升浓浓氨氨水水，30毫毫升升冷冷的的蒸蒸馏馏水水及及20毫毫升升饱饱和和氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液，混混匀匀后后，放放置置至至使使溶溶液液温温度度与与室室温温相相同同，以以蒸蒸馏馏水水稀稀释释至至刻刻度度，摇摇匀匀。此此试试剂剂在在室室温温下下可可以以放放置置3-4个个月月不不影影响
23、显色。响显色。第三十页，本课件共有81页v3.4.3操作步骤操作步骤v(1)标标准准曲曲线线制制备备每每组组取取7支支试试管管，依依次次加加入入蛋蛋白白质质标标准准溶溶液液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，分分别别补补足足蒸蒸馏馏水水至至3毫毫升升，混混匀匀后后各各管管加加2毫毫升升碱碱性性铜铜试试剂剂，充充分分混混和和后后，呈呈现现紫紫色色，立立即即于于540nm下下测测定定光光吸吸收收（以以第第一一管管作作空空白白对对照照）。v(2)供供试试品品测测定定取取3毫毫升升样样品品溶溶液液，加加入入碱碱性性铜铜试试剂剂2毫毫升升，充充分分混混匀匀后后，于于540nm下下测测
24、定定吸吸收收值，操作条件同标准曲线。值，操作条件同标准曲线。第三十一页，本课件共有81页v3.4.4.3.4.4.注意事项注意事项v样品溶液与试剂混合后，有时约样品溶液与试剂混合后，有时约30分钟后有雾分钟后有雾状沉淀状沉淀产生。这种现象对含脂肪类物质的蛋产生。这种现象对含脂肪类物质的蛋白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质溶液白质抽提液较易发生，而对于纯蛋白质溶液不明显。克服的方法有三种：（不明显。克服的方法有三种：（1）加入试剂）加入试剂后立即比色，至少应在后立即比色，至少应在30分钟内完成；（分钟内完成；（2）如沉淀已经产生，则可以放置二小时或更多）如沉淀已经产生，则可以放置二小时或更多时间
25、，离心去沉淀后取上清液比色；（时间，离心去沉淀后取上清液比色；（3）加）加1.5毫升乙醇或石油醚，离心后比色。毫升乙醇或石油醚，离心后比色。第三十二页，本课件共有81页v3.5紫外吸收法紫外吸收法v原理原理蛋蛋白白质质分分子子中中所所含含有有的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸残残基基使使蛋蛋白白质质在在280nm下下具具有有最最大大吸吸收收值值；蛋蛋白白质质溶溶液液在在238nm下下的的光光吸吸收收值值，其其吸吸收收强强度度与与肽肽键键量量成成正正比比。利利用用在在一一定定波波长长范范围围内内吸吸收收值值与与蛋蛋白白质质浓浓度度成成正正比比关关系系可可以以进进行行蛋蛋白白质质含含量量的的测测定。
26、定。第三十三页，本课件共有81页4.电泳分析法电泳分析法v4.1电泳的基本概念电泳的基本概念v4.2电泳的分类电泳的分类v4.3醋酸纤维膜电泳法醋酸纤维膜电泳法v4.4SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第三十四页，本课件共有81页v4.1电泳的基本概念电泳的基本概念v电电泳泳：带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下向向着着与与其其电电 性相反的电极移动，称为电泳。性相反的电极移动，称为电泳。第三十五页，本课件共有81页v4.2.电泳的分类电泳的分类v按按分分离离原原理理分分类类可可分分为为区区带带电电泳泳、移移界界电电泳、等速电泳和聚焦电泳泳、等速电泳和聚焦电泳4种。种。v（1）区
27、区带带电电泳泳电电泳泳过过程程中中，不不同同的的离离子子成成分分在在均均一一的的缓缓冲冲液液体体系系中中分分离离成成独独立立的的区区带带，这是当前应用最广泛的电泳技术。这是当前应用最广泛的电泳技术。v（2）移移界界电电泳泳是是在在U形形管管中中进进行行的的，由由于于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。第三十六页，本课件共有81页v（3）等等速速电电泳泳需需专专用用电电泳泳仪仪，当当电电泳泳达达到到平平衡衡后后，各各区区带带相相随随分分成成清清晰晰的的界界面面，并并以以等等速速移动。移动。v（4）等等电电聚聚焦焦电电泳泳由由于于具具有有不不同同等等电电点点
28、的的两两性性电电解解质质载载体体在在电电场场中中，自自动动形形成成pH梯梯度度，使使被被分分离离物物移移动动至至各各自自等等电电点点的的pH处处聚聚集集成成很很窄窄的的区区带带，且且分分辨辨率率较较高高。从从表表面面上上看看与与区区带带电泳相似，但原理不同。电泳相似，但原理不同。第三十七页，本课件共有81页v4.3.醋酸纤维膜电泳法醋酸纤维膜电泳法v4.3.1基基本本概概念念什什么么是是醋醋酸酸纤纤维维膜膜电电泳泳以以醋醋酸酸纤纤维膜为支持介质的一种区带电泳技术。维膜为支持介质的一种区带电泳技术。v4.3.2原原理理蛋蛋白白质质是是两两性性物物质质，具具有有两两性性游游离离特特性性。人人血血白
29、白蛋蛋白白为为一一种种蛋蛋白白质质，因因而而其其具具有有两两性性化化合合物物的的性性质质，在在碱碱性性缓缓冲冲液液中中，即即pH质质大大于于等等电电点点时时，蛋蛋白白质质分分子子带带负负电电荷荷，在在电电场场中中向向正正极极迁迁移移，如如果果人人血血白白蛋蛋白白中中含含有有其其他他杂杂蛋蛋白白，其其带带电电荷荷的的量量会会不不同同于于人人血血白白蛋蛋白白，在在电电场场中中迁迁移移的的速速度度就就不不同同，带带负负电电荷荷越越多多的的蛋蛋白白质质其其迁迁移移速速度度越越快快。这这样样就就会会在在醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜留留下下不不同同的的区区带带，经经染染色色后后，脱脱色色，扫扫描描后后，即即可
30、可测测得得人人血血白白蛋蛋白白的纯度。的纯度。第三十八页，本课件共有81页v4.3.3特点：微量，快速，简便，分辨力高，对样特点：微量，快速，简便，分辨力高，对样品无拖尾及吸附现象等。目前，国内有醋酸纤维薄品无拖尾及吸附现象等。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的醋酸纤维薄膜主要在膜商品出售，不同厂家生产的醋酸纤维薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致，一般多采用浙江黄岩化工厂但分离效果基本一致，一般多采用浙江黄岩化工厂生产的醋酸纤维薄膜。生产的醋酸纤维薄膜。第三十九页，本课件共有81页v4.3.4酸纤维
31、薄膜与滤纸比较酸纤维薄膜与滤纸比较v酸纤维薄膜与滤纸比较有以下优点酸纤维薄膜与滤纸比较有以下优点v（1）酸酸纤纤维维薄薄膜膜对对蛋蛋白白质质样样品品吸吸收收极极少少，无无“拖拖尾尾”现现象象，染染色色后后背背景景能能完完全全脱脱色色，各各种种蛋蛋白白质质染染色色带带分离清晰，因而提高了定量的精确性。分离清晰，因而提高了定量的精确性。v（2）快快速速省省时时,由由于于醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜亲亲水水性性较较滤滤纸纸小小，薄薄膜膜中中所所容容纳纳的的缓缓冲冲液液也也较较小小，电电渗渗作作用用小小，电电泳泳时时大大部部分分电电流流是是由由样样品品传传导导的的，所所以以分分离离速速度度快快，电电泳泳时
32、时间间短短，一一般般电电泳泳45-60分分钟钟即即可可，加加上上染色，脱色，整个电泳完成仅需染色，脱色，整个电泳完成仅需90分钟左右。分钟左右。第四十页，本课件共有81页v（3）灵灵敏敏度度高高，样样品品用用量量少少。血血清清蛋蛋白白电电泳泳仅仅需需2l血血清清，甚甚至至加加样样体体积积少少至至0.1l，临临床床医医学学检检验验利利用用这这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。v（4）应应用用面面广广。某某些些蛋蛋白白在在纸纸上上电电泳泳不不易易分分离离，如如，胎胎儿儿甲甲种种球球蛋蛋白白，溶溶菌菌酶酶，胰胰岛岛素素，组组蛋蛋白白等等用用醋醋酸
33、纤维薄膜电泳能较好地分离。酸纤维薄膜电泳能较好地分离。v（5）醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳染染色色后后，经经冰冰醋醋酸酸，乙乙醇醇混混合合或或其其他他溶溶液液浸浸泡泡后后制制成成干干板板，有有利利于于扫扫描描定定量量及及长长期保存。期保存。第四十一页，本课件共有81页由由于于醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳操操作作简简单单，快快速速，价价廉廉。目目前前已已广广泛泛用用于于分分析析检检测测血血浆浆蛋蛋白白，脂脂蛋蛋白白，糖糖蛋蛋白白，胎胎儿儿甲甲种种球球蛋蛋白白，体体液液，脊脊髓髓液液，脱脱氢氢酶酶，多多肽肽，核核酸酸及及其其他他生生物物大大分分子子，为为心心血血管管疾疾病病，肝肝硬硬化化及
34、及某某些些癌癌症症鉴鉴别别诊诊断断提提供供了了可可靠靠的的依依据据，因因而而已已成成为为医医学学和和临临床床检检验验的的常常规规技术。技术。第四十二页，本课件共有81页4.3.5酸纤维薄膜电泳酸纤维薄膜电泳操作步骤操作步骤仪器与薄膜的准备仪器与薄膜的准备点样点样电泳电泳染色与漂洗染色与漂洗透明透明返回第四十三页，本课件共有81页v4.3.6注意事项注意事项v1、醋酸纤维素薄膜的预处理、醋酸纤维素薄膜的预处理v2、缓冲液的选择、缓冲液的选择v3、加样量、加样量v4、电量的选择、电量的选择v5、染色液的选择、染色液的选择v6、透明及保存、透明及保存第四十四页，本课件共有81页v4.4SDS-聚丙烯
35、酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳v4.4.1原原理理以以纸纸，醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜，琼琼脂脂（糖糖）及及均均一一聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶为为支支持持物物的的电电泳泳，由由于于各各种种蛋蛋白白质质所所带带的的电电荷荷，分分子子量量大大小小和和形形状状不不同同而而有有不不同同的的迁迁移移率率。为为消消除除净净电电荷荷对对迁迁移移率率的的影影响响，可可采采用用聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺浓浓度度剃剃度度电电泳泳，利利用用它它所所形形成成孔孔径径不不同同引引起起的的分分子子筛筛效效应应，可可将将蛋蛋白白质质分分子子分分开开。也也可可在在整整个个电电泳泳体体系系中中加加入入十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠
36、（SDS），则则电电泳泳迁迁移移率率主主要要依依赖赖于于分分子子量量，而而与与所所带带净净电电荷荷和和形形状状无无关关。这这种种电电泳方法为泳方法为SDS-PAGE。第四十五页，本课件共有81页v4.4.2用用SDS-PAGE测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量的的原原理理vSDS是阴离子去污剂，它在水溶液中，以单是阴离子去污剂，它在水溶液中，以单体和分子团混合物的形式存在，蛋白质在巯体和分子团混合物的形式存在，蛋白质在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的结合形成带大量负电荷的SDS-蛋白质复蛋白质复合物，由于合物，由于SDS带有大
37、量的负电荷，当其与带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所蛋白质结合时，所第四十六页，本课件共有81页带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负带的负电荷大大超过了天然蛋白质原由的负电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间电荷，因而消除和掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。测定未知蛋白质分子量时，可选用相应的一测定未知蛋白质分子量时，可选用相应的一组标准蛋白质，同时进行组标准蛋白质，同时进行SDS-PAGE，则可，则可根据已知蛋白质的电泳迁移率和分子量的对根据
38、已知蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳数作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。迁移率求得分子量。第四十七页，本课件共有81页v优优点点用用此此法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量具具有有仪仪器器设设备备简简单单，操操作作方方便便，样样品品用用量量少少，耗耗时时少少（仅仅需需一一天天），分分辨辨率率高高，重重复复效效果果好好等等优优点点，因因而而得得到到非非常常广广泛泛的的应应用用与与发发展展。它它不不仅仅用用于于蛋蛋白白质质分分子子量量的的测测定定，还还可可用用于于蛋蛋白白混混合合组组分分的的分分离离和和亚亚组组分分的的分分析析，当当蛋蛋白白质
39、质经经SDS-PAGE分分离离后后，设设法法将将各各种种蛋蛋白白质质从从凝凝胶胶上上洗洗脱脱下下来来，除除去去SDS，还还可可进进行行氨氨基基酸酸顺顺序序，酶酶解解图图谱谱及及抗抗还还原原性性质质等等方方面面的的研研究。究。第四十八页，本课件共有81页v缺点缺点在蛋白质所带电荷异常或构象异常时，在蛋白质所带电荷异常或构象异常时，带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的分子量不太可靠。如组蛋白蛋白等测出的分子量不太可靠。如组蛋白F1，本身带有大量的正电荷，虽然结合了正常量的本身带有大量的正电荷，虽然结合了正常量的SDS，仍不能完全掩盖其原由正电
40、荷，故用，仍不能完全掩盖其原由正电荷，故用SDS-PAGE测得的分子量为测得的分子量为35000，而用其他，而用其他方法测定的分子量为方法测定的分子量为21000。因此要确定某种。因此要确定某种蛋白质的分子量时，最好用蛋白质的分子量时，最好用2种测定方法相互种测定方法相互验证，则更可靠。尤其是对一些由亚基或验证，则更可靠。尤其是对一些由亚基或2条条以上肽链组成的蛋白质，由于以上肽链组成的蛋白质，由于第四十九页，本课件共有81页SDS巯巯基基乙乙醇醇的的作作用用，肽肽链链间间的的二二硫硫键键被被打打开开，解解理理成成亚亚基基或或单单个个肽肽链链，因因此此测测定定结结果果只只是是亚亚基基或或单单条
41、条肽肽链链的的分分子子量量，还还需需用其他方法测定其分子量中肽链的数目。用其他方法测定其分子量中肽链的数目。第五十页，本课件共有81页4.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤操作步骤安装夹心式垂直板电泳槽安装夹心式垂直板电泳槽配胶及凝胶板的制备配胶及凝胶板的制备分离胶和浓缩胶的制备分离胶和浓缩胶的制备样品的处理与加样样品的处理与加样电泳电泳返回第五十一页，本课件共有81页v4.4.4注意事项注意事项v1.SDS的纯度的纯度v2.SDS与蛋白质的结合量与蛋白质的结合量v3.凝胶浓度凝胶浓度v4.对样品的要求对样品的要求v5.凝胶成像凝胶成像第五十二页，本课件共有81页5.酶
42、的测定酶的测定v5.1酶的概念：酶的概念：v5.2酶的特点：酶的特点：v5.3酶的专一性：酶的专一性：v5.4酶的分类与命名酶的分类与命名v5.5酶的化学组成酶的化学组成v5.6酶促反应的影响因素酶促反应的影响因素v5.7酶活力的测定方法酶活力的测定方法第五十三页，本课件共有81页v5.1酶的概念酶的概念v酶酶是是生生物物体体内内一一类类具具有有催催化化活活性性和和特特定定空空间间构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。构象的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。第五十四页，本课件共有81页v5.2酶的特点酶的特点v5.2.1酶酶作作用用一一般般都都要要求求比比较较温温和和的的条条件件，如如常温，常压
43、，接近中性的酸碱度等。常温，常压，接近中性的酸碱度等。v5.2.2酶酶的的催催化化效效应应非非常常高高酶酶促促反反应应比比相相应应的非酶促反应要快的非酶促反应要快1031017倍。倍。v5.2.3酶酶具具有有高高度度的的专专一一性性酶酶对对所所作作用用的的物物质（称为底物）有严格的选择性，质（称为底物）有严格的选择性，第五十五页，本课件共有81页v通常一种酶只能作用于某一类或某一种特定通常一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质，这也说明酶对底物的化学结构有高的物质，这也说明酶对底物的化学结构有高度严格要求。度严格要求。v5.2.4酶的催化活性是受到调节和控制的。他酶的催化活性是受到调节和控制
44、的。他的调控方式很多，包括反馈调节、抑制剂调节、的调控方式很多，包括反馈调节、抑制剂调节、共价修饰调节、酶原激活及激素控制等。共价修饰调节、酶原激活及激素控制等。v5.2.5酶可催化某些特异的化学反应，体内某酶可催化某些特异的化学反应，体内某些物质的合成只能由酶促反应完成。如某些些物质的合成只能由酶促反应完成。如某些蛋白质、多肽、核酸以及其他一些生物活性蛋白质、多肽、核酸以及其他一些生物活性物质的合成都要通过酶促反应进行。物质的合成都要通过酶促反应进行。第五十六页，本课件共有81页v5.3酶作用的专一性酶作用的专一性v一一种种酶酶只只作作用用于于一一类类化化合合物物或或一一定定的的化化学学键键
45、，以以促促进进一一定定的的化化学学变变化化，生生成成一一定定的的产产物物。受受酶酶催催化化的的化化合合物物称称为为该该酶酶的的底底物物或或作作用物。酶对底物的专一性通常分为以下几种。用物。酶对底物的专一性通常分为以下几种。v5.3.1立立体体化化学学专专一一性性是是从从底底物物的的立立体体化化学学性性质质来来考考虑虑的的一一种种专专一一性性。可可分分为为两两类类（1）立立体异构专一性（体异构专一性（2）几何异构专一性。）几何异构专一性。第五十七页，本课件共有81页v5.3.2非非立立体体异异构构专专一一性性如如果果一一种种酶酶不不具具有有立立体体化化学学专专一一性性，则则可可从从底底物物的的化
46、化学学键键及及组组成成该该键键的的基基团团来来考考虑虑其其专专一一性性。如如以以A-B为为底底物物，可可认认为为它它是是由由三三部部分分组组成成，即即A、B与与连连接接它它们们的的键键。非非立立体体化化学学专专一一性性可可依依据据酶酶对对这这三三种种组组成成部部分分选选择择程程度度的的不不同同分分为为三三类类（1）键键专专一一性性（2）基基团团专专一性一性（3）绝对专一性）绝对专一性。第五十八页，本课件共有81页v5.4酶的分类与命名酶的分类与命名v5.4.1酶酶的的分分类类依依据据国国际际酶酶学学委委员员会会的的规规定定，按催化反应的类型可分为六大类。按催化反应的类型可分为六大类。v（1）氧
47、化还原酶类）氧化还原酶类催化氧化还原反应。催化氧化还原反应。v（2）转移酶类）转移酶类催化功能基团的转移。催化功能基团的转移。v（3）水解酶类）水解酶类催化水解的反应催化水解的反应v（4）裂裂合合酶酶类类催催化化水水、氨氨或或二二氧氧化化碳碳的的去去除或加入。除或加入。v（5）异构酶类）异构酶类催化各种类型的异构作用。催化各种类型的异构作用。v（6）合成酶类）合成酶类催化消耗催化消耗ATP的成键反应的成键反应 第五十九页，本课件共有81页v5.5酶的化学组成酶的化学组成v酶酶和和其其他他蛋蛋白白质质一一样样，根根据据其其组组成成成成分分可可分分为简单蛋白酶和结合蛋白酶两种。为简单蛋白酶和结合蛋
48、白酶两种。v单单纯纯酶酶酶酶的的活活性性仅仅仅仅决决定定于于它它的的蛋蛋白白质质结结构构，如如水水解解酶酶类类（淀淀粉粉酶酶、蛋蛋白白酶酶、脂脂肪肪酶酶、纤纤维维素素酶酶及及尿尿酶酶等等），这这些些酶酶的的结结构构由由简简单单蛋蛋白质构成，故称为单纯酶。白质构成，故称为单纯酶。第六十页，本课件共有81页v结结合合酶酶其其结结构构中中蛋蛋白白质质分分子子外外，还还含含有有非非蛋蛋白白质质部部分分，如如大大多多数数氧氧化化还还原原酶酶类类，这这些些酶酶由由结结合合蛋蛋白白质质构构成成，因因而而称称为为结结合合酶酶。在在结结合合酶酶中中，蛋蛋白白质质部部分分称称为为酶酶蛋蛋白白，非非蛋蛋白白质质部部
49、分分统统称称为为辅辅因因子子。辅辅因因子子又又可可分分成成辅辅酶酶和和辅辅基基两两类类。酶酶蛋蛋白白与与辅辅因因子子结结合合成成的的完完整整分分子子成成为为全全酶酶，即即全全酶酶=酶酶蛋蛋白白+辅辅因因子子（辅辅酶酶或或辅辅基基）。只只有有全全酶酶才才有有催催化化活活性性，将将酶酶蛋蛋白白与与辅辅因因子子分分开开后后均无催化作用。均无催化作用。第六十一页，本课件共有81页v根据蛋白的特点和分子大小又把酶分成三类根据蛋白的特点和分子大小又把酶分成三类v（1）单体酶单体酶只有一条多肽链只有一条多肽链v（2）寡寡聚聚酶酶由由几几条条至至几几十十条条多多肽肽链链亚亚基基组组成。成。v（3）多多酶酶体体
50、系系是是由由几几种种酶酶彼彼此此嵌嵌合合形形成成的的复合体。他有利于一系列反应的连续进行。复合体。他有利于一系列反应的连续进行。第六十二页，本课件共有81页v5.6酶促反应的影响因素酶促反应的影响因素v5.6.1底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响v5.6.2pH的影响与最适的影响与最适pHv5.6.3温度的影响与最适温度温度的影响与最适温度v5.6.4酶浓度的影响酶浓度的影响v5.6.5激活剂的影响激活剂的影响v5.6.6抑制剂的影响抑制剂的影响v5.6.7酶活力的测定方法酶活力的测定方法第六十三页，本课件共有81页5.6.1底物浓度对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影