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1、会计学1理化检测食用菌粗蛋白杂质理化检测食用菌粗蛋白杂质(zzh)介绍介绍第一页，共58页。（1）滴定必须在沸腾条件(tiojin)下进行不能把锥形瓶从热源上取下来滴定可以加快还原糖与的反应速度；保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝被氧化而增加耗糖量。（2）不能随意摇动锥形瓶 以免空气进入反应液中，使亚甲基蓝被氧化第1页/共58页第二页，共58页。项目三项目三 产品产品(chnpn)(chnpn)理化指标检测理化指标检测模块六模块六 食用菌产品其他理化食用菌产品其他理化(lhu)(lhu)指标检测技指标检测技术术灰份灰份总糖总糖VC检测技术检测技术(jsh)粗蛋白粗蛋白杂质杂质第2页/共
2、58页第三页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 n n简便简便简便简便/须脱色、干扰须脱色、干扰须脱色、干扰须脱色、干扰(gnro)(gnro)(gnro)(gnro)多（深色、其他还原性多（深色、其他还原性多（深色、其他还原性多（深色、其他还原性物质）物质）物质）物质）n n二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法 深色深色深色深色n n荧光法：准确度高，较复杂荧光法：准确度高，较复杂荧光法：准确度高，较复杂荧光法：准确度高，较复杂n
3、n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法还原型VC的测定(cdng)总VC的测定(cdng)总VC=氧化型VC+还原型VC+二酮古乐糖酸少氧化+还原+二酮古乐糖酸操作复杂，结果易受影响氧化型+还原型第3页/共58页第四页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n1 1 1 1、原理、原理、原理、原理n n VC VC VC VC的提取的提取的提取的提取:用草酸用草酸用草酸用草酸/偏磷酸（不常用偏磷酸（不常用偏磷酸（不常用偏磷酸（不常用,需
4、要在合适的需要在合适的需要在合适的需要在合适的PHPHPHPH下进行提取下进行提取下进行提取下进行提取)将样品中的将样品中的将样品中的将样品中的VCVCVCVC提取出来提取出来提取出来提取出来 n n用蓝色的碱性染料标准溶液用蓝色的碱性染料标准溶液用蓝色的碱性染料标准溶液用蓝色的碱性染料标准溶液(2,6(2,6(2,6(2,6二氯靛酚标准溶液二氯靛酚标准溶液二氯靛酚标准溶液二氯靛酚标准溶液),),),),对提取液进行氧化还原滴定对提取液进行氧化还原滴定对提取液进行氧化还原滴定对提取液进行氧化还原滴定n n根据消耗的染料的量可计算出样品中还原型根据消耗的染料的量可计算出样品中还原型根据消耗的染料
5、的量可计算出样品中还原型根据消耗的染料的量可计算出样品中还原型VCVCVCVC的含量的含量的含量的含量n n终点指示原理终点指示原理终点指示原理终点指示原理:染料被还原为无色染料被还原为无色染料被还原为无色染料被还原为无色,当到达滴定终点时当到达滴定终点时当到达滴定终点时当到达滴定终点时,多多多多余的染料在酸性介质中则表现余的染料在酸性介质中则表现余的染料在酸性介质中则表现余的染料在酸性介质中则表现(bioxin)(bioxin)(bioxin)(bioxin)为浅红色为浅红色为浅红色为浅红色,2,6二氯靛酚碱性酸性蓝色红色第4页/共58页第五页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技
6、术检测技术检测技术(jsh)(jsh)(jsh)(jsh)n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n2 2 2 2、试剂、试剂、试剂、试剂n n（1 1 1 1）2,62,62,62,6二氯靛酚二氯靛酚二氯靛酚二氯靛酚(2,6(2,6(2,6(2,6二氯靛酚吲哚酚钠盐二氯靛酚吲哚酚钠盐二氯靛酚吲哚酚钠盐二氯靛酚吲哚酚钠盐)溶溶溶溶液液液液n n 配制(pizh)碳酸氢钠(tnsunqnn)热蒸馏水溶解加2，6二氯靛酚溶解冷却后定容过滤保存备用棕色瓶低温滴定度的测定：每次使用均要进行该操作第5页/共58页第六页，共58页。n nVCVCVCVC检
7、测检测检测检测(jin c)(jin c)(jin c)(jin c)技术技术技术技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n2 2 2 2、试剂、试剂、试剂、试剂n n 1ml抗坏血酸标准溶液10ml浸提(jnt)剂用2，6二氯靛酚溶液(rngy)滴定呈粉红色15s不褪色取10ml浸提剂做空白试验（2%草酸OR2%偏磷酸）CV滴定度T(mg/ml)V1V2T每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数C抗坏血酸的浓度,mg/mlV吸取抗坏血酸的体积,mV1滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mlV2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液
8、的体积，ml。第6页/共58页第七页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n2 2 2 2、试剂、试剂、试剂、试剂n n（2 2 2 2）抗坏血酸标准溶液）抗坏血酸标准溶液）抗坏血酸标准溶液）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)(1mg/ml)(1mg/ml)(1mg/ml)n n称取称取称取称取 100mg(100mg(100mg(100mg(准确至准确至准确至准确至 0.1mg)0.1mg)0.1mg)0.1mg)抗坏血酸，溶于浸提抗坏血酸，溶于浸提抗坏血酸，溶于浸提抗坏血酸，
9、溶于浸提(jn t)(jn t)(jn t)(jn t)剂中并稀至剂中并稀至剂中并稀至剂中并稀至100ml100ml100ml100mln n现配现用现配现用现配现用现配现用n n试剂发黄，则弃去不用试剂发黄，则弃去不用试剂发黄，则弃去不用试剂发黄，则弃去不用第7页/共58页第八页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n3 3 3 3、实验步骤、实验步骤、实验步骤、实验步骤(bzhu)(VC(bzhu)(VC(bzhu)(VC(bzhu)(VC的提取的提取的提取的提取/滴定滴定
10、滴定滴定/空白滴定空白滴定空白滴定空白滴定)取样品(yngpn)浸提(jnt)剂捣成匀浆称取部分匀浆浸提剂定容到100ml过滤滤液有颜色用白陶土脱色0.4g/g样品取滤液10ml2,6二氯靛酚溶液滴定 自身为指示剂 浅红色酸式滴定管空白实验：浸提剂10ml第8页/共58页第九页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n3 3 3 3、实验、实验、实验、实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)步骤步骤步骤步骤(VV0)TA维生素C(mg/100g)-100WV滴定样液时
11、消耗染料溶液的体积，mlV0滴定空白时消耗染料溶液的体积，mlT2，6二氯靛酚染料滴定度，mg/mlA稀释倍数 定容体积/吸取体积W样品(yngpn)重量，g第9页/共58页第十页，共58页。n nVCVCVCVC检测检测检测检测(jin c)(jin c)(jin c)(jin c)技术技术技术技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n4 4 4 4、注意事项、注意事项、注意事项、注意事项n n （1）15秒钟红色不褪为终点样品中可能有其他杂质(zzh)也能还原2，6-二氯靛酚，但一般杂质(zzh)还原该染料的速度均较抗坏血酸慢（2）必须
12、做空白实验第10页/共58页第十一页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n4 4 4 4、注意事项、注意事项、注意事项、注意事项n n（3 3 3 3）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴丁醇或辛醇丁醇或辛醇丁醇或辛醇丁醇或辛醇n n（4 4 4 4）整个）整个）整个）整个(zhngg)(zhngg)(zhngg)(zhngg)操作过程要迅速操作过程要迅速
13、操作过程要迅速操作过程要迅速防止被防止被防止被防止被VCVCVCVC氧化氧化氧化氧化n n 滴定过程一般不超过滴定过程一般不超过滴定过程一般不超过滴定过程一般不超过2min 2min 2min 2min n n 滴定所用的染料应在滴定所用的染料应在滴定所用的染料应在滴定所用的染料应在1-4ml1-4ml1-4ml1-4ml之间之间之间之间 （微量滴定管）（微量滴定管）（微量滴定管）（微量滴定管）n n 如果太多？太小？如果太多？太小？如果太多？太小？如果太多？太小？选择合适的滴定管选择合适的滴定管选择合适的滴定管选择合适的滴定管滴定开始(kish)时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失,而
14、后尽可能一滴一滴地加入（先快后慢）第11页/共58页第十二页，共58页。n nVCVCVCVC检测检测检测检测(jin c)(jin c)(jin c)(jin c)技术技术技术技术n n2,62,62,62,6二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法n n4 4 4 4、注意事项、注意事项、注意事项、注意事项n n（5 5 5 5）取样后，应浸泡在已知量的）取样后，应浸泡在已知量的）取样后，应浸泡在已知量的）取样后，应浸泡在已知量的2%2%2%2%草酸溶液中草酸溶液中草酸溶液中草酸溶液中n n2%2%2%2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用
15、（防止被草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被氧化）氧化）氧化）氧化）n n1%1%1%1%草酸无此作用草酸无此作用草酸无此作用草酸无此作用第12页/共58页第十三页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法n n1 1、原理、原理n n用定过量的用定过量的 2,6 2,6二氯靛酚染料与试样中的维生素二氯靛酚染料与试样中的维生素C C进行进行氧化还原反应，多余的染料在酸性环境氧化还原反应，多余的染料在酸性环境(hunjng)(hunjng)中呈中呈红色红色n n用二甲苯萃取后比色，在一定范围内，吸光度与染料浓用
16、二甲苯萃取后比色，在一定范围内，吸光度与染料浓度呈线性相关，测剩余染料浓度，用差减法计算维生素度呈线性相关，测剩余染料浓度，用差减法计算维生素 C C含量。含量。n n2 2、仪器与试剂基本同二氯靛酚比色法、仪器与试剂基本同二氯靛酚比色法/偏磷酸浸提偏磷酸浸提第13页/共58页第十四页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法n n2 2、实验、实验(shyn)(shyn)步骤步骤n n（1 1）样品处理）样品处理 定容到定容到100ml100ml（同二氯靛酚比色法）（同二氯靛酚比色法）n n（2 2）测定）测定 30min 30min内完成内完成
17、食用菌中杂质(zzh)检测5ml2%偏磷酸和5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液6支试管/标准曲线(qxin)（A500染料体积）5ml2%偏磷酸样品浸出液样品测定不同体积2,6二氯靛酚溶液10ml二甲苯用力摇动取有机层测A500用力摇动+5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液+2ml染料溶液用力摇动第14页/共58页第十五页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法n n2 2、实验、实验(shyn)(shyn)步骤步骤n n（3 3）计算）计算 (2 (2V)TAV)TA 维生素维生素 C(mg/100g)C(mg/100g)100100 W W食用菌中杂质
18、(zzh)检测2所用(suyn)2,6二氯靛酚染料的体积，mlV查得2,6二氯靛酚溶液的体积，mlA稀释倍数T染料滴定度，mg/mlW样品重量，g第15页/共58页第十六页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光荧光(ynggung)(ynggung)法（氧化型法（氧化型VC+VC+还原型还原型VCVC）n n1 1、原理、原理n n(1)(1)偏磷酸提取样品中的偏磷酸提取样品中的VCVCn n(2)(2)活性炭氧化提取液中的活性炭氧化提取液中的VCVCn n 还原型还原型VCVC氧化型氧化型VCVCn n 样品中本来的氧化型样品中本来的氧化型VCVCn n 喹喔啉（具有荧光喹喔啉
19、（具有荧光(ynggung)(ynggung)性）性）n n荧光荧光(ynggung)(ynggung)强度与氧化型强度与氧化型VCVC的浓度在一定条件下成的浓度在一定条件下成正比正比食用菌中杂质(zzh)检测+邻苯二胺（OPDA）第16页/共58页第十七页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一法）第一法）n n2 2、试剂、试剂n n （1 1）100g/ml100g/ml抗坏血酸标准溶液抗坏血酸标准溶液 n n先用偏磷酸先用偏磷酸-乙酸乙酸(y sun)(y sun)溶解并定容配成溶解并定容配成1mg/ml1mg/mln n测测pHpH食用菌中杂质(z
20、zh)检测2.2偏磷酸-乙酸-硫酸(lisun)溶液稀释2.2偏磷酸-乙酸（2）活性C（活化）活性C1mol/L盐酸加热回流1-2h第17页/共58页第十八页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一第一(dy)(dy)法）法）n n2 2、试剂、试剂食用菌中杂质(zzh)检测过滤(gul)水洗烘箱中干燥洗到洗液中无Fe3+加入洗液蓝色检验：2%亚铁氯化钾+1%盐酸等量混合洗液中有Fe3+第18页/共58页第十九页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一第一(dy)(dy)法）法）n n3 3、实验步骤、实验步骤n n（1
21、1）样品提取）样品提取食用菌中杂质(zzh)检测称取样品(yngpn)偏磷酸-乙酸溶液匀浆取适量匀浆含有1-2mgvc调酸碱度百里酚蓝指示剂显红色（2.8）偏磷酸-乙酸-硫酸定容到100ml过滤样品滤液(2)用活性C氧化第19页/共58页第二十页，共58页。n nVCVC检测检测(jin c)(jin c)技术技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一法）第一法）n n3 3、实验步骤、实验步骤n n（2 2）氧化处理）氧化处理食用菌中杂质(zzh)检测取样品(yngpn)滤液100ml活性C过滤样品氧化液振摇1mi取抗坏血酸标准溶液100ml标准氧化液取滤液最初几ml舍去（3）制备试液（待测液）
22、、标准液、空白液第20页/共58页第二十一页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一第一(dy)(dy)法）法）n n3 3、实验步骤、实验步骤食用菌中杂质(zzh)检测（3）制备试液(sh y)（待测液）、标准液、空白液5ml标准氧化液5ml标准氧化液标准液标准空白液5ml样品氧化液5ml样品氧化液试液（待测液）试液空白液5ml硼酸-乙酸钠加水定容到25ml摇动15min5ml50%乙酸钠加水定容到100ml加水定容到25ml加水定容到100ml第21页/共58页第二十二页，共58页。n nVCVC检测检测(jin c)(jin c)技术技术n n荧光法（
23、荧光法（GBGB第一法）第一法）n n3 3、实验步骤、实验步骤食用菌中杂质(zzh)检测（4）测荧光(ynggung)值标准液试液标准空白液试液空白液各2ml5ml邻苯二胺避光放置35min测荧光值（荧光分光光度计）改为不同体积的标准液（0/0.5/1/1.5/2)标准曲线法样品荧光值标样荧光值样品空白荧光值标样空白荧光值第22页/共58页第二十三页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术(jsh)(jsh)n n荧光法（荧光法（GBGB第一法）第一法）n n3 3、实验步骤、实验步骤食用菌中杂质(zzh)检测（5）计算(j sun)样品中维生素C含量(mg/100g)=(IIb)c5D1
24、00(IsIsb)m100I样品荧光值；Ib样品空白溶液荧光值；Is标样荧光值；Isb标样空白溶液荧光值c标样质量浓度，0.1mg/mL（100g/ml）；m样品的质量，g。D样品(测荧光值时)稀释倍数；5-5ml标准氧化液100-样品滤液100ml第23页/共58页第二十四页，共58页。n nVCVC检测技术检测技术n n荧光法（荧光法（GBGB第一法）第一法）n n4 4、注意事项、注意事项n n（1 1）尽快用偏磷酸）尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素素C C n n（2 2）不易过滤可改为抽滤或离心后取上清液过滤）不易过滤可改为抽滤或离
25、心后取上清液过滤n n（3 3）活性炭用量应适当与准确）活性炭用量应适当与准确 （有吸附抗坏血酸的作用（有吸附抗坏血酸的作用 ）n n（4 4）本法为外标法测定，也可通过标准曲线）本法为外标法测定，也可通过标准曲线(qxin)(qxin)法测法测定定n n（5 5）全部实验应避光操作）全部实验应避光操作n n（6 6）空白液中硼酸的加入）空白液中硼酸的加入消除产品中丙酮酸的干扰消除产品中丙酮酸的干扰食用菌中杂质(zzh)检测第24页/共58页第二十五页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝
26、基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n1 1 1 1、原理、原理、原理、原理n n 样品样品样品样品(yngpn)(yngpn)(yngpn)(yngpn)中还原型中还原型中还原型中还原型VCVCVCVC经活性炭氧化为氧化型经活性炭氧化为氧化型经活性炭氧化为氧化型经活性炭氧化为氧化型VCVCVCVCn n 原有原有原有原有的氧化型的氧化型的氧化型的氧化型VCVCVCVCn n n n脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。n
27、 n 食用菌中杂质(zzh)检测2，4-二硝基苯肼二硝基苯肼红色红色(hngs)脎脎第25页/共58页第二十六页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n2 2 2 2、实验步骤、实验步骤、实验步骤、实验步骤n n（1 1 1 1）样品提取）样品提取）样品提取）样品提取 同前同前同前同前(tn qin)(tn qin)(tn qin)(tn qin)法法法法n n（2 2 2 2）氧化）氧化）氧化）氧化n n取取取取25ml 2
28、5ml 25ml 25ml 样品滤液样品滤液样品滤液样品滤液2g2g2g2g活性活性活性活性C C C C 振摇振摇振摇振摇1min 1min 1min 1min 过滤过滤过滤过滤n n取滤液取滤液取滤液取滤液10ml 10ml2%10ml 10ml2%10ml 10ml2%10ml 10ml2%硫脲溶液硫脲溶液硫脲溶液硫脲溶液样品氧化液样品氧化液样品氧化液样品氧化液n n （3 3 3 3）呈色反应）呈色反应）呈色反应）呈色反应食用菌中杂质(zzh)检测最初(zuch)滤液舍去4ml氧化液4ml氧化液4ml氧化液空白平行实验2，4二硝基苯肼373h防止防止VC继续被氧化继续被氧化促进脎的形成
29、促进脎的形成氧化剂氧化剂+脱色剂脱色剂第26页/共58页第二十七页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n2 2 2 2、实验、实验、实验、实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)步骤步骤步骤步骤食用菌中杂质(zzh)检测冷却(lngqu)空白液室温样品液冰水冰水冷却2，4二硝基苯肼10-15min后（4 4）85%85%硫酸处理硫酸处理本步已成脎，但显色不稳定本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为用浓硫酸处
30、理，转变为橘红色的双橘红色的双-2，4-二硝基苯二硝基苯每支+5ml85%硫酸边加边摇至少加1min室温下放置30min第27页/共58页第二十八页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n2 2 2 2、实验、实验、实验、实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)步骤步骤步骤步骤食用菌中杂质(zzh)检测（5）比色测定(cdng)测A500（6 6）绘制标准曲线）绘制标准曲线 50ml1mg/ml抗坏血酸标准溶液1g
31、活性C 振摇1min 过滤取滤液10ml 5g硫脲 1%草酸定容到500ml（浓度为20g/ml）1%硫脲稀释到不同浓度（1/2/4/6/10/12g/ml）以下操作同样品测定取4ml2，4二硝基苯肼373h5ml85%硫酸室温下放置30minA500标准曲线第28页/共58页第二十九页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n2 2 2 2、实验、实验、实验、实验(shyn)(shyn)(shyn)(shyn)步骤步骤步骤步骤
32、食用菌中杂质(zzh)检测（7）计算(jsun)X=（cV/m）F(100/1000)X样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，g/ml；m试样质量，g；F样品氧化处理时的稀释倍数；V呈色反应所用试样体积，ml。第29页/共58页第三十页，共58页。n nVCVCVCVC检测技术检测技术检测技术检测技术n n2 2 2 2，4-4-4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGBGBGB第二法）第二法）第二法）第二法）n n3 3 3 3、注意事项、注意事项、注意事项、注意事项n n（1 1 1 1）试管自冰水中取出
33、后，颜色会继续变深，）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后所以，加入硫酸后所以，加入硫酸后所以，加入硫酸后30303030分钟应准时比色。分钟应准时比色。分钟应准时比色。分钟应准时比色。n n（2 2 2 2）活性）活性）活性）活性CCCC氧化剂氧化剂氧化剂氧化剂+脱色脱色脱色脱色(tu s)(tu s)(tu s)(tu s)剂（深色样剂（深色样剂（深色样剂（深色样品）品）品）品）n n无色或已脱色无色或已脱色无色或已脱色无色或已脱色(tu s)(tu s)(tu s)(tu s)样品样品样品样品溴或
34、溴或溴或溴或2 2 2 2，6 6 6 6二氯靛二氯靛二氯靛二氯靛酚作氧化剂酚作氧化剂酚作氧化剂酚作氧化剂n n（3 3 3 3）硫脲的加入）硫脲的加入）硫脲的加入）硫脲的加入防止防止防止防止VCVCVCVC继续被氧化继续被氧化继续被氧化继续被氧化n n 促进脎的促进脎的促进脎的促进脎的形成形成形成形成食用菌中杂质(zzh)检测第30页/共58页第三十一页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)测定蛋白质的方法可分为两大类测定蛋白质的方法可分为两大类利用蛋白质的共性，即含氮量（利用蛋白质的共性，即含氮量（16%16%）、肽键测定蛋、肽键测定蛋白质含量白质含量(hnling)(hnling)；
35、利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量芳香基团等测定蛋白质含量(hnling)(hnling)。具体测定方法具体测定方法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂(shj)法、红外光谱法、红外光谱蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法第31页/共58页第三十二页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法测出样品中的总含氮
36、量再乘以相应的蛋白测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白(dnbi)(dnbi)质系数（质系数（1/16%1/16%）而求出蛋白）而求出蛋白(dnbi)(dnbi)质的含量质的含量为粗蛋白为粗蛋白(dnbi)(dnbi)含量（含有少部分含含量（含有少部分含N N非蛋白非蛋白(dnbi)(dnbi)核酸、生物碱等）核酸、生物碱等）18331833年年KieldahlKieldahl首先首先(shuxin)(shuxin)提出提出常量常量K氏定氏定N法法微量微量K氏定氏定N法法自动自动K氏定氏定N法法半微量半微量K氏定氏定N法、改良法等法、改良法等第32页/共58页第三十三页，共58页。食用菌中蛋白
37、质检测(jinc)1 1、原理、原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解 碳和氢被氧化碳和氢被氧化(ynghu)(ynghu)为为CO2CO2和和H2OH2O逸出逸出 有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵常量常量(chngling)K氏氏定定N法法硫酸铜作催化剂常量、微量、半微量硫酸铜+二氧化钛改良2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 第33页/共58页第三十四页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)1 1、原理、原理(yunl)(yunl)常
38、量常量(chngling)K氏氏定定N法法l加硫酸铜加硫酸铜催化剂催化剂指示消化终点指示消化终点：溶液为蓝绿色（：溶液为蓝绿色（硫酸铜溶液颜色）硫酸铜溶液颜色），清澈透明，清澈透明l加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度蒸馏时碱性反应的指示剂蒸馏时碱性反应的指示剂（判断加碱量是否足够）（判断加碱量是否足够）C+CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H20+SO2蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色（氢氧化铜沉（氢氧化铜沉淀、淀、CUO沉淀、铜离子与氨的
39、络合物），沉淀、铜离子与氨的络合物），此时需再增加氢氧化钠用量。此时需再增加氢氧化钠用量。第34页/共58页第三十五页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)常量常量(chngling)K氏氏定定N法法2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 消化(xiohu)l一定是浓硫酸：一定是浓硫酸：浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有脱水性使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三
40、氧化硫H2SO42NH3 (NH4)2SO4l加硫酸钾加硫酸钾增温剂，提高溶液沸点（增温剂，提高溶液沸点（330400）浓硫酸酸性浓硫酸酸性第35页/共58页第三十六页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)1 1、原理、原理用硼酸用硼酸(pn sun)(pn sun)吸收氨吸收氨以标准以标准HClHCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准H2SO4H2SO4或标准或标准HClHCl溶液吸收后再以标溶液吸收后再以标准准NaOHNaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。常量常量(chngling)K氏
41、氏定定N法法整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B407+H2S04+5H20 (NH4)2SO4+4H2BO2 加碱蒸馏，使氨蒸出加碱蒸馏，使氨蒸出(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4第36页/共58页第三十七页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)2 2、仪器与试剂、仪器与试剂（1 1）通风橱）通风橱 （2 2）消化）消化(xiohu)(xiohu)装装置置（3 3）蒸馏装置）蒸馏装置（4 4）盐（硫）酸标准）盐（硫）酸标准溶液溶液 配制、标定配制、标定（
42、5 5）奈氏试剂）奈氏试剂NesslerNessler试剂，试剂，K2K2（HgI4HgI4）常量常量(chngling)K氏氏定定N法法3.5gKI+1.3gHgCl2溶于溶于70毫升水。加毫升水。加30毫升毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。溶解溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。第37页/共58页第三十八页，共58页。食用菌中蛋白质检测
43、(jinc)3 3、实验步骤、实验步骤(bzhu)(bzhu)（1 1）消化）消化 常量常量(chngling)K氏氏定定N法法5克样品+10克结晶硫酸钾+l克硫酸铜+浓硫酸25毫升小火加热保持和缓的沸腾使火力集中在凯氏瓶底部（以免溅附在壁上的蛋白质处于无硫酸存在的情况，使氮有损失。）液体为蓝蓝绿色透明绿色透明继续加热微沸1h冷却l样品放入定氮瓶内时，样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上不要沾附颈上.(用水冲洗用水冲洗)l消化时如不呈透明溶消化时如不呈透明溶液，可放冷后，慢慢加液，可放冷后，慢慢加入入30%过氧化氢过氧化氢2-3ml，促使氧化。促使氧化。l消化时应注意不时转动消化时应注意不时转动凯
44、氏烧瓶，凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗在瓶壁上的固体残渣洗下下促进其消化完全促进其消化完全第38页/共58页第三十九页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)3 3、实验步骤、实验步骤（2 2）蒸馏）蒸馏(zhngli)(zhngli)、吸收、吸收常量常量(chngling)K氏氏定定N法法B25毫升硼酸吸收液甲基红溴甲酚绿混合指示剂l下端插入液面下l40（可放在冷水浴中）A少量水、消化液、玻璃球C80毫升50%氢氧化钠溶液D加热蒸馏将全部氨蒸出:l估计时间1-2hl奈氏试剂检查是否蒸完lPH试纸检查冷凝管下端用水冲洗后继续蒸馏1min后关闭热源（防止倒吸）检
45、验检验NH4+离子，遇铵根离子离子，遇铵根离子析出黄色或红棕色沉淀析出黄色或红棕色沉淀第39页/共58页第四十页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)3 3、实验、实验(shyn)(shyn)步步骤骤（3 3）滴定）滴定常量常量(chngling)K氏定氏定N法法馏出液标准盐酸溶液滴定甲基红溴甲酚绿混合指示剂蓝色微红色别忘记做空白实验！别忘记做空白实验！不称样不称样消化消化蒸馏蒸馏吸收吸收滴定滴定第40页/共58页第四十一页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)3 3、实验步骤、实验步骤(bzhu)(bzhu)（4 4）计算）计算常量常量(chngling)K氏定氏定N法法C(V1-V
46、)X0.014总氮()=X100WC盐酸标准溶液的摩尔浓度；V1样液滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；V空白滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；W样品重量(克)；0.014氮的毫摩尔粗蛋白质()=总氮()KK换算系数，食用菌产品等于4.38第41页/共58页第四十二页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)4 4、注意事项、注意事项（1 1）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。（2 2）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，）消化时如不容易
47、呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入慢慢加入30%30%过氧化氢过氧化氢2-3ml2-3ml，促使氧化。，促使氧化。（3 3）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体液将附在瓶壁上的固体(gt)(gt)残渣洗下，并促进其消化完残渣洗下，并促进其消化完全。全。常量常量(chngling)K氏氏定定N法法第42页/共58页第四十三页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)（4 4）蒸馏装置不能漏气）蒸馏装置不能漏气（5 5）各种试剂及装置的作用及影响）各种试剂及装置的作用及影响浓浓H2SO4 H2SO4 脱水炭化脱水炭化(生
48、成生成CHN)CHN)、氧化、与、氧化、与NH3NH3作用作用CuSO4 CuSO4 催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）K2SO4 K2SO4 提高沸点提高沸点有时有时(yush)(yush)加入硒粉、氧化汞加入硒粉、氧化汞催化剂（为了防止污染催化剂（为了防止污染通常采用硫酸铜）通常采用硫酸铜）50%NaOH50%NaOH的作用：释放铵盐中的的作用：释放铵盐中的NH3 NH3。常量常量(chngling)K氏定氏定N法法第43页/共58页第四十四页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)K K氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量1g1g以上的样品，以上的样品，K K
49、氏烧瓶最小氏烧瓶最小500ml 500ml（加热均（加热均匀匀 缩短消化时间）缩短消化时间）H2SO4H2SO4和和K2SO4K2SO4的添加的添加(tin ji)(tin ji)量量(一般指导原则一般指导原则)1g 1g样品样品 K2SO4 K2SO4：H2SO4=7g H2SO4=7g：12ml12ml 若取样量较大，如干试样若取样量较大，如干试样5 g 5 g 可按每克试样可按每克试样5 m15 m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。吸收液吸收液 标准标准H2SO4 H2SO4 溶液：用标准碱返滴定，甲醛溶液：用标准碱返滴定，甲醛(基基)红指示剂红指示剂 硼酸硼酸：用：用HClHC
50、l进行滴定，混合指示剂进行滴定，混合指示剂蒸馏蒸馏 常量法常量法直接蒸馏直接蒸馏 微量法微量法水蒸汽蒸馏水蒸汽蒸馏常量常量(chngling)K氏定氏定N法法l不需要精确知道体积l不需要标定浓度l弱酸对酸碱滴定要求低第44页/共58页第四十五页，共58页。食用菌中蛋白质检测(jinc)微量微量K氏定氏定N法法原理及适用范围同前原理及适用范围同前与常量法不同点与常量法不同点 样品质量、试剂样品质量、试剂(shj)(shj)量变少量变少 微量滴定管微量滴定管 微量凯氏定氮装置（水蒸气蒸馏）微量凯氏定氮装置（水蒸气蒸馏）实验操作（1）消化最后加水定容到100ml,其他与常量(chngling)法一样