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1、会计学1琼脂糖凝胶电泳详细琼脂糖凝胶电泳详细(xingx)过程与步骤过程与步骤分析分析第一页，共32页。天天然然琼琼脂脂（agar）:又又名名琼琼胶胶、菜菜燕燕、冻冻粉粉 是是从从石石花花菜菜及及其其它它红红藻藻类类植植物物(zolizhw)提提取取出出来来的的一一种种线线状状高聚物。高聚物。n n 琼脂糖（agarose）n n半乳糖及其衍生物构成的中性物质(wzh)，不带电荷D-D-半乳糖半乳糖半乳糖半乳糖第1页/共32页第二页，共32页。核核核核酸酸酸酸(h(h(h(h sun)sun)sun)sun)凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳是是是是分分分分子子子子克克克克隆隆隆隆核核核核心心心
2、心技技技技术术术术之之之之一一一一，用用用用于于于于分离、鉴定和纯化分离、鉴定和纯化分离、鉴定和纯化分离、鉴定和纯化DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA片段片段片段片段1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒(bngd)等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.样品易回收，常用于制备。琼脂糖凝胶电泳的优点(yudin)第2页/共32页第三页，共32页。缺点缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不机械强度差，易破
3、碎，浓度不能太低。能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临易被细菌污染，不易保存，临用前配制。用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定散，电泳后必须立即固定(gdng)染色。染色。4.与与PAGE相比，分子筛作用小，相比，分子筛作用小，区带少。区带少。第3页/共32页第四页，共32页。一、实验目的一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNADNA的原理的原理(yunl)(yunl)和方和方法法DNADNA分子在碱性缓冲液中带分子在碱性缓冲液中带(zhn di)(zhn di)负电荷，负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。在外加电场
4、作用下向正极泳动。DNADNA分分子子在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中泳泳动动时时，有有电电荷荷效效应应与与分分子子筛筛效效应应。不不同同(b(b tn)DNAtn)DNA的的分分子子量量大大小小及及构构型型不不同同(b(b tn)tn)，电电泳泳时时的的泳泳动动率率就就不不同同(b(b tn)tn)，从而分出不同，从而分出不同(b tn)(b tn)的区带。的区带。二、实验原理二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。第4页/共32页第五页，共32页。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电
5、泳泳法法分分离离DNADNA，主主要要是是利利用用分分子子筛筛效效应应(xioyng)(xioyng)，迁迁移移速速度度与与分分子子量量的的对对数数值值成成反反比比关关系系。因因而而就就可可依依据据DNADNA分分子子的的大大小小使使其其分分离离。该该过过程程可可以以通通过过把把分分子子量量标标准准参参照照物物和和样样品品一一起起进进行行电泳而得到检测。电泳而得到检测。溴溴化化乙乙锭锭（Ethidium Ethidium Bromide,Bromide,EBEB）为为扁扁平平状状分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下发发射射(fsh)(fsh)荧荧光光。EBEB可可与与DNADNA分分子子形形
6、成成EB-DNAEB-DNA复复合合物物，其其荧荧光光强强度度与与DNADNA的的含含量量成成正正比比。据此可粗略估计样品据此可粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。第5页/共32页第六页，共32页。三、实验材料、器具及药品三、实验材料、器具及药品 质粒质粒DNADNA样品。样品。电电泳泳仪仪，电电泳泳槽槽，电电子子天天平平，移移液液器器，枪枪头头(qin(qin tu)tu)，微波炉，紫外透射检测仪等。，微波炉，紫外透射检测仪等。琼琼脂脂糖糖，1XTBE1XTBE电电泳泳缓缓冲冲液液，溴溴化化乙乙锭锭（EBEB），6X6X载载样样缓缓冲液冲液 四、实验步骤四、实验步骤 1g 1g 琼琼脂脂糖糖
7、加加入入100ml 100ml 1TAE1TAE电电泳泳缓缓冲冲液液中中，摇摇匀匀。在在微微波波炉炉中中加加热热至至琼琼脂脂糖糖完完全全(wnqun)(wnqun)溶溶解解。（冷冷却却到到6060，加加入入100l100l的的0.5mg/ml EB0.5mg/ml EB，并摇匀。），并摇匀。）第6页/共32页第七页，共32页。用用胶胶带带将将制制胶胶板板两两端端封封好好，插插入入适适当当梳梳子子，将将溶溶解解的的琼琼脂脂糖（约糖（约5050）倒入，室温）倒入，室温(sh wn)(sh wn)冷却凝固。冷却凝固。充充分分凝凝固固后后撕撕掉掉两两端端的的胶胶布布，将将凝凝胶胶置置入入电电泳泳(di
8、n(din yn)yn)槽槽中中，加加1TAE1TAE电电泳泳(din(din yn)yn)缓缓冲冲液液至至液液面面覆覆盖盖凝凝胶胶1-2mm1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。，小心垂直向上拔出梳子。用用移移液液器器吸吸取取(xq)(xq)总总DNADNA或或质质粒粒样样品品4l4l于于封封口口膜膜上上，再再加加入入2l 2l 的的6X6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打打开开电电源源开开关关，调调节节电电压压至至3-5V/cm3-5V/cm，可可见见到到溴溴酚酚蓝蓝条条带带由负极向正极移动，电泳约由负极向正极移动，电泳约30min-60min30mi
9、n-60min。第7页/共32页第八页，共32页。将将染染色色(rns)(rns)后后的的凝凝胶胶置置于于紫紫外外透透射射检检测测仪仪上上，盖盖上上防防护护观观察察罩罩，打打开开紫紫外外灯灯，可可见见到到发发出出荧荧光的光的DNADNA条带。条带。将将凝凝胶胶放放入入EBEB染染液液中中染染色色5-10min,5-10min,用用清清水水稍稍微微(showi)(showi)漂洗。漂洗。第8页/共32页第九页，共32页。第9页/共32页第十页，共32页。第10页/共32页第十一页，共32页。第11页/共32页第十二页，共32页。第12页/共32页第十三页，共32页。第13页/共32页第十四页，共
10、32页。第14页/共32页第十五页，共32页。第15页/共32页第十六页，共32页。第16页/共32页第十七页，共32页。1 2 3 M 第17页/共32页第十八页，共32页。1 1 1 1、DNADNADNADNA分子的大小分子的大小分子的大小分子的大小(dxio)(dxio)(dxio)(dxio)双链双链双链双链DNADNADNADNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；近似成反比；近似成反比；近似成反比；2 2 2 2、琼脂糖浓度、琼脂糖浓度、琼脂糖浓度、琼脂糖浓度
11、浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3 3 3 3、DNADNADNADNA的构象的构象的构象的构象 同一分子：超螺旋环状线状切口环状同一分子：超螺旋环状线状切口环状同一分子：超螺旋环状线状切口环状同一分子：超螺旋环状线状切口环状DNA的迁移速率的迁移速率(sl)决定因决定因素素第18页/共32页第十九页，共32页。4 4 4 4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴溴溴溴化化化化乙乙乙乙锭锭锭锭（EBEBEBEB）插
12、插插插入入入入双双双双链链链链DNADNADNADNA造造造造成成成成其其其其负负负负电电电电荷荷荷荷减减减减少少少少、刚刚刚刚性性性性和长度增加。和长度增加。和长度增加。和长度增加。5 5 5 5、所用的电压、所用的电压、所用的电压、所用的电压 低电压时低电压时低电压时低电压时DNADNADNADNA片段迁移率与所用的电压成正比。片段迁移率与所用的电压成正比。片段迁移率与所用的电压成正比。片段迁移率与所用的电压成正比。6 6 6 6、琼脂糖种类、琼脂糖种类、琼脂糖种类、琼脂糖种类 常常常常见见见见(chn(chn(chn(chn jin)jin)jin)jin)的的的的有有有有两两两两种种种
13、种：标标标标准准准准琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖和和和和低低低低熔熔熔熔点点点点琼琼琼琼脂脂脂脂糖；糖；糖；糖；第19页/共32页第二十页，共32页。不同类型不同类型(lixng)琼脂糖的性琼脂糖的性质质 琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖3538353890959095不同厂家生不同厂家生产的不同商产的不同商品其凝结温品其凝结温度和熔化温度和熔化温度有一定差度有一定差异异4042404285908590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖3443344385958595 修饰的低熔点修饰的低熔点/凝凝点琼脂糖点琼脂糖253525356365636535356565
14、 超低熔点超低熔点81581540454045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖2530253070703838858530307575第20页/共32页第二十一页，共32页。不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离(fnl)DNA(fnl)DNA片段的范片段的范片段的范片段的范围围围围浓浓 度度（%）标标 准准(kb)高强度高强度(kb)低熔点低熔点(kb)低黏度低溶低黏度低溶点点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00
15、.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第21页/共32页第二十二页，共32页。常用常用(chn yn)(chn yn)的电泳缓冲液的电泳缓冲液4 保存保存(bocn)备用备用.7、电泳、电泳(din yn)缓冲液缓冲液第22页/共32页第二十三页，共32页。TAETAETAETAE和和和和TBETBETBETBE电泳电泳电泳电泳(din yn)(din yn)(din yn)(din yn)缓冲液比较缓冲液比较缓冲液比较缓冲液比较都是常用电泳都是常用电泳(din yn)(din yn)缓冲液，二者相比：缓冲液，二者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量较低，
16、如长时间电泳的缓冲容量较低，如长时间电泳(din yn)(din yn)会被消耗，此会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状）双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的）对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE，对于低分子质，对于低分子质量的量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中
17、的电泳中的电泳(din yn)(din yn)分辨率要好于分辨率要好于TBETBE。第23页/共32页第二十四页，共32页。凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液载载样样缓缓冲冲液液：临临上上样样到到凝凝胶胶加加样样孔孔之之前前与与待待电电泳泳的的样样品相混合的一种缓冲液。品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其其中中的的染染料料在在电电场场中中以以可可以以预预测测(yc)(yc)的的泳
18、泳动动速速率向阳极迁移。率向阳极迁移。第24页/共32页第二十五页，共32页。6666凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 6 缓冲液缓冲液贮存温度贮存温度I I0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰40%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液IIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰15%15%聚蔗糖聚蔗糖(Type400)(Type400)水溶液水溶液IIIIII0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝440.25%0.25%二甲苯氰二甲苯氰30%30%甘油水溶液甘油水溶液IVIV0.
19、25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝4440%(m/V)40%(m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第25页/共32页第二十六页，共32页。琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNADNADNADNA的检测的检测的检测的检测(jin(jin(jin(jin c)c)c)c)通过通过(tnggu)(tnggu)染色染色,紫外灯下检测。紫外灯下检测。主要采用溴化乙锭（主要采用溴化乙锭（ethidium bromide,EBethidium bromide,EB）染色）染色法。法。第26页/共32页第二十七页，共32页。第27页/共32页第二十八页，共32页。使用使用使用使用(sh(sh yng)EBy
20、ng)EB染色注染色注染色注染色注意事项意事项意事项意事项（1 1）EBEB被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质被认为是一种强致癌物质（2 2）EBEB可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸可用来检测单链或双链核酸（3 3）EBEB使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用使用时的配制、贮存及使用 EB EB常用水配制成常用水配制成常用水配制成常用水配制成10 mg/ml10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶的贮存液，于室温保存在棕色瓶的贮存液，于室温保存在棕色瓶的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用
21、铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 0.5 g/ml。（4 4）当要知道）当要知道）当要知道）当要知道DNADNA片段准确片段准确片段准确片段准确(zh(zh nqu)nqu)大小时，凝胶应在无大小时，凝胶应在无大小时，凝胶应在无大小时，凝胶应在无EBEB情况下电泳，电泳结束后再用情况下电泳，电泳结束后再用情况下电泳，电泳结束后再用情况下电泳，电泳结束后再用EBEB染色。染色。染色。染色。第28页/共32页第二十九页，共32页。凝胶中凝胶中凝胶中凝胶中DNADNADNADNA的成像的成像的
22、成像的成像 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，图染色的凝胶成像，图像可以直接像可以直接(zhji)(zhji)输出到计算机观察。输出到计算机观察。第29页/共32页第三十页，共32页。关于琼脂糖凝胶电泳的实验关于琼脂糖凝胶电泳的实验关于琼脂糖凝胶电泳的实验关于琼脂糖凝胶电泳的实验(shyn)(shyn)技巧和方法技巧和方法技巧和方法技巧和方法 几点注意事项几点注意事项几点注意事项几点注意事项1 1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNADNA的带型将不会整齐，加样
23、前要的带型将不会整齐，加样前要的带型将不会整齐，加样前要的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2 2）每孔最大）每孔最大）每孔最大）每孔最大DNADNA上样量决定于上样量决定于上样量决定于上样量决定于DNADNA样品片段的大小、数目及样品孔形样品片段的大小、数目及样品孔形样品片段的大小、数目及样品孔形样品片段的大小、数目及样品孔形状状状状(xngzhun)(xngzhun)与容量。与容量。与容量。与容量。3 3）应注
24、意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。品孔造成交叉污染，影响结果分析。品孔造成交叉污染，影响结果分析。品孔造成交叉污染，影响结果分析。4 4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸）在实验加样中不一定每一个样品都换一个
25、枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于打电泳缓冲液以清洗。（对于打电泳缓冲液以清洗。（对于打电泳缓冲液以清洗。（对于SouthernSouthern印迹转移和需要回收印迹转移和需要回收印迹转移和需要回收印迹转移和需要回收DNADNA片片片片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）第30页/共32页第三十一页，共32页。5 5）凝凝凝凝胶胶胶胶中中中中加加加加入入入入EBEB进进
26、进进行行行行电电电电泳泳泳泳，便便便便于于于于紫紫紫紫外外外外线线线线下下下下观观观观察察察察电电电电泳泳泳泳状状状状态态态态，但但但但EBEB会会会会导导导导致致致致线线线线形形形形DNADNA迁迁迁迁移移移移率率率率下下下下降降降降，这这这这在在在在酶酶酶酶切切切切质质质质粒粒粒粒与与与与空空空空白白白白对对对对照照照照质质质质粒粒粒粒一一一一起起起起电泳时应值得注意。电泳时应值得注意。电泳时应值得注意。电泳时应值得注意。6 6）电电电电泳泳泳泳过过过过程程程程中中中中，溴溴溴溴化化化化乙乙乙乙锭锭锭锭向向向向负负负负极极极极移移移移动动动动，与与与与DNADNA泳泳泳泳动动动动的的的的方
27、方方方向向向向相相相相反反反反，较较较较长长长长时时时时间间间间的的的的电电电电泳泳泳泳会会会会造造造造成成成成靠靠靠靠正正正正极极极极方方方方向向向向的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶中中中中溴溴溴溴化化化化乙乙乙乙锭锭锭锭含含含含量量量量低低低低，会会会会对对对对含含含含量量量量较较较较少少少少的的的的小小小小分分分分子子子子DNADNA片片片片段段段段检检检检测测测测困困困困难难难难。处处处处理理理理方方方方法法法法是是是是：将将将将凝凝凝凝胶在胶在胶在胶在0.5ug/ml0.5ug/ml的的的的EBEB溶液中染色溶液中染色溶液中染色溶液中染色30304545分钟。分钟。分钟。分钟。7 7）判判判判断断断断(pndun)(pndun)正正正正负负负负极极极极的的的的另另另另一一一一方方方方法法法法是是是是负负负负极极极极气气气气泡泡泡泡（H2H2）比比比比正正正正极极极极气气气气泡泡泡泡（O2O2）多一倍。）多一倍。）多一倍。）多一倍。第31页/共32页第三十二页，共32页。