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1、分子诊断与治疗杂志2009年11月第1卷第4期J Mol Diagn Ther,November 2009,Vol.1 No.4寡核苷酸微阵列芯片在人乳头瘤病毒基因分型检测中的应用评估汪圣强1杭莉虹1钱盼盼1高杰1胡守旺2摘要目的探讨寡核苷酸微阵列芯片技术在人乳头瘤病毒(HPV)检测中的实用价值。方法使用HPV寡核苷酸微阵列芯片试剂盒对227例宫颈拭子样本进行16种高危型(HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，CP8304)和5种低危型(6，11，42，43和44)检测，所检测的样本为HC2探针捕捉法检测所得到的HPV高危型和低危型样
2、本，用以评估该DNA微阵列试剂的性能。结果190例经HC 2法检测为高危型HPV阳性以及30例被HC 2法检测为低危型的样品被寡核苷酸微阵列芯片试剂盒检测出具体的高危和低危HPV型别，总共检测出13种高危型和5种低位危型HPV亚型，在高危亚型中，各型检出率分别是16型26.01%、58型20.18%、52型14.71%、68型7.59%、31型7.13%、33型6.37%、66型6.24%、18型4.05%、59型2.18%、39型1.10%、56型1.50%、45型1.40%、51型1.07%；在低危亚型中，各型检出率分别为6型45.43%、11型29.70%、42型14.11%、43型5.
3、89%和44型5.00%。单一HPV亚型感染及2种、3种HPV亚型混合感染分别为60.46%、29.89%、9.65%。7例经HC2检测为高危型，但寡核苷酸微阵列芯片试剂盒未能检测出HPV的具体型别，寡核苷酸微阵列芯片试剂盒与HC 2法高危型HPV检测结果的符合率为96.92%(220/227)。结论HPV 寡核苷酸微阵列芯片试剂盒与HC 2法高危型HPV检测阳性符合率高，并可以明确具体分析21种HPV型别，是一种准确、高效、经济的HPV型别检测方法，可用于HPV的常规基因型分型诊断及人群筛查。关键词HPV；基因分型；寡核苷酸微阵列芯片试剂盒Application evaluation of
4、oligonucleotide microarray for human papillomavirus genotypingWANG Shengqiang1,HANG Lihong1,QIAN Panpan1,GAO Jie1,HU Shouwang2（1Wuxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jiangsu,Wuxi 214101,China;2.DaAn Gene DiagnosticCenter of Yat-sen University,Guangdong,Guangzhou 510665,China）ABSTRACTObjec
5、tiveTo explore the application value of oligonucleotide micoarray for humanpapillomavirus(HPV)detection.Methods227 samples of dacron swabs are tested by Oligonucleotide Micoarray kitfor HPVgenotyping of 16 high risk subtypes(HPV-16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,CP8304),and5lowrisksubtype
6、s(HPV6,11,42,43,44),thesamples wereHC2kit testedfor highriskandlowrisksubtypes,beintendedfor performance evaluation of the Oligonucleotide Micoarray kit.Results190 high risk and 30 low risk HPVsubtypepositive cases were genotyped sepciifcally by Oligonucleotide Micoarray kit via blind assay.13 high
7、risk HPVgenotypeswere detected,namely HPV 16(26.01%),58(20.18%),52(14.71%),68(7.59%),31(7.13%),33(6.37%),66(6.24%),18(4.05%),59(2.18%),39(1.10%),56(1.50%),45(1.40%),51(1.07%)，and 5 low risk HPV genotypes were detected as 6（45.43%）,11（29.70%）,42（14.11%）,43（5.89%）and44（5.00%）.Thedetectionratesof1singl
8、eHPVgenotypeinfectionand 2,3 HPV genotypes mixed infection were 60.46%,29.89%,9.65%resepctively.7 samples were not detected forgenotype.The coincidence rate was 96.92%between Oligonucleotide Micoarray kit and HC2.ConclusionOligonucleotide Micoarray kit was a rapid and economic method to identify HPV
9、genotype and high coincidence rate withHC2 and could be applied for HPVgenotyping and screening of HPVinfection.KEY WORDSHuman papillomavirus(HPV);Genotype;Oligonucleotide Micoarray kit基金项目：国家“十一五”科技重大专项课题（2008ZX10401）作者单位：1.无锡出入境检验检疫局，江苏，无锡2141012.中山大学达安基因诊断中心，广东，广州510665通讯作者：汪圣强，E-mail：论 著 227分子诊断
10、与治疗杂志2009年11月第1卷第4期J Mol Diagn Ther,November 2009,Vol.1 No.4子宫颈癌的发病率位居妇科肿瘤第2位1，每年新诊断的病例达500000。研究发现人乳头瘤病毒（humanpapillomavims，HPV）是最主要的致癌病毒25。随着对人乳头瘤病毒与女性生殖器相关疾病研究的深入以及HPV检测技术的不断升级，临床中女性生殖道HPV感染的检出率亦随之增加。子宫颈癌的筛查方法也由组织细胞水平发展到分子水平611，主要包括传统细胞学检测方法、单层细胞学检测方法、组织病理学检测方法、HPVDNA检测方法和HPVRNA检测方法几大类型。HPV DNA检测
11、试剂目前主要包括杂交捕获法（hybridcapture，HC2）、荧光定量PCR法、反向斑点杂交法（RDB）等。但HC2和荧光定量PCR检测方法只能将HPV感染分为高危和低危两群，不能具体分辨型别，在应用价值方面存在不小的缺陷。RDB法可以明确分辨亚型，但也有操作较繁琐、检测时间稍长、通量低等缺点。寻找一种高通量、快捷、价格低廉又能够精确分型的HPV分型方法，成为当务之急。中山大学达安基因股份有限公司研制的HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒，具有以上特点。本文对该试剂进行实际临床样本检测，分析评价其性能和应用价值。1材料和方法1.1临床样本南京医科大学附属无锡第一医院20072008年采集
12、的宫颈拭子样本227例，其中，采用HC2检测为HPV高危型的样本197例，低危型30例。1.2仪器与试剂盒HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司提供科研用试剂），该试剂盒每张微阵列玻片可以一次检测12个样本的所有型别；HC2以及配套仪器系统购于美国Digene 公司，PCR扩增仪为美国PE公司生产，杂交仪和扫描仪美国GenePix公司生产。1.3检测方法样本检测采用HPV DNA微阵列试剂盒与HC2并行检测方法。样本提取、PCR、杂交、洗涤、扫描和结果分析，按照说明书进行。2结果双盲法检测结果显示，对样本进行HC2检测12，检测结果为高危型HPV的197例样本，低
13、危型HPV30例，共227例。由于HC2方法只能做高危分群，该227例HC2检测结果只能作为总体高危和总体低危型对照，不能作为具体型别对照。使用HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒，对HC2检测为高危的197例和低危型30例样本进行16种高危型（HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，CP8304）和 5 种低危型（6，11，42，43 和 44）分型检测。190例经HC 2法检测为高危型HPV阳性的样品被寡核苷酸微阵列芯片试剂盒检测出具体高危HPV型别，总共检测出13种高危型HPV亚型，检出率分别是 16 型 26.01%、58 型
14、 20.18%、52 型 14.71%、68 型7.59%、31 型 7.13%、33 型 6.37%、66 型 6.24%、18 型4.05%、59 型 2.18%、39 型 1.10%、56 型 1.50%、45 型1.40%、51型1.07%。30例经HC2检测为低危型的样本被寡核苷酸微阵列芯片试剂盒检出5种低危型，在低危亚型中，各型检出率分别为 6 型 45.43%、11 型29.70%、42型14.11%、43型5.89%和44型5.00%。单一HPV亚型感染及2种、3种HPV亚型混合感染分别为60.46%、29.89%、9.65%。7例未能检测出HPV的具体型别，寡核苷酸微阵列芯片
15、试剂盒与HC 2法高危型HPV检测结果的符合率为96.92%（220/227）。高危型和低危型HPV在寡核苷酸微阵列芯片试剂盒上的检测图象，见图1、2。图1微阵列全貌（12个检测区，最右侧两个矩阵为阴阳性质控区）Figure 1The outline of the whole slide microarray(12test districts,the right two districts are positive andnegative controls)图2HPV检测阳性图像Figure 2The image signal of HPV positive test 228分子诊断与治疗杂志
16、2009年11月第1卷第4期J Mol Diagn Ther,November 2009,Vol.1 No.43讨论宫颈癌是妇科常见多发病，在我国其发病率占妇科恶性肿瘤第二位，近年来其发病率有增高的趋势，尤其是年轻患者发病率增高，日益受到重视。宫颈癌与HPV感染关系密切，其自然病程有一个从宫颈上皮不典型增生，到原位癌，到浸润癌的一个连续发生、发展过程，研究显示从不典型增生到原位癌要经历6年左右时间，这一时机是我们防治宫颈癌的关键所在，如何在这一时机做好宫颈癌的早期防治是我们临床工作的重点。由于宫颈癌与高危型HPV的密切关系，HPV分型检测和筛查已经成为宫颈癌筛查和预防的主要方法，HPV的筛查和
17、检测方法目前已经发展到核酸检测水平。本文对HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒进行了临床实例样本检测，并与HC2进行了对比，评价其HPV临床检测和筛查的应用价值。由于HC2检测方法是一种只能够进行高危分群，不能够进行具体分型的方法，在临床应用中具有一定的局限性，因为HPV具体分型是具有明显的临床意义的13。通过比较实验，发现HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒有以下几个特点：能够进行HPV16种高危型和5种低危型精确分型，相比HC2方法的只分群不分型，具有更精确更具有应用价值的优点；每张微阵列玻片可以同时进行12个样本的检测，检测通量高；每次检测需要时间少于3小时，操作简便，出结果快；由于
18、集成检测，制造成本低，每例样本需要费用低；与HC2比较，检测的符合率高，227例样本检测的符合率为96.92%。综上所述，HPV基因分型寡核苷酸微阵列芯片试剂盒是一种准确、高效、的HPV型别检测方法，可用于HPV的临床样本基因型分型诊断及宫颈癌人群筛查。参考文献1Bosch F X,Lorincz A,Munoz N,et a1.The causal relationbetween human papillomavirus and cervical cancerJ.JClin Pathol,2002,55:244-265.2梁莉,陈萍,陈晓.年轻妇女宫颈癌与HPV感染的关系J.热带医学杂志,2
19、006,6(4):436-438.3钱元淑,招雯,隋丽华,等.人乳头状瘤病毒16/18、单纯疱疹病毒型和巨细胞病毒感染与官颈癌发生发展的关系J.中华流行病学杂志,2005,26(8):624-627.4刘植华,李晴,李卫红,等.宫颈疾病1686例临床分析J.中国实用妇科与产科杂志,2004,20(11):662-664.5杨华,蒋幼芳,任娟.人乳头瘤病毒与女性生殖道病原体感染相关性分析J.国际流行病学传染病学杂志,2007,34(2):412-415.6杨柳光,蒋利君,李卓园.基因芯片技术在HPV分型检测中的运用J.广西医学,2005,27(8):456-458.7赵虎,郑英,刘玉玲.人乳头瘤
20、病毒基因芯片研究现状J.国外医学:妇产科学分册,2004,31(6):678-681.8吴有利,陆学东,刘键,等.膜杂交多重检测技术在HPV基因分型中的应用J.中国热带医学杂志,2005(12):336-339.9An H J,Cho N H,Lee S Y.Correlation of cervical carcinomaand precancerous lesions with human papillomavirus(HPV)genotypes detected with the HPVDNAchip microarray methodJ.Cancer,2003,97(7):1124-1128.10 刘玉玲,郑英,赵虎.人乳头瘤病毒检测及分型基因芯片制备的初步研究J.中国实用妇科与产科杂志,2005,21(7):445-449.11 黄庆,府伟灵,周玉,等.基因芯片对人乳头瘤病毒的快速检测和分型J.中华医院感染学杂志,2005,15(4):280-284.12 赵恩锋,张全,王彤.人乳头瘤病毒与液基细胞检测法在宫颈癌前病变诊断中的意义J.中国体视学与图像分析,2005,10(2):213-216.13 童晓霞,柳晓春,苏蓉卿.宫颈常见病原体感染与宫颈癌相互关系的探讨J.热带医学杂志,2007,12(7):1187-1189.229