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1、会计学1植物植物(zhw)组织培养教程组织培养教程 李浚明李浚明 第一页，共69页。一、培养基的组成和作用 培养基（medium）是植物组织培养的重要(zhngyo)材料，是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。第1页/共69页第二页，共69页。（一）矿质营养：矿质营养又称无机营养，是指植物(zhw)生长发育所需要的各种化学元素。第2页/共69页第三页，共69页。矿质元素的生理(shngl)作用：（1
2、）组成各种化合物，成为结构物质；（2）构成特殊物质，参与代谢；（3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；（4）影响形态发生和组织、器官的建成等。第3页/共69页第四页，共69页。根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。国际植物生理学会建议将植物所需浓度大于0.5 mmol/l的的元素称为(chn wi)大量元素。低于0.5 mmol/l的元素称为(chn wi)微量元素。根据此规则大量元素种类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H、O为气体元素，其余六种为矿质元素，分别占植物干重的百分数为18、10、70、0.3%、0.07、0.3%、0.3
3、、0.07%、0.05。微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。第4页/共69页第五页，共69页。1、大量元素：组织培养中，各种矿质营养主要从培养基中获得，N、P、K、Ca、Mg、S等6种大量元素依靠各种无机盐提供。不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以MS应用最广泛(gungfn)。以MS为例6中矿质元素分别由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2.2H2O提供。第5页/共69页第六页，共69页。第6页/共69页第七页，共69页。大量元素中的氮通常(tngchng)
4、采用硝态氮或铵态氮的形式被使用，但铵态氮浓度过高会对有些植物培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度。而常用MS培养基中既有硝态氮又有铵态氮。第7页/共69页第八页，共69页。2、微量元素：植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶系失活。代谢(dixi)障碍等。各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和呼吸作用；钼为氮素代谢(dixi)的重要元素。第8页/共69页第九页，共69页。第9页/共69页第十页，共69页。微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要(zhngyo)作用，由于在较高pH下，Fe
5、Cl3极易形成Fe（OH）3沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。第10页/共69页第十一页，共69页。第11页/共69页第十二页，共69页。（二）有机成分：主要包括各种维生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、烟酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸(fn sun)钙（VB5）、生物素、钴胺素（VB12）、叶酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有20种氨基酸的混合物，用量101000mg/L,通常用于原生质体等培养。此外肌醇是另外一种重要的有机成分，又叫环己六
6、醇，在糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及维持离子平衡等生理作用。第12页/共69页第十三页，共69页。第13页/共69页第十四页，共69页。（三）植物生长调节物质：植物激素是植物新称代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的用量直接(zhji)影响植物细胞的分化、分裂以及发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。第14页/共69页第十五页，共69页。常用(chn yn)的植物激素及生长调节物涉及五大类植物
7、激素：1、生长素类：IAA、IBA、NAA、2，4-D2、细胞分裂类：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素类：GA3、GA4、GA74、脱落酸：ABA5、乙烯：ETH第15页/共69页第十六页，共69页。第16页/共69页第十七页，共69页。1、生长素类：主要促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织(zzh)，促进生根。常用的有NAA、IAA、IBA、2，4D等。第17页/共69页第十八页，共69页。第18页/共69页第十九页，共69页。2、细胞分裂素类：促进细胞分裂和扩大，促进茎增促，抑制茎伸长；诱导芽的分化、促进侧芽萌发；延缓衰老(shuilo)。常用细胞分裂素有 BA、K
8、IN、ZT、2ip等。第19页/共69页第二十页，共69页。第20页/共69页第二十一页，共69页。第21页/共69页第二十二页，共69页。此外近年来发现苯基(bn j)脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。如TDZ，CPPU，4PU等。第22页/共69页第二十三页，共69页。第23页/共69页第二十四页，共69页。3、赤霉素类：主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；打破(d p)休眠等功能。常用GA3、GA4等。第24页/共69页第二十五页，共69页。第25页/共69页第二十六页，共69页。4、脱落酸（ABA）：促进休
9、眠、衰老和脱落。组织培养中较少使用(shyng)，主要用于调节激素平衡，促进形态建成。第26页/共69页第二十七页，共69页。第27页/共69页第二十八页，共69页。5、乙烯：主要促进衰老(shuilo)和脱落，高浓度易形态变化。第28页/共69页第二十九页，共69页。第29页/共69页第三十页，共69页。（四）碳源：碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在25，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。糖浓度高低(god)直接影响形态建成。第30页/共69页第三十一页，共
10、69页。（五）琼脂：琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水(r shu)（90 oC以上），成为凝胶，冷却后（40 oC以下）即凝固为凝胶。琼脂的用量通常在410g/L.琼脂是组织培养培养基中主要的成本支出，约占80。第31页/共69页第三十二页，共69页。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工工艺有关外，还受高压灭菌(mi jn)时的温度、时间以及 pH影响。第32页/共69页第三十三页，共69页。（六）有机(yuj)附加物：1、椰子汁：用量为100200g/L。2、香蕉泥：使用量为150200g/L。3、苹果汁、番茄汁等。第33页
11、/共69页第三十四页，共69页。（七）其他(qt)成分：1、活性炭：使用量为0.2-1%。第34页/共69页第三十五页，共69页。2、抗生素：常用(chn yn)青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L。第35页/共69页第三十六页，共69页。3、抑制酚类物质形成的物质：（1）抗坏血酸：可以加入培养基或浸泡(jnpo)处理外植体。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）：加入培养基中。第36页/共69页第三十七页，共69页。4、生长(shngzhng)抑制剂：常用矮壮素、比久（B9）、多效唑（pp333）、三碘苯甲酸、根皮酚等。第37页/共69页第三十八页，共69页。二、培养基的类型：1、高盐浓
12、度培养基：MS、B5、SH等。适用于多数营养需求量较大的植物。2、中等盐浓度培养基：Nitsh、Miller等 大量(dling)元素浓度约为MS的1/2。3、低盐培养基：WPM、White等。大量(dling)元素浓度约为MS的1/4左右。适用于木本植物的培养。第38页/共69页第三十九页，共69页。表1MS培养基的组成配方组成成分数量(mg/l)组成成分数量(mg/l)NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5
13、.8 KI0.83 肌醇 100.0 H3BO36.2 烟酸 0.5 MnSO44H2O22.3 盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 盐酸硫铵等 0.4 CoCl26H2O0.025 第39页/共69页第四十页，共69页。表2B5培养基的组成和配方组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l)KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40(NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸
14、1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 第40页/共69页第四十一页，共69页。表3 N6培养基的组成(z chn)和配方组成成分 数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8(NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0
15、.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O1.5 第41页/共69页第四十二页，共69页。第42页/共69页第四十三页，共69页。第43页/共69页第四十四页，共69页。第44页/共69页第四十五页，共69页。第45页/共69页第四十六页，共69页。第46页/共69页第四十七页，共69页。第47页/共69页第四十八页，共69页。第48页/共69页第四十九页，共69页。第49页/共69页第五十页，共69页。第50页/共69页第五十一页，共69页。第51页/共69页第五十二页，共69页。三、培养基母液及激素母液的配制：由于培养基中元素
16、种类多，用量少，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存，配制培养基时根据需要量取用，从而简化操作，节省时间。营养元素母液根据其性质和反应特性混合。激素母液 根据使用(shyng)浓度配制。第52页/共69页第五十三页，共69页。1、器皿和用具的准备 仪器(yq)包括万分之一天平，百分之一天平，pH计 用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）滴灌、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、1
17、00ml、50ml）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围 pH试纸、铅笔等。玻璃器皿用前清洗干净。第53页/共69页第五十四页，共69页。2、药品(yopn)及蒸馏水准备：药品(yopn)采用分析纯或化学纯试剂。水利用蒸馏水或去离子水。第54页/共69页第五十五页，共69页。3、母液配制：（1）配制母液原则：相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确(zhnqu)称量。第55页/共69页第五十六页，共69页。（2）MS培养基母液的配制：MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或10
18、00倍）、Fe盐（100倍）、有机物（100倍）。配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量，然后称取药品(yopn)，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用万分之一天平称量。第56页/共69页第五十七页，共69页。第57页/共69页第五十八页，共69页。第58页/共69页第五十九页，共69页。（3）激素母液的配制：根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。生长素类、赤霉素类及脱落酸等用 95乙醇(y chn)溶解；细胞分裂素类用 1N HCl或1N NaOH溶解。通常激素母液浓度生长素类为 0.10.5 mg/ml,细
19、胞分裂素母液浓度为 0.21.0 mg/ml.第59页/共69页第六十页，共69页。四、培养基的配制：1、量取母液：营养元素和激素。2、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅内，电路上加热(ji r)，使琼脂溶化。3、加入母液，混合均匀，调整pH值。4、分装入瓶，每瓶4050ml。5、封口：用46层称量纸封口，之后灭菌备用。第60页/共69页第六十一页，共69页。第61页/共69页第六十二页，共69页。第62页/共69页第六十三页，共69页。第63页/共69页第六十四页，共69页。五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：1、加热：灭菌前检查(jinch)灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭
20、菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。2、排气：当温度升至0.5kg/cm2时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。第64页/共69页第六十五页，共69页。3、温度控制：当锅内压力升至1.1kg/cm2时，计时1520分钟，计时结束后，关闭电源。4、出锅：当灭菌锅自然冷却(lngqu)后，取出培养基，放置于接种室备用。第65页/共69页第六十六页，共69页。第66页/共69页第六十七页，共69页。六、培养基的保存：1、防尘：防治灰尘污染。2、避光：吲哚(yn du)乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒温：4 oC可保存36周，室温下两周内用完。4。定期更新：不易长期保存。第67页/共69页第六十八页，共69页。20050913第68页/共69页第六十九页，共69页。