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1、会计学1核酸与核苷类药物概述核酸与核苷类药物概述(i sh)及合成工及合成工艺艺第一页，共65页。n n核酸类物质药物一般核酸类物质药物一般(ybn)可分为两大类：可分为两大类：n n一类具天然结构的核酸类物质，一类具天然结构的核酸类物质，n n另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。构类似物或聚合物。第1页/共64页第二页，共65页。前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解
2、以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速和能量平衡，加速和能量平衡，加速和能量平衡，加速(ji s)(ji s)受损组织的修复，促使缺氧组织恢复受损组织的修复，促使缺氧组织恢复受损组织的修复，促使缺氧组织恢复受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、正常生
3、理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶治疗，包括肌苷、辅酶治疗，包括肌苷、辅酶治疗，包括肌苷、辅酶A A、GTPGTP、CTPCTP、UTPUTP、ATPATP、腺苷、腺苷、腺苷、腺苷、辅酶辅酶辅酶辅酶I I、辅酶、辅酶、辅酶、辅酶等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一等，多数是生物体自身能够合成的物质，具
4、有一等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。源中提取。源中提取。源中提取。第2页/共64页第三页，共65页。n n后一类药物是治疗后一类药物是治疗(zhlio)病毒感染性疾病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。疫抑制的临床药物。n n正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑正式用于临床的抗病毒核苷类药物有
5、三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。第3页/共64页第四页，共65页。二、核酸二、核酸(h sun)与核苷的一般理化性质与核苷的一般理化性质核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核苷核苷核苷核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基碱基碱基碱基核酸核苷酸核酸核苷酸核酸核苷酸核酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNADNA、RNARNA）磷酸磷酸磷酸磷酸DNADNA和和和和RNARNA是存在于细胞中的
6、正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。DNADNA主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（2%2%）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；RNARNA主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（10%10%）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。核核核核酸酸酸酸的的的的含含含含量量
7、量量与与与与细细细细胞胞胞胞大大大大小小小小无无无无关关关关，以以以以生生生生长长长长旺旺旺旺盛盛盛盛(wngshng)(wngshng)的的的的组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞中中中中含含含含量量量量较较较较多多多多，如如如如动动动动物物物物胰胰胰胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。第4页/共64页第五页，共65页。第二节第二节 一些一些(yxi)药物的制备工艺及原理药物的制备工艺及原理一、一、RNARNA的提取与制备的提取与制
8、备 工业用工业用RNARNA的提取的提取 （1 1）RNARNA及及其其工工业业来来源源：从从微微生生物物中中提提取取RNARNA是是工工业业上上最最实实际际和和有有效效的的方方法法。一一些些最最常常见见的的菌菌体体含含有有丰丰富富的的核核酸酸资资源源(zyun)(zyun)，如如酵酵母母、白白地地霉霉、多多种种抗抗菌菌素素的的菌菌丝丝体体青青霉霉素素，制制霉霉菌菌素素等等菌菌体。体。通通常常在在细细菌菌中中RNARNA占占5 52525，在在酵酵母母中中占占2.72.71515，在在霉霉菌菌中中占占0.7%0.7%2828。第5页/共64页第六页，共65页。在菌体内RNA含量的变化受培养基组
9、成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以(ky)从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。第6页/共64页第七页，共65页。稀稀碱碱法法：是是用用氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液（1%），使使细细胞胞壁壁变变性性，使使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。需需用用酸酸中中和和PH7。然然后后除除去去菌菌体体，将将pH调调至至RNA的的等等电电点点（pH2.5），使使RNA沉沉淀淀出出来来。上上法法
10、的的缺缺点点是是制制得得的的RNA Mr较较低低,(磷磷酸酸单单脂脂酶酶、磷磷酸酸二二脂脂酶酶降降解解RNA，90 保保持持34h破坏酶破坏酶)。浓浓盐盐法法：是是用用高高浓浓度度盐盐溶溶液液（6%8%）处处理理，同同时时加加热热，以以改改变变细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放出来。放出来。要要避避免免分分子子降降解解，可可采采用用苯苯酚酚法法制制备备RNA。用用苯苯酚酚处处理理生生物物材材料料(cilio)，使使蛋蛋白白质质变变性性，然然后后离离心心，上上层层水水溶溶液液内内含含有有全全部部RNA，可可用用乙乙醇醇沉沉淀淀出出来来。脱脱 氧氧 核核 糖糖 核核
11、蛋蛋 白白 溶溶 于于 浓浓 盐盐 溶溶 液液 1mol/L,不不 溶溶 于于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。盐溶液。第7页/共64页第八页，共65页。（3 3）RNARNA的提取实例：的提取实例：啤啤酒酒酵酵母母是是提提取取RNARNA的的很很好好的的资资源源。取取100g100g压压榨榨啤啤酒酒酵酵母母（含含水水份份70%70%），加加入入230ml230ml含含NaOH NaOH 3g3g的的水水，2020以以下下缓缓慢慢(hunmn)(hunmn)搅搅拌拌3030分分钟钟。用用6mol6molL L HClHCl调调至至pH7pH7，搅搅拌
12、拌1515分分钟钟，离离心心得得清清液液255m1255m1。冷冷至至1010以以下下，6mol6molL L HClHCl调调pH2.5pH2.5，置置冷过夜，离心得冷过夜，离心得RNA l.8gRNA l.8g（纯度（纯度8080）。）。第8页/共64页第九页，共65页。RNARNA提取实例提取实例(shl)(shl)：提取提取 中和中和 HCl HCl 酸化、沉酸化、沉淀淀HClHCl酵母酵母 提取液提取液 上上清液清液 RNA RNA NaOH NaOH、水、水 pH 7 pH 7、离、离心心 pH 2.5 pH 2.5、离心、离心 第9页/共64页第十页，共65页。二、二、DNADN
13、A的提取与制备的提取与制备 工业用工业用DNADNA的提取的提取 取取新新鲜鲜冷冷冻冻鱼鱼精精20kg20kg，用用绞绞肉肉机机粉粉碎碎2 2次次成成浆浆状状，加加入入等等体体积积水水，搅搅拌拌均均匀匀(jnyn)(jnyn)，倾倾入入反反应应锅锅内内，缓缓慢慢搅搅拌拌，升升温温至至100100，保保温温1515分分钟钟，迅迅速速冷冷却却至至20202525，离离心心除除去去鱼鱼精精蛋蛋白白等等沉沉淀淀物物，获获得得35L35L含含热热变变性性DNADNA的的溶溶液液，经经精精确确测测定定DNADNA含含量量后后直直接接可可用用于于酶酶法法降降解解生生产产脱脱氧氧核核苷苷酸酸。如如要要制制成成
14、固固体体状状DNADNA，在在热热变变性性DNADNA溶溶液液中中逐逐渐渐加加入入等等体体积积9595乙乙醇醇，离离心心可可获获得得纤纤维维状状DNADNA，沉沉淀淀用用乙乙醇醇、丙丙酮酮洗洗涤涤，减减压压低低温温干干燥燥得得DNADNA粗品，产品含热变性粗品，产品含热变性DNA50DNA506060。第10页/共64页第十一页，共65页。工业用工业用DNADNA的提取的提取(tq)(tq)提取提取(tq)(tq)热变性热变性 沉淀沉淀 乙醇乙醇鱼精鱼精 提取提取(tq)(tq)液液 纤维状纤维状DNADNA 水、水、100 100 冷却、离心冷却、离心 70%-80%70%-80%（无生物活
15、性）（无生物活性）15min 15min 干燥干燥 粗品粗品DNADNA（热变性后无活性）（热变性后无活性）第11页/共64页第十二页，共65页。l 具有生物活性具有生物活性DNADNA的制备的制备l 动动物物内内脏脏（肝肝、脾脾、胸胸腺腺）加加4 4倍倍重重量量生生理理盐盐水水经经组组织织捣捣碎碎机机捣捣碎碎1 1分分钟钟，匀匀浆浆于于2500r2500rpmpm离离心心3030分分钟钟，沉沉淀淀用用同同样样体体积积的的生生理理盐盐水水洗洗涤涤3 3次次，每每次次洗洗后后离离心心，将将沉沉淀淀悬悬浮浮(xunf)(xunf)于于2020倍倍重重量量的的冷冷生生理理盐盐水水中中，再再捣捣碎碎3
16、 3分分钟钟，加加入入2 2倍倍量量5 5的的（用用45%45%乙乙醇醇作作溶溶剂剂）十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠，并并搅搅拌拌2 23 3小小时时，在在02500r02500rpmpm离离心心，在在上上层层液液中中加加入入等等体体积积的的冷冷9595乙乙醇醇，离离心心即即可可得得到到纤纤维维状状DNADNA，再再用用冷冷乙乙醇醇和和丙丙酮酮洗洗涤涤，减减压压低低温温干干燥燥得得粗粗品品DNADNA。粗粗品品DNADNA溶溶于于适适量量蒸蒸馏馏水水，加加入入5 5十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠达达1 11010体体积积，搅搅拌拌1 1小小时时，经经5000r5000rpmpm离离心心1 1小小时
17、时，清清液液中中加加入入NaClNaCl达达1mol1molL L，再再缓缓慢慢加加入入冷冷95%95%乙乙醇醇，DNADNA析析出出，经经乙乙醇醇、丙丙酮酮洗洗涤涤，真真空空干干燥燥得得具具有有生生物物活活性性的的DNADNA（活活性性DNADNA制制备备需需在在0 033操作）。操作）。第12页/共64页第十三页，共65页。l l生物生物(shngw)(shngw)活性活性DNADNA的制备的制备l l 提取提取 洗涤洗涤3 3次次 5%SDS 5%SDSl l 动物内脏动物内脏 沉淀沉淀 沉淀沉淀 上层液上层液l l（肝、脾）生理盐水（肝、脾）生理盐水 生生理盐水理盐水 再捣碎再捣碎 l
18、 l 离心、离心、30min30minl l 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 提取提取 l l 纤维状纤维状DNA DNA 粗品粗品DNA DNA 上清液上清液l l 95%95%乙醇乙醇 冷乙醇、丙酮冷乙醇、丙酮 水、水、5%SDS5%SDSl l 离心离心l l 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 l l DNA DNA沉淀沉淀 活性活性DNADNAl lNaCLNaCL、95%95%乙醇乙醇 乙醇、丙酮乙醇、丙酮第13页/共64页第十四页，共65页。三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸、酶解法及碱水解法制备核苷酸
19、 酶解法制备脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉产生桔青霉产生(chnshng)5-(chnshng)5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 红酵母产生红酵母产生(chnshng)3-(chnshng)3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶第14页/共64页第十五页，共65页。第15页/共64页第十六页，共65页。l 酶解法制备戊糖核苷酸酶解法制备戊糖核苷酸 l 我我国国从从6060年年代代开开始始使使用用核核酸酸酶酶P1P1降降解解核核糖糖核核酸酸生生产产(shngchn)(shngchn)单单核核苷苷酸酸，日日本本年年产产呈呈味味核核苷苷酸酸（肌肌苷苷酸酸和和鸟鸟苷苷酸酸）30003000吨吨，其其中中60%60%
20、是是使使用用酶酶解解法法生生产产(shngchn)(shngchn)的。的。l 酶解法生产酶解法生产(shngchn)5(shngchn)5单核苷酸工艺流程单核苷酸工艺流程第16页/共64页第十七页，共65页。第17页/共64页第十八页，共65页。l双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I IG G）l呈呈味味核核苷苷酸酸的的主主要要品品种种是是肌肌苷苷酸酸钠钠和和鸟鸟苷苷酸酸钠钠，商商品品名名简简称称为为（I IG G），用用核核酸酸酶酶PlPl降降解解(jin(jin ji)RNAji)RNA可可获获得得GMPGMP和和AMPAMP，其其中中AMPAMP经经脱脱氨氨生生成成I
21、MPIMP。双双酶酶法法生生产产（I I十十G G）工艺）工艺 。第18页/共64页第十九页，共65页。第19页/共64页第二十页，共65页。l菌体自溶法生产核苷酸菌体自溶法生产核苷酸l磷磷酸酸二二酯酯酶酶在在合合适适的的条条件件下下降降解解细细胞胞内内的的RNARNA可可产产生生(chnshng)5-(chnshng)5-核核苷苷酸酸。在在国国内内用用谷谷氨氨酸酸产产生生(chnshng)(chnshng)菌体自溶法生产菌体自溶法生产5-5-核苷酸。核苷酸。l（1 1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：第20页/共64页第二十一页，共65页。l 碱水解法生产碱水解
22、法生产2 2，3 3-混合核苷酸混合核苷酸l RNARNA结结构构中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键对对于于碱碱性性条条件件不不稳稳定定，很很容容易易(rngy)(rngy)生生成成22，3 3 -环环状状磷磷酸酸酯酯，此此环环状状磷磷酸酸酯酯对对碱碱更更不不稳稳定定，很很易易加加水水分分解解生生成成2 2，3 3-混混合合核核苷苷酸酸。取取RNARNA配配成成3 33.5%3.5%的的水水溶溶液液，加加氢氢氧氧化化钠钠达达0.3mol0.3molL L浓浓度度，升升温温至至3838，保保温温16162020小小时时，用用6mol6molL L盐盐酸酸中中和和至至pH7.0pH7.0，从从RNARN
23、A水水解解成成22，3 3-核核苷苷酸酸的的降降解解率率达达9595以以上上，将将22，3 3-混混合合核核苷苷酸酸制制成成每每片片含含5050100mg100mg的的片片剂剂，经经临临床床使使用用，对对非非特特异异性性血血小小板板减减少少症症、对对白白血血球球减减少少症症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。第21页/共64页第二十二页，共65页。第22页/共64页第二十三页，共65页。发酵法生产核苷酸发酵法生产核苷酸发酵法生产核苷酸发酵法生产核苷酸1 1 1 1、发酵法生产肌苷酸（、发酵法生产肌苷酸（、发酵法生产肌苷酸（、发酵法生产肌苷酸（I
24、MPIMPIMPIMP）肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加2%2%2%2%，鲜度可增加，鲜度可增加，鲜度可增加，鲜度可增加3 3 3 3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。钠）后成为第二代特鲜味精。钠）后成为第二代特鲜味精。钠）后成为第二代特鲜味精。产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径产氨短杆菌
25、嘌呤核苷酸生物合成途径产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径(tjng)(tjng)(tjng)(tjng)、代谢调控、代谢调控、代谢调控、代谢调控和肌苷酸发酵机制和肌苷酸发酵机制和肌苷酸发酵机制和肌苷酸发酵机制:第23页/共64页第二十四页，共65页。第24页/共64页第二十五页，共65页。积累积累IMP的主要前提：的主要前提：（1）阻断）阻断(z dun)SAMP合成酶合成酶:即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2）保持）保持 PRA 合成畅通，即后期
26、没有多余腺嘌合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；呤阻遏该步反应；（3）要使）要使IMP渗出胞外，选育对渗出胞外，选育对Mn+不敏感菌不敏感菌株；株；（4）生成的）生成的IMP不被降解，恰好原菌株该酶活力不被降解，恰好原菌株该酶活力低。低。第25页/共64页第二十六页，共65页。2 2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMPGMP）:直接发酵法生产直接发酵法生产GMPGMP必需满足以下条件必需满足以下条件（1 1）解除）解除GMPGMP的反馈抑制（与的反馈抑制（与GMPGMP积累相勃）积累相勃）;（2 2）改变细胞对）改变细胞对GMPGMP的透性的透性;（3 3）不
27、分解生成）不分解生成GMPGMP 只能只能(zh nn)(zh nn)先合成先合成XMPXMP，后转化为，后转化为GMPGMP：方法如下：方法如下：选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除解除PRPPPRPP转酰胺酶及转酰胺酶及XMPXMP合成酶的阻遏，积合成酶的阻遏，积累大量累大量XMP(GMPXMP(GMP合成酶及合成酶及SAMPSAMP合成酶缺失）。合成酶缺失）。第26页/共64页第二十七页，共65页。XMPXMP转化为转化为GMPGMP菌株的条件菌株的条件:(1)GMP (1)GMP不被分解不被分解 (2)GMP (2)GMP合成酶活力合成酶活力(hul
28、)(hul)要强化要强化(抗生抗生素激动剂素激动剂)(3)(3)增加细胞通透性增加细胞通透性第27页/共64页第二十八页，共65页。l 半合成法制备核苷酸半合成法制备核苷酸l 由由于于发发酵酵法法生生产产核核苷苷的的产产率率很很高高，核核苷苷悬悬浮浮于于磷磷酸酸三三甲甲酯酯或或磷磷酸酸三三乙乙酯酯中中，在在冷冷却却条条件件下下加加入入氯氯化化氧氧磷磷，进进行行磷磷酸酸化化，从从核核苷苷生生成成(shn(shn chn)5-chn)5-核核苷苷酸酸收收率可达率可达90%90%。l例例一一：肌肌苷苷2mmol2mmolL L悬悬浮浮于于5ml5ml磷磷酸酸三三乙乙酯酯中中，温温度度控控制制00，添
29、添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmol6mmolL L，水水2mmol2mmolL L，反反应应2h2h，5 5-IMP-IMP摩尔产率达摩尔产率达9191。l例例二二：鸟鸟苷苷2mmol2mmolL L悬悬浮浮于于5ml5ml磷磷酸酸三三甲甲酯酯中中，温温度度控控制制00，添添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmol6mmolL L，水水2mmo/L2mmo/L，反反应应6h6h，5 5-GMP-GMP摩尔产率达摩尔产率达90%90%。第28页/共64页第二十九页，共65页。四、核苷的制备四、核苷的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。物中占主导地
30、位。（1 1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；多达几十种；（2 2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；方面占重要地位；（3 3）核苷的发酵水平大大）核苷的发酵水平大大(d d)(d d)高于核苷酸，高于核苷酸，所以常做后者的前体物质。所以常做后者的前体物质。1 1、RNARNA化学水解法制备核苷：化学水解法制备核苷：第29页/共64页第三十页，共65页。第30页/共64页第三十一页，共65页。2 2、发酵法生产核苷、发酵法生产核苷 产率高、周期短、控制容易、产量大。产率高、周期短、控制
31、容易、产量大。共同特点：共同特点：（1 1）使用磷酸单酯酶活力）使用磷酸单酯酶活力(hul)(hul)很强的枯草很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；（2 2）具有特定标记的有变株；）具有特定标记的有变株；（3 3）发酵培养时需提供限量生长因素。）发酵培养时需提供限量生长因素。原菌株：原菌株：（1 1）AMPAMP强烈抑制强烈抑制PRPPPRPP转酰胺酶的活性，控制转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；总代谢途径；（2 2）AMPAMP抑制抑制SAMPSAMP合成酶；合成酶；（3 3）GMPGMP抑制抑制IMPIMP脱氢酶脱氢酶第31页/共64页第三十
32、二页，共65页。第32页/共64页第三十三页，共65页。生产生产生产生产(shngchn)(shngchn)(shngchn)(shngchn)菌株：菌株：菌株：菌株：（1 1 1 1）酶）酶）酶）酶6 6 6 6、7 7 7 7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP-IMP-IMP-IMP-肌肌肌肌苷（肝炎辅助药）；苷（肝炎辅助药）；苷（肝炎辅助药）；苷（肝炎辅助药）；（2 2 2 2）酶）酶）酶）酶4 4 4 4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XM
33、P-XMP-XMP-XMP-黄苷；黄苷；黄苷；黄苷；（3 3 3 3）酶）酶）酶）酶5 5 5 5缺失积累鸟苷。缺失积累鸟苷。缺失积累鸟苷。缺失积累鸟苷。第33页/共64页第三十四页，共65页。发酵发酵(f jio)(f jio)法生产肌苷法生产肌苷（1 1）肌苷生产工艺）肌苷生产工艺（2 2）发酵）发酵(f jio)(f jio)工艺条件：工艺条件：碳源为葡萄糖碳源为葡萄糖 保证充足的氮源保证充足的氮源 磷酸盐的影响磷酸盐的影响 Mg+Mg+、Ca+Ca+有促进作用有促进作用 生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量 最适发酵最适发酵(f jio)(f jio)温度为温度
34、为30-3430-34，pH6.06.2pH6.06.2 需大风量需大风量,高溶氧和低高溶氧和低CO2CO2第34页/共64页第三十五页，共65页。发酵法生产发酵法生产(shngchn)肌酐的肌酐的工艺流程工艺流程第35页/共64页第三十六页，共65页。发酵法生产鸟苷和黄苷发酵法生产鸟苷和黄苷 鸟苷产生菌的特征：鸟苷产生菌的特征：（1 1）嘌呤核苷酸分解酶活力强；）嘌呤核苷酸分解酶活力强；（2 2）SAMPSAMP合成酶，合成酶，GMPGMP还原酶缺失；还原酶缺失；（3 3）解除）解除AMPAMP、GMPGMP对对PRPPPRPP转酰胺酶，肌苷酸脱转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和氢酶和GMPGMP合成
35、酶的反馈合成酶的反馈(fnku)(fnku)抑制；抑制；第36页/共64页第三十七页，共65页。第37页/共64页第三十八页，共65页。发酵法生产腺苷发酵法生产腺苷 以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础基础(jch)(jch)菌株。菌株。诱变结果：诱变结果：（1 1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；（2 2）黄嘌呤缺陷型，）黄嘌呤缺陷型，GMPGMP还原酶缺失；还原酶缺失；（3 3）抗）抗8 8杂氮黄嘌呤解除对杂氮黄嘌呤解除对PRPPPRPP转酰胺酶的转酰胺酶的抑制；抑制；（4 4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷
36、及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。第38页/共64页第三十九页，共65页。第三节第三节 核酸核酸(h sun)(h sun)与核苷类药物的制备与核苷类药物的制备举例举例 第39页/共64页第四十页，共65页。（一）叠氮胸苷（一）叠氮胸苷（AzidothymidineAzidothymidine，AZTAZT）1 1、结构、结构(jigu)(jigu)与性质与性质 AZTAZT是是19871987美美国国FDAFDA批批准准的的治治疗疗艾艾滋滋病病的的新新药药 。AZTAZT的的药药理理作作用用是是人人体体内内经经磷磷酸酸化化后后生生成成了了3-3-叠叠氮氮-2
37、-2-脱脱氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸，后后者者取取代代了了正正常常的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸参参与与病病毒毒DNADNA的的合合成成，含含有有AZTAZT成成份份的的DNADNA不不能能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。2 2、生产工艺、生产工艺 此此合合成成路路线线的的起起始始原原料料是是胸胸苷苷，目目前前主主要要是是从从DNADNA水水解解法法制制备备，由由于于原原料料来来源源少少，合合成成路路线线较较复复杂杂，成本很高。成本很高。第40页/共64页第四十一页，共65页。已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：已见报道的胸苷合成方法还有两条
38、途径：从从2-2-脱氧胞苷或脱氧胞苷或2-2-脱氧鸟苷或脱氧鸟苷或2 2-脱氧腺脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应苷与胸腺嘧啶反应(fnyng)(fnyng)，经大肠杆菌产生的磷酸，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。化酶催化生成胸苷。从鸟苷（从鸟苷（300mmol300mmolL L）与胸腺嘧啶（）与胸腺嘧啶（300mmol300mmolL L）反应）反应(fnyng)(fnyng)，在欧文氏菌，在欧文氏菌AJZ992AJZ992所产生的嘌所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5-5-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。甲基尿苷，然后经化学法合成
39、胸苷。第41页/共64页第四十二页，共65页。第42页/共64页第四十三页，共65页。（二）阿糖腺苷（二）阿糖腺苷（Adenine arabinosideAdenine arabinoside）1 1、结构与性质、结构与性质 阿阿糖糖腺腺苷苷的的化化学学名名称称为为9-D-9-D-阿阿拉拉伯伯呋呋喃喃糖糖腺腺嘌嘌呤呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早早在在19601960年年就就在在实实验验室室合合成成了了阿阿糖糖腺腺苷苷，19691969年年美美国国用用Streptomyces Streptomyces antibioticus antibioticus NRRL3238NRR
40、L3238菌菌株株，19721972年年日日本本(r(r bn)bn)用用StreptoStreptomyces myces hebacecus hebacecus 43344334菌菌株株发酵法分别制备了阿糖腺苷。发酵法分别制备了阿糖腺苷。19791979年年用用从从E EColiColi中中分分离离得得到到的的尿尿嘧嘧啶啶磷磷酸酸化化酶酶和和嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶，以以固固相相酶酶的的方方法法将将阿阿糖糖脲脲苷苷转转化化为为阿糖腺苷。阿糖腺苷。第43页/共64页第四十四页，共65页。2 2、生产工艺、生产工艺 酶酶-化学合成法化学合成法 最最新新的的阿阿糖糖腺腺苷苷的的合合成成法
41、法是是酶酶-化化学学合合成成法法：用用尿尿苷苷为为原原料料经经氧氧氯氯化化磷磷和和二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺反反应应，生生成成氧氧桥桥化化合合物物，在在碱碱性性水水溶溶液液中中水水解解(shuji)(shuji)成成阿阿糖糖尿尿苷苷，然然后后利利用用阿阿糖糖尿尿苷苷中中的的阿阿拉拉伯伯糖糖经经酶酶法法转转化化成成阿阿糖糖腺腺苷。苷。经经选选育育从从阿阿糖糖尿尿苷苷酶酶法法合合成成阿阿糖糖腺腺苷苷的的优优秀秀菌菌株株是是产产气气肠肠杆杆菌菌（EnterbacteraerogensEnterbacteraerogens），这这株株菌菌能能产产生生尿尿苷苷磷磷酸酸化化酶酶（UpaseUpase）和和嘌
42、嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶（PynpasePynpase），用用这这个个菌菌株株的的休休止止细细胞胞作作为为酶酶源源，从从阿阿糖糖尿尿苷苷和和腺腺嘌嘌呤呤能能高高效效地地合合成成阿阿糖糖腺腺苷苷，菌菌体体也也可可制制成固定化细胞进行连续生产。成固定化细胞进行连续生产。第44页/共64页第四十五页，共65页。第45页/共64页第四十六页，共65页。第46页/共64页第四十七页，共65页。l以以5-AMP5-AMP为原料为原料(yunlio)(yunlio)的化学合成的化学合成3 3、作用、作用(zuyng)(zuyng)与用途与用途 阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱阿糖腺苷是近年来引人注目的广
43、谱DNADNA病毒抑制剂，病毒抑制剂，对单纯疱疹对单纯疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNADNA病病毒，在体内外都有明显抑制作用毒，在体内外都有明显抑制作用(zuyng)(zuyng)。目前认为，。目前认为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用阿糖腺苷在体内受激酶作用(zuyng)(zuyng)生成的阿糖生成的阿糖腺三磷，是脱氧腺三磷（腺三磷，是脱氧腺三磷（dATPdATP）的拮抗物，从而阻抑）的拮抗物，从而阻抑了以了以dATPdATP为底物的病毒为底物的病毒DNADNA聚合酶的活力。而且阿
44、糖腺聚合酶的活力。而且阿糖腺三磷对于病毒三磷对于病毒DNADNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。选择性。第47页/共64页第四十八页，共65页。（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷1 1、结构与性质、结构与性质 三三氮氮唑唑核核苷苷商商品品名名病病毒毒唑唑，对对DNADNA病病毒毒，RNARNA病病毒毒都都有有广广泛泛作作用。本品为白色结晶，熔点用。本品为白色结晶，熔点174174176176，易溶于水。，易溶于水。这这个个化化合合物物经经X X线线解解析析，它它的的
45、立立体体结结构构与与腺腺苷苷、鸟鸟苷苷非非常常类类似似，在在体体内内被被磷磷酸酸化化成成三三氮氮唑唑核核苷苷酸酸，抑抑制制肌肌苷苷酸酸脱脱氢氢酶酶阻阻断断鸟鸟苷苷酸酸的的生生物物合合成成(hchng)(hchng)，从从而而抑抑制制病病毒毒DNADNA合合成成(hchng)(hchng)。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。第48页/共64页第四十九页，共65页。2 2、生产工艺、生产工艺 酶酶合合成成法法 使使用用产产气气肠肠杆杆菌菌(gnjn)(gnjn)，以以（尿尿苷苷）肌苷和肌苷和TCATCA为底物可以用酶法简易地合成
46、三氮唑核苷。为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷。采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶(m dn)核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。第49页/共64页第五十页，共65页。（四四）阿阿糖糖胞胞苷苷（CytarabineCytarabine，Cytosine Cytosine arabinosidearabinoside，Arabinosyl CytosineArabinosyl Cytosine，AracytidineAracytidine）11、结构与性质、结构与性质 阿阿糖糖胞胞苷苷又又称称胞胞嘧嘧啶啶阿阿拉拉伯伯糖糖苷苷，糖糖的的组组成成部部分分是是阿阿拉拉伯伯糖糖。白白
47、色色或或类类自自色色结结晶晶性性粉粉末末，无无臭臭，易易溶溶于于水水，略略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿阿糖糖胞胞苷苷进进入入体体内内转转变变为为阿阿糖糖胞胞苷苷酸酸，抑抑制制DNADNA聚聚合合酶酶，阻阻止止胞胞二二磷磷转转变变为为脱脱氧氧胞胞二二磷磷从从而而抑抑制制DNADNA的的合合成成，干扰干扰(gnro)DNA(gnro)DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射。第50页/共64页第五十一页，共65页。2 2、生产工艺、生产工艺(gngy)(gngy)以以5 5CMPCMP为原料的合成法为原料的合成法（1 1）工艺）
48、工艺(gngy)(gngy)路线：路线：第51页/共64页第五十二页，共65页。第52页/共64页第五十三页，共65页。（2 2）工艺过程：）工艺过程：水水解解：并并加加入入处处理理好好的的6.5L 6.5L 氢氢氧氧化化镧镧凝凝胶胶，总总体体积积为为7.5L7.5L，升升温温至至9090，在在不不断断搅搅拌拌下下，于于pH9pH9下下进进行行水水解解。在在不不同同的的反反应应时时间间内内，均均匀匀取取出出2mL2mL凝凝胶胶溶溶液液，离离心心分分离离，取取上上清清液液5 5至至10l10l，pH9.2pH9.2电电泳泳分分析析，检查水解程度检查水解程度(chngd)(chngd)。氧桥化：氧
49、桥化后总氧桥化：氧桥化后总ODOD光谱高峰位置移至光谱高峰位置移至264nm264nm（pH2pH2）氨解：使氧桥断裂氨解：使氧桥断裂33，5-5-乙酰基脱落乙酰基脱落 。成盐：成盐：2 2盐酸盐酸-甲醇甲醇 以葡萄糖酸钙为原料的合成路线以葡萄糖酸钙为原料的合成路线 第53页/共64页第五十四页，共65页。第54页/共64页第五十五页，共65页。（五五）聚聚 肌肌 胞胞 苷苷 酸酸（聚聚 肌肌 胞胞）（PoyinosinicPoyinosinic，Polycytidylic AcidPolycytidylic Acid，Poly1Poly1：C C）1 1、结构与性质、结构与性质 196719
50、67年年美美国国人人FieldField发发现现聚聚肌肌胞胞是是干干扰扰素素诱诱导导物物，而而且且具具有有广广谱谱抗抗病病毒毒作作用用。本本品品是是人人工工合合成成的的干干扰扰素素诱诱导导剂剂，系系由由多多聚聚肌肌苷苷酸酸和和多多聚聚胞胞苷苷酸酸组组成成的的双双股股多多聚聚核核苷苷酸。本品可溶于酸。本品可溶于0.850.85氯化钠溶液氯化钠溶液(rngy)(rngy)。2 2、生产工艺、生产工艺7070年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：底物底物5-5-核苷二磷酸吡啶盐的制备核苷二磷酸吡啶盐的制备第55页/共64页第五十六页，共65页。（3）