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1、会计学1细胞培养第次细胞分离与纯化和细胞系细细胞培养第次细胞分离与纯化和细胞系细胞克隆胞克隆我的细胞培养计划我的细胞培养计划（手写和打印均可）（手写和打印均可）注意事项：注意事项：1 1、作业上交时间及地点：、作业上交时间及地点：时间：校历第时间：校历第1515周（周（09.12.1809.12.18）前）前 地点：地点：104104馆三楼（组胚教研室）馆三楼（组胚教研室）2 2、作业必须标明的项目：、作业必须标明的项目：题题 目目学号学号 姓名姓名 专业专业 导师导师本作业作为成绩评定依据之一本作业作为成绩评定依据之一第1页/共70页体外培养的原理与技术体外培养的原理与技术薛庆善薛庆善 主编
2、主编广西医科大学组胚教研室广西医科大学组胚教研室何少健何少健电话：电话：1336780594913367805949；0771-5358577(0771-5358577(办办)E-mail:heshaojian2002sina.E-mail:第2页/共70页体外培养的基本原理与技术体外培养的基本原理与技术一、从体内生存环境到体外生长条件一、从体内生存环境到体外生长条件二、体外培养的基本方法和过程二、体外培养的基本方法和过程三、体外培养物的生长生物学三、体外培养物的生长生物学四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化五、细胞系（株）、细胞克隆五、细胞系（株）、细胞克隆六、培养物的观察检测方法六、培养物
3、的观察检测方法第3页/共70页四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得从有机体组织分离得到的细胞悬液以及从动物体液获得的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。的细胞一般都包含多种细胞成分，为异质性的混合物。而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特而进行体外细胞培养的目的，不外乎研究特定细胞的特性、功能或其它特殊用途，故一般必须获取分离开的和尽可性、功能或其它特殊用途，故一般必须获取分离开的和尽可能均一的细胞群体。能均一的细胞群体。在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备在进行体外细胞培养时，不仅要将拟培养组织材料制备成成分离（
4、离散）的细胞（分离（离散）的细胞（dissociated celldissociated cell），），以细胞悬液以细胞悬液的形式接种并培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中的形式接种并培养，更重要的是从所制备的细胞悬液中分离分离(separation or isolation)(separation or isolation)出成分尽可能单一的细胞用于出成分尽可能单一的细胞用于培养。培养。第4页/共70页细胞分离（细胞分离（cell separation)cell separation)指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目指的是将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。
5、（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针的细胞的过程。（细胞分离是针对于细胞成分而言，而不针对生物化学成分）。对生物化学成分）。细胞纯化（细胞纯化（cell purification)cell purification)强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或强调从原代培养前、成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培通过细胞分离和纯化过程，使得培养物成为单一型培养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即养物，甚至是遗传特性完全一致的培养物，后者即细胞系细胞系（cell line）或或
6、细胞株细胞株。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化第5页/共70页分离和纯化两概念之间没有截然的界限。许多情分离和纯化两概念之间没有截然的界限。许多情况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只况下，细胞分离和纯化并不是完全彻底的，培养物中只能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度，所以也常称为常称为富集（富集（enrichmentenrichment）。）。分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与进行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继代培
7、养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离继代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与纯化细胞的目的。与纯化细胞的目的。培养物中细胞成分是否单一或者培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞目的细胞在培养在培养物中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的物中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重要指标重要指标。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化第6页/共70页根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动控制的特别是电脑控制的尖端仪器。
8、控制的特别是电脑控制的尖端仪器。从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到从成分混杂的细胞悬液中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样特性而实现的，或者是利用细胞的而实现的，或者是利用细胞的物理特性物理特性如密度、体积、电如密度、体积、电荷等，或者是利用细胞的荷等，或者是利用细胞的生物学特性生物学特性如特异性表面标志和如特异性表面标志和功能。功能。四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化第7页/共70页1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离2.2.利用细胞体积
9、和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据细胞表面电荷的细胞分离方法4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法6.6.利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法四、细胞分离与纯化四、细胞分离与纯化第8页/共70页1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬液，然后接种并培
10、养，是原代培养的液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法最常规方法。由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培养），在培养的组织块大于养），在培养的组织块大于1 mm1 mm3 3时，培养过程中时，培养过程中只有只有位位于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育
11、。于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。第9页/共70页1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块由于受组织内部的纤维成分的束缚，能够从植块内部迁移出来的细胞很少。大部分位于植块内部的细内部迁移出来的细胞很少。大部分位于植块内部的细胞会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和胞会因营养物质和气体渗透困难而缺乏营养和O O2 2供应，供应，以致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以以致生长发育不良或者死亡，这也是植块培养法难以进行长期体外培养的进行长期体外培养的主要原因主要原因。第10页/共70页
12、为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织块内部细胞与细胞之间的织块内部细胞与细胞之间的“组织关系组织关系”解除，将细胞解除，将细胞“解放解放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细细胞分离（离散）胞分离（离散）或或分散（分散（cell dissociation)cell dissociation)。细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化，但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分离和纯化细
13、胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离和纯化的。和纯化的。将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯将所切取的组织制备成细胞悬液，是细胞分离和纯化的基础。化的基础。1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离第11页/共70页如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对如何通过不同的机械分离与酶学解离方法实现对目目的细胞的细胞一定程度的分离纯化呢？一定程度的分离纯化呢？一方面一方面，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞，可根据所取组织的细胞构成，尤其是细胞的大小不同进行分离纯化；的大小不同进行分
14、离纯化；另一方面另一方面，根据不同组织的，根据不同组织的细细胞间质胞间质特性不同而实现。特性不同而实现。在每一次培养接种时，应尽量先以各种方法使得细在每一次培养接种时，应尽量先以各种方法使得细胞悬液中胞悬液中目的细胞目的细胞之比例提高。之比例提高。为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地为实现此目的，可从下列步骤的进行中最大限度地获得获得目的细胞目的细胞。1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离第12页/共70页（1 1）取材）取材取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得取材是整个体外培养过程的开始。准确的取材是获得某一特定培养对象
15、的某一特定培养对象的关键关键。在切取动物组织块时，要在切取动物组织块时，要尽量剔除尽量剔除所附带的其它组织所附带的其它组织和残余结构。和残余结构。（2 2）机械分离过程）机械分离过程在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞在机械分离所取组织的过程中，能够进行初步的细胞分离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，分离纯化的手段之一，就是按照组织内不同细胞的大小差异，以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞。1)1)网搓法：网搓法：2 2）细胞悬液过滤：）细胞悬液过滤：1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程
16、中的细胞分离第13页/共70页（3 3）用酶学方法分离纯化）用酶学方法分离纯化用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是：不同组用酶学方法达到部分分离纯化的主要依据是：不同组织的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质织的细胞和间质的构成不同。例如，上皮组织的细胞间质少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是少，间质内的纤维成分少，最有效的蛋白酶是胰蛋白酶胰蛋白酶。而结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消而结缔组织、肌肉组织的细胞间质中纤维成分较多。要消化结缔组织、肌肉组织中的间质成分，需要使用化结缔组织、肌肉组织中的间质成分，需要使用胶原酶胶原酶和和其它酶其它酶，胰蛋白酶的消化作用
17、不明显。，胰蛋白酶的消化作用不明显。（4 4）培养过程中的选择性分离）培养过程中的选择性分离 在体外分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自在体外分散细胞培养过程中，培养物本身有一种自然纯化的特性。然纯化的特性。1)1)机械刮除法：机械刮除法：2 2）选择性酶消化法：）选择性酶消化法：1.1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离第14页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的细胞可视为一种完整的颗粒并且表现出与此有关的物物理性状理性状。不同类型细胞的物理性
18、状可能互不相同，这些差异。不同类型细胞的物理性状可能互不相同，这些差异正是部分或完全地分离纯化细胞的依据之一。正是部分或完全地分离纯化细胞的依据之一。基于基于物理性状物理性状的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞的细胞分离纯化技术，由于无需对细胞进行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要进行化学处理，也不像多数生物学方法那样需要抗原抗原抗体抗体、受体受体配体配体相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技相互作用，故可避免细胞发生变化，因而这类技术具有其自身的优越性。术具有其自身的优越性。细胞分离纯化中细胞分离纯化中最常利用最常利用的物理性状是的物理性状是细胞的体积细胞的体积（大小）、（大小）、密度
19、密度和和表面电荷表面电荷。第15页/共70页利用细胞利用细胞体积体积和和密度密度进行分离纯化的技术均基于进行分离纯化的技术均基于沉降沉降作用作用。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用。不同类型细胞往往具有不同的体积和密度，可以采用沉降技术将其分离开来。沉降技术将其分离开来。其基本原理是其基本原理是，悬液中细胞的沉降，悬液中细胞的沉降率与率与细胞体积细胞体积、细胞密度细胞密度和其周围和其周围介质密度介质密度之差成正比。之差成正比。应用沉降技术，使之应用沉降技术，使之沉降的沉降的细胞的密度细胞的密度应该比介质大，应该比介质大，而使之而使之漂浮的漂浮的细胞的密度细胞的密度则应比介质小。因此
20、，实施沉降技则应比介质小。因此，实施沉降技术分离纯化细胞的术分离纯化细胞的关键在于关键在于选择选择密度梯度形成介质密度梯度形成介质，故沉降，故沉降技术也称为技术也称为密度梯度（离心）技术密度梯度（离心）技术。2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法第16页/共70页选择选择密度梯度形成介质密度梯度形成介质的的一般原则一般原则是：是：所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围；所形成溶液的密度应包括所需要的密度范围；形成的溶液黏度较低；形成的溶液黏度较低；具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）；具有某些性质如折射率，据此可测定它的浓度（或密度）；不
21、损伤细胞或不改变细胞的生物学特性；不损伤细胞或不改变细胞的生物学特性；离心分离后易于除去；离心分离后易于除去；不妨碍分离组分的分析。不妨碍分离组分的分析。按照上述原则来选择，分离细胞常用的按照上述原则来选择，分离细胞常用的密度梯度形成介质密度梯度形成介质有：有：（1 1）牛血清白蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albuminbovine serum albumin，BSA)BSA)（2 2）聚蔗糖聚蔗糖（polysucrosepolysucrose）（3 3）泛影酸盐泛影酸盐（DiatrizoateDiatrizoate）（4 4）硅胶颗粒硅胶颗粒2.2.利用细胞体积和密度进行分离
22、纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法第17页/共70页（1 1）牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（bovine serum albuminbovine serum albumin，BSA)BSA)由于由于BSABSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但续或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSABSA黏度很高，分离细黏度很高，分离细胞必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介胞必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质取代。质取代。（2 2）聚蔗糖
23、（聚蔗糖（poly-sucrosepoly-sucrose）是一种合成的蔗糖聚合物，是一种合成的蔗糖聚合物，商品名商品名叫叫FicollFicoll,常用的是：常用的是：M Mr r400 400 000 Pa000 Pa,名为名为Ficoll 400Ficoll 400。FicollFicoll不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，不渗入生物膜，渗透压也很小，不影响细胞活性和酶活性，但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度但其渗透毒性有随浓度成指数增加的趋势，且高浓度FicollFicoll溶液的黏度溶液的黏度大，可导致细胞凝集，故常以低浓度大，可导致细胞凝集，故常以低浓
24、度FicollFicoll和其它物质如泛影酸盐合用和其它物质如泛影酸盐合用以增加溶液的密度。以增加溶液的密度。Ficoll 400Ficoll 400是目前常用的细胞分离介质之一，商品是目前常用的细胞分离介质之一，商品含量为含量为4040（w wV V），也可用），也可用FicollFicoll干粉来配制。干粉来配制。2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法第18页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法（3 3）泛影酸盐泛影酸盐泛影酸盐泛影酸盐离子强度低，可配制成高密度而低渗透毒性的溶液，离子强度低，可
25、配制成高密度而低渗透毒性的溶液，而且黏度比而且黏度比FicollFicoll小，很适合密度梯度分离细胞，常与小，很适合密度梯度分离细胞，常与FicollFicoll配合配合使用。使用。国外常用商品国外常用商品IsopaqueIsopaque或称或称Triasil(sodium metrizoate)Triasil(sodium metrizoate)和和Hypaque(sodium diatrizoateHypaque(sodium diatrizoate），与），与FicollFicoll配制的溶液商品名为配制的溶液商品名为Ficoll-Isopaque(Triosil)Ficoll-Iso
26、paque(Triosil)或或Ficoll-HypaqueFicoll-Hypaque，泛影酸盐价格较贵。，泛影酸盐价格较贵。国内常用造影剂泛影葡胺（国内常用造影剂泛影葡胺（meglumini diatrizoicimeglumini diatrizoici）代替，）代替，其商品名为其商品名为Urografin,Urografin,含量通常为含量通常为60%60%或或75%,75%,其与其与FicollFicoll配制的溶配制的溶液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度液商品名是淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），密度1.0771.077士士0.0010.001，主要用于人单个核细胞的分离
27、。，主要用于人单个核细胞的分离。第19页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法（4 4）硅胶颗粒硅胶颗粒 用用聚乙烯毗咯烷酮聚乙烯毗咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP)polyvinylpyrolidone,PVP)包被包被硅胶颗粒硅胶颗粒，商品名为商品名为PerPerc colloll。PerPerc colloll具有以下具有以下优点优点：稳定性很好，可长期保存；稳定性很好，可长期保存；密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度；密度稀释范围较大，可包括大多数哺乳动物细胞的密度；在溶液内产生的渗透压很小，故在全部
28、密度范围内能保持等张；在溶液内产生的渗透压很小，故在全部密度范围内能保持等张；黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时黏度低，即使在最大密度时也是如此，因此用较小的离心力和较短的时间就可达良好的分离效果；间就可达良好的分离效果；对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去；对细胞无毒性，且易于从细胞制剂中洗涤除去；在高速离心（在高速离心（1010，000 r/min)000 r/min)时，可形成连续密度梯度；时，可形成连续密度梯度；价廉，分离细胞时用量少。价廉，分离细胞时用量少。因此，因此，PercollPercoll是一种很优良的分离介质，是现在用于分离多种哺是一种很优良
29、的分离介质，是现在用于分离多种哺乳动物细胞的乳动物细胞的最常用介质之一最常用介质之一。商品商品PercollPercoll的密度一般为（的密度一般为（1.131.13士士0.0050.005）第20页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法不同细胞的分离方法：不同细胞的分离方法：A.A.一步一步密度梯度离心法密度梯度离心法B.B.等等密度梯度离心法密度梯度离心法C.C.速度沉降法速度沉降法D.D.离心淘析分离技术离心淘析分离技术血细胞的分离血细胞的分离玫瑰花环细胞的分离玫瑰花环细胞的分离连续连续BSABSA密度梯度离心法密度梯度离心法非连续非连
30、续BSABSA密度梯度离心法密度梯度离心法连续连续PercollPercoll密度梯度离心法密度梯度离心法非连续非连续PercollPercoll密度梯度离心法密度梯度离心法低速离心速度沉降法低速离心速度沉降法单位重力沉降法单位重力沉降法简单重力沉降法分离白细胞与红细胞简单重力沉降法分离白细胞与红细胞简单重力沉降法分离粒细胞简单重力沉降法分离粒细胞第21页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法A.A.一步密度梯度离心法：一步密度梯度离心法：一步密度梯度离心法分离细胞的一步密度梯度离心法分离细胞的依据依据是细胞的是细胞的密度密度和和体积体积。将
31、细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，将细胞悬液加于一种高密度介质上，应用低速离心，密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介密度大于介质的细胞通过介质而沉淀于管底，而密度低于介质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体质的细胞则滞留于介质之上，体积较大的细胞沉降较快，体积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞积较小的细胞沉降较慢，从而将具有不同密度和大小的细胞分离开来。分离开来。一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花一步密度梯度离心法常用于分离血细胞和形成玫瑰花环的淋巴细胞。环的淋巴细胞。一步密度梯度法常用的分离介质是：一步密度梯度法常用的分离介
32、质是：Ficoll-Hypaque,Ficoll-Hypaque,也可用也可用Percoll,Percoll,动物血清动物血清,BSA,BSA等。等。第22页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法B.B.等密度梯度离心法等密度梯度离心法等密度梯度离心法分离细胞的等密度梯度离心法分离细胞的依据依据是细胞的是细胞的密度密度。在在等密度连续梯度等密度连续梯度分离中，细胞在强离心力的作用下，分离中，细胞在强离心力的作用下，通过密度逐渐增高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细通过密度逐渐增高的介质沉降，当其到达某一沉降距离，细胞的密度恰好等于梯度介质的
33、密度，因此沉降速度为胞的密度恰好等于梯度介质的密度，因此沉降速度为0 0。在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不在平衡状态下，细胞在此特定位置形成一条区带而不再继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的再继续沉降，所以具有不同密度的细胞群体便在梯度介质的不同位置上形成区带。不同位置上形成区带。因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的因此，等密度梯度离心法分离细胞仅仅依赖于细胞的密度。反过来，通过测定细胞停留处梯度介质的密度，可以密度。反过来，通过测定细胞停留处梯度介质的密度，可以确定细胞的密度。确定细胞的密度。第23页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法
34、利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法B.B.等密度梯度离心法等密度梯度离心法非连续非连续密度梯度离心法密度梯度离心法分离细胞的原理与分离细胞的原理与连续连续密度梯密度梯度离心法度离心法是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。是相同的，但细胞集中在介质和介质之间的界面上。等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快等密度梯度离心法采用强离心力，其目的仅仅是加快达到平衡的速度和减少扩散的混合效应。达到平衡的速度和减少扩散的混合效应。虽然细胞体积的大小可影响建立平衡的速度，但不影虽然细胞体积的大小可影响建立平衡的速度，但不影响达到平衡时细胞在梯度上所处的位置。响达到平衡时细胞在梯度上所处的位
35、置。应用本技术分离细胞常用的梯度介质有应用本技术分离细胞常用的梯度介质有BSABSA和和PercollPercoll。因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用。因为建立平衡的速度与介质的黏度成反比，故采用PercollPercoll等低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可等低黏度介质所制备的密度梯度离心分离细胞，可在低离心力、短时间内达到平衡。在低离心力、短时间内达到平衡。第24页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法C.C.速度沉降法速度沉降法在速度沉降中，细胞的体积和密度共同影响细胞的分在速度沉降中，细胞的体积和密度共同影响细胞的
36、分级分离，但级分离，但细胞体积细胞体积为主要决定因素。为主要决定因素。细胞在单位重力下通过低密度介质（约细胞在单位重力下通过低密度介质（约1.01 g/ml1.01 g/ml）沉降，或在低离心力（通常为沉降，或在低离心力（通常为100 g100 g）作用下通过密度梯度）作用下通过密度梯度层而沉降，此种细胞分离方法即速度沉降。层而沉降，此种细胞分离方法即速度沉降。前者称为单位重力沉降法，后者即所谓低速离心速度前者称为单位重力沉降法，后者即所谓低速离心速度沉降法。沉降法。第25页/共70页2.2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法D.D.离心淘析分离技术离心淘
37、析分离技术离心淘析（离心淘析（centrifugal elutriationcentrifugal elutriation）分离技术是通）分离技术是通过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相过含细胞介质溶液的流力和浮力与细胞所受离心力之间相互作用而分离细胞的一种技术。互作用而分离细胞的一种技术。第26页/共70页3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据细胞表面电荷的细胞分离方法细胞表面均带有电荷，在电场中可向一定的方向泳动，细胞表面均带有电荷，在电场中可向一定的方向泳动，此即细胞电泳。细胞在电场中的泳动速度与其所带电荷密此即细胞电泳。细胞在电场中的泳动速度与其所带电荷密度有关。度有
38、关。在生理在生理pHpH条件下，绝大多数细胞带负电荷，在电场中条件下，绝大多数细胞带负电荷，在电场中将向正极泳动，但不同细胞所带负电荷密度不同，故在电将向正极泳动，但不同细胞所带负电荷密度不同，故在电场中泳动速度不同，据此可将不同类型的细胞分离开。场中泳动速度不同，据此可将不同类型的细胞分离开。电泳分离细胞需要特殊的仪器设备。用于细胞电泳的电泳分离细胞需要特殊的仪器设备。用于细胞电泳的仪器型号很多，其操作原理也不尽相同。某些仪器仅用于分仪器型号很多，其操作原理也不尽相同。某些仪器仅用于分析，有些则既可用于分析，也可用于制备。析，有些则既可用于分析，也可用于制备。用于制备目的用于制备目的最常用的
39、细胞电泳技术最常用的细胞电泳技术是是自由流动电泳自由流动电泳和和密度梯度电泳密度梯度电泳。第27页/共70页1.1.自由流动电泳分离技术自由流动电泳分离技术采用自由流动电泳仪可以进行细胞的连续分离，目前多用的采用自由流动电泳仪可以进行细胞的连续分离，目前多用的仪器是仪器是EIPhor VaPEIPhor VaP细胞电泳仪。细胞电泳仪。细胞电泳分离技术已用于人和动物细胞电泳分离技术已用于人和动物T,BT,B淋巴细胞及其它一些细淋巴细胞及其它一些细胞的分离，尤其以分离大鼠胞的分离，尤其以分离大鼠T,BT,B淋巴细胞比较成功。淋巴细胞比较成功。优缺点：细胞电泳分离技术的优点是所分离的细胞完整无损，优
40、缺点：细胞电泳分离技术的优点是所分离的细胞完整无损，活性较高，保持原来的生物学特性，可用于许多方面的研究。其不活性较高，保持原来的生物学特性，可用于许多方面的研究。其不足之处是分离方法还不太理想，重复性较差，设备复杂且价格昂贵，足之处是分离方法还不太理想，重复性较差，设备复杂且价格昂贵，故一直未能推广应用。故一直未能推广应用。2.2.密度梯度电泳分离技术密度梯度电泳分离技术密度梯度电泳分离法是用聚蔗糖或聚蔗糖蔗糖制成密度梯密度梯度电泳分离法是用聚蔗糖或聚蔗糖蔗糖制成密度梯度进行电泳分离细胞的技术，样品经分离后，不同的细胞群体在此度进行电泳分离细胞的技术，样品经分离后，不同的细胞群体在此梯度上形
41、成稳定的区带。常用的密度梯度电泳仪是梯度上形成稳定的区带。常用的密度梯度电泳仪是Buchler Poly-Buchler Poly-Prep 200Prep 200电泳仪。电泳仪。密度梯度电泳技术分离细胞方法复杂，设备价格昂贵，现在密度梯度电泳技术分离细胞方法复杂，设备价格昂贵，现在应用并不广泛。应用并不广泛。3.3.根据细胞表面电荷的细胞分离方法根据细胞表面电荷的细胞分离方法第28页/共70页4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，是某些黏附于某些固相物质如玻璃或塑料的表面，是某些类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺
42、乏这类型细胞的基本生物学特性之一，但另一些细胞却缺乏这种能力；或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一种能力；或某些细胞的黏附能力强、黏附作用快，而另一些细胞黏附能力弱或黏附作用慢。些细胞黏附能力弱或黏附作用慢。根据这种差异，可用下列方法根据这种差异，可用下列方法分离分离或或消除消除某些类型某些类型的细胞。的细胞。A.A.差速黏附处理差速黏附处理B.B.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10G-10过柱法过柱法C.C.羰基铁粉法羰基铁粉法D.D.尼龙毛分离法尼龙毛分离法第29页/共70页4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法A.A.差速黏附处理差速黏附处理根据不同细胞在玻
43、璃或塑料培养瓶皿表面上黏附能力根据不同细胞在玻璃或塑料培养瓶皿表面上黏附能力的差异，将异质性细胞悬液接种在培养瓶皿内，在培养箱的差异，将异质性细胞悬液接种在培养瓶皿内，在培养箱内孵育一定时间；使细胞悬液中黏附能力较强的细胞先黏内孵育一定时间；使细胞悬液中黏附能力较强的细胞先黏附在瓶皿的壁上，然后收集尚未黏附的细胞或者已经黏附附在瓶皿的壁上，然后收集尚未黏附的细胞或者已经黏附的细胞，再用于种植和培养。这种将黏附较快的细袍与黏的细胞，再用于种植和培养。这种将黏附较快的细袍与黏附较慢（或无黏附能力）的细胞分开并分别收集的处理过附较慢（或无黏附能力）的细胞分开并分别收集的处理过程就称为程就称为差速黏附
44、处理差速黏附处理。差速黏附处理差速黏附处理常用于分离常用于分离细胞悬液中的细胞悬液中的成纤维细胞成纤维细胞与与其它组织细胞。另外，像其它组织细胞。另外，像巨噬细胞巨噬细胞之类的具有强黏附能力之类的具有强黏附能力的细胞也常借此方法而与其它黏附能力较差的细胞相分离。的细胞也常借此方法而与其它黏附能力较差的细胞相分离。第30页/共70页B.B.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10G-10过柱法过柱法4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法葡聚糖（葡聚糖（sephadexsephadex）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成）是葡萄糖的聚合物，在水中膨胀时可形成凝胶。葡聚糖凝胶。葡
45、聚糖G-10G-10凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但凝胶具有极小的微孔，常用于分离生物大分子，但也可用来分离细胞。也可用来分离细胞。其分离细胞的其分离细胞的原理原理是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚是：利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶从而将异质性细胞悬液中的具黏附能力的细胞去除。糖凝胶从而将异质性细胞悬液中的具黏附能力的细胞去除。C.C.羰基铁粉法羰基铁粉法用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中用羰基铁粉处理，能有效地去除异质性细胞悬液中具有黏附能具有黏附能力力的细胞。的细胞。该法的该法的基本原理基本原理是：把铁粉加是：把铁粉加入入异质性细胞悬液中后，具有黏异质性
46、细胞悬液中后，具有黏附活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其附活性的细胞将黏附于铁粒子，在器皿外用磁铁将铁粒子连同黏附其上的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。上的细胞吸至底部，收获细胞悬液，即为去除了黏附细胞的细胞制剂。此法此法通常用于通常用于去除免疫细胞悬液中的去除免疫细胞悬液中的单核巨噬细胞单核巨噬细胞。在此情。在此情况下，单核巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。况下，单核巨噬细胞可吞噬铁粒子，这一特性也有助于将其清除。第31页/共70页4.4.基于不同黏附特性的细胞分离方法基于不同黏附特性的细胞分离方法D.D.尼龙毛分离法尼龙毛分离
47、法 尼龙毛尼龙毛(nylon wool)(nylon wool)就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱就是聚酰胺纤维。应用尼龙毛柱可从混合白细胞悬液中获得富含可从混合白细胞悬液中获得富含T T淋巴细胞的制剂。淋巴细胞的制剂。其其基本原理基本原理是：是：B B淋巴细胞和单核巨噬细胞易黏附淋巴细胞和单核巨噬细胞易黏附于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，于尼龙毛表面，当白细胞悬液通过尼龙毛柱时，B B淋巴细淋巴细胞、浆细胞及单核巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能胞、浆细胞及单核巨噬细胞将黏附于柱上，而无黏附能力的力的T T细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获细胞则通过柱子，收集流出的细胞即获T T淋巴细胞。
48、淋巴细胞。此法此法主要用于主要用于从淋巴细胞中从淋巴细胞中分离分离T T淋巴细胞淋巴细胞和和B B淋巴细淋巴细胞胞或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除或从白细胞或单个核细胞中纯化或去除T T淋巴细胞。淋巴细胞。第32页/共70页5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体根据细胞表面标志的不同，利用相应的抗体特别是单克隆抗体和配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。和配体，已经建立了多种基于亲和原理的细胞分离纯化方法。从理论上讲，根据表面标志的细胞分离方法应该是获得高纯度从理论上讲，根据表面标志的细
49、胞分离方法应该是获得高纯度细胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证细胞群或细胞亚群的最可靠、最有发展前途的分离技术，而实践也证明的确如此。明的确如此。A.A.免疫溶解法免疫溶解法B.B.盘化法盘化法C.C.凝集素凝集法凝集素凝集法D.D.玫瑰花环分离法玫瑰花环分离法E.E.流式细胞分选术流式细胞分选术F.F.免疫磁珠分离技术免疫磁珠分离技术第33页/共70页5.5.利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法A.A.免疫溶解法：免疫溶解法：免疫溶解法也称免疫消除法。免疫溶解法也称免疫消除法。当补体存在时当补体存在时，用抗细胞某一表面标，用抗细胞某一表
50、面标志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志志的特异性抗体与异质性细胞一起孵育，可以使具有该特异性表面标志的细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和的细胞溶解。利用这一原理，将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的补体加入细胞悬液或细胞培养物中，使抗体及补体作用于具相应抗原的细胞并溶解之。细胞并溶解之。B.B.盘化法（盘化法（panningpanning）：是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可是一种在固相表面进行亲和分离细胞的技术，它利用蛋白质分子可吸附于聚苯乙烯塑料表面和