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1、1993年诺贝尔化学奖Kary mullisPCR 技术The method of polymerase chain reaction 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）一个非常简单，然而却是很有用的体外DNA聚合反应。PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应，就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。凯利穆利斯（KaryMullis1944）1944年12月28日出生于美国北卡罗来纳州的
2、勒诺。穆利斯在南卡罗来纳州的一个小镇度过了童年，成长环境非常宽松，使他享有充分的自由和空间，这为他性格的形成提供了条件。1962年他在佐治亚州理工学院学习化学，获学士学位；19661972在加州大学伯克利分校攻读生物化学博士学位；接着，先后在堪萨斯大学医学院和加州大学旧金山分校作博士后；1979年任职于Cetus公司，其间发明了PCR技术。19861988年任Xytronyx公司分子生物学部主任。从1987年开始在加州任PCR技术与核酸化学的非官方顾问。他现在是加州奥克兰儿童医院和研究所的知名专家，并为几家公司作科学顾问。19世纪50年代，Khorana合成了寡聚核苷酸，同时，他利用合成的寡聚
3、核苷酸DNA合成酶以及DNA，开发出了使DNA扩增的方法。当时，这一领域的研究人员通常都使用Khorana的DNA扩增技术。可以说，这是一个司空见惯的基本技术，谁也没有去想过这种方法的不便之处。1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了 因此，30年来没有人去改革这个方法，人人都满足于这个方法。就连Mullis本人在大学做基础研究时，也没有想到要去开发一种更简便的方法，以取代Khorana的方法
4、。1979年，穆利斯进入Cetus公司，从事合成寡聚核苷酸的工作。1981年他担任DNA合成实验室主任，主要任务是加速和优化寡聚核苷酸的合成。80年代初DNA合成仪进入实验室，他对这台原型机提出了许多改进的意见，还试着编写新的程序。由于DNA合成仪的应用使寡核苷酸的合成效率提高10倍。这样，穆利斯能把更多的时间用于计算机上。PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。1983年4月一个周末的晚上，他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒的乡间公路上开着车，他思绪不断，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。他萌发了PCR的构想。整个周末他都在思考着PCR问题，他想DNA合成起始于DNA解链，在一
5、段寡核苷酸作为引物下，聚合酶沿着模板从引物的末端开始进行DNA的扩增，这需要人工加入核苷酸，这一过程在实验室可以实施。他还反复思考能否用两个引物来代替现行的单引物法？如果两个引物的大小不同，结果两条链的序列将同时被测定，而且互为印证；其次，他想能否分两次加入聚合酶，以防止新合成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错搭到新生链中的现象。再有，经常使用计算机使他注意到了“循环”，他也想到DNA呈指数增长的趋势；最后他还想到扩增是否具有专一性的问题，因为在合成第一次反应中，人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但穆利斯注意到在第二次及后续的链反应中，由第一次反应得到的那些“长反应产物”只能被扩延到另一引物与模
6、板DNA相结合的部位，过了那个位点，扩延反应就无法进行了（没有模板）。所以PCR产物的长度是确定的。他开始用人类神经生长因子作为目标序列进行扩增，没有结果。转而他选择PBR322质粒作为模板，实验中通过缩小反应体积来增加各成分的浓度，并将复性温度降低到32，减少每次加入的聚合酶的量，在10次循环后停止，结果他看到一条浅的带。接着，他又对方法进行了改进，增加几次循环，得到的带还是较浅。他又尝试用50kb碱基对的噬菌体做模板，用限制酶将模板降解为2000碱基对左右，扩增没有成功。他再次更换模板改用实验室合成的100碱基对的寡核苷酸作模板，对珠蛋白基因进行扩增，结果得到扩增产物。这期间Cetus公司
7、成立了PCR小组，经全体成员的共同努力，1984年11月，终于得到与预期分子完全符合的扩增量，首次取得可信的结果，证明了PCR的可行。Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不
8、少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年,Cetus公司的Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermusaquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶最大特点是耐高温，不需每次加入，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率。此酶被命名为TagDNA聚合酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。原理简介：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，D
9、NA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR技术Polymerase chain reaction循环过程1.变性：基因组DNA在95下加热30s到2min，双螺旋结构被热变性解链
10、为两股单链。2.退火：将反应混合物降温至55，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板引物复合物。3.引物延伸：迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。置反应混合物于70，延伸时间由扩增片段长度决定，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3端开始，沿着53的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。4.循环：循环次数主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多，扩增效率降低，错误掺入率增加。PCR反应基本条件反应基本条件 1.核酸模板2.引物3.dNTP4.TaqDNA聚合酶5.扩增反应缓冲液6.Mg2+操作步骤1在冰浴中，按以下次序
11、将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10PCRbuffer5ldNTPmix（2mM）4l引物1（10pM）2l引物2（10pM）2lTaq酶（2U/l）1lDNA模板（50ng-1g/l）1l加ddH2O至50l视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：9340s5830s7260s，循环30-35次，最后在72保温7min。3结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100l氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否
12、则，直接取5-10l电泳检测。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成cDNA文库；(3)从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大
13、量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。常用的几种PCR反应PCR技术有很高的实用性，其方法本身又在使用中不断地得到创新与发展，形成了一系列适用于不同目的的特殊方法。下面介绍一下几种常用的方法：反向反向PCR(Inverted-PCR,I-PCR)PCR(Inverted-PCR,I-PCR)通常，PCR反应是对一对引物之间的序列进行扩增，而反向PCR可以实现对已知序列两侧的未知序列进行扩增。因为反向PCR反应中用限制性内切、退火环化、内切的办法使序列的上下游关系发生了转变，即由上游变到下游，由中央变到了两侧。不对称不
14、对称PCR（Asymmetric PCR）典型的PCR反应产生一个特定的双链DNA拷贝，但是在基因分析中，常常需要单链DNA以利于序列测定。在扩增循环中引入不同的引物浓度，而得到了单链DNA，这种PCR方法就叫不对称PCR。不对称PCR反应不仅可通过引入不同的引物浓度来造成扩增的不对称，还可以利用两引物的退火温度的不同。在设计引物时，使引物A和引物B的退火温度相差较大，TmATmB。在最初的10-15个循环中，选择低的退火温度，使引物都发生退火；在后面的20几个循环中，升高退火温度，使其中一引物（如引物B）不能与模板退火结合，而不能引发延伸反应；而另一条链可与引物退火，继续进行扩增反应，反应结
15、束时生成大量单链DNA。通过升高退火温度使一条引物不再发挥引物作用，这与利用不同浓度引物的道理是一样的。标记引物标记引物PCR（Labeled primers PCR,LP-PCR）对引物给予某种标记，然后用此引物所进行的聚合酶链反应。标记引物PCR得以实施的理论依据是：引物5端经某种标记后并不影响正常的PCR反应。目前标记引物PCR主要用于PCR产物检测和定量，单链PCR产物的分离，反转录原位PCR及差示PCR等方面。定量定量PCR 用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后，PCR产物的量来推断样品中原始模板的量。这种定量可以是绝对的，也可以是相对的。但由于目前技术上的原因，很难获得样品中
16、某一基因的绝对数量，而往往是通过设置内参标或外参标来作相对的定量。定量PCR是以PCR扩增为基础的，而PCR扩增是有规律可循的。定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。原位原位PCR原位PCR技术是PCR技术和原位杂交技术结合的产物其基本过程是：先用合适的固定剂（通常为甲醛固定剂）对组织或细胞进行固定；然后用蛋白酶对细胞进行通透处理，以确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触；最后对DNA和RNA进行细胞内原位扩增。逆转录逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）先将RNA用逆转录酶逆转录成cDNA，然后再加入特异引物对特定片段进行扩增，扩增产物的分析与其他常见
17、PCR方法类似。RT-PCR是一种检测RNA分子的良好方法。多重多重PCR加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。如果待检测的基因片段存在，经PCR可以产生扩增区带，如果这一片段缺失，PCR反应后没有扩增区带出现。用电泳法检测，如果基因的某一区段缺失，则相应的电泳图谱上这一区带就回消失。锚定锚定PCR(Anchored PCR,A PCR)A-PCR又被称为cDNA末端快速扩增PCR(RACE-PCR)或单侧引物PCR(Single-SidedPCR)，主要用于5端序列未知的cDNA的克隆。首先添加同聚物尾于未知核酸序列的3末端，然后以合成的互补同聚物片段以及含有适当限制性核酸内切酶识别位点的锚定片段做引物，与核酸另一端的特异引物配对，使未知核酸得以扩增。以以mRNAmRNA为为模板，引物模板，引物3 3为引物，反转录成为引物，反转录成cDNAcDNA 。将反转录产物变性，在将反转录产物变性，在cDNAcDNA末端加上多聚末端加上多聚A A尾；尾；再以再以oligooligo dTdT和引物和引物3 3为引物，为引物，PCRPCR扩增。扩增。The end谢谢