《微生物的生长》课件.ppt

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1、上次教学回顾上次教学回顾第三节第三节微生物独特合成代谢途径举例微生物独特合成代谢途径举例自养微生物的自养微生物的CO2固定固定生物固氮生物固氮()肽聚糖的生物合成肽聚糖的生物合成()微生物次生代谢物的合成微生物次生代谢物的合成第四节第四节微生物的代谢调节与发酵生产微生物的代谢调节与发酵生产固氮微生物固氮微生物固氮的生化机制固氮的生化机制好氧菌固氮酶避氧害机制好氧菌固氮酶避氧害机制在在细胞质细胞质中的合成中的合成在在细胞膜细胞膜中的合成中的合成在在细胞膜外细胞膜外的合成的合成微生物的代谢调节微生物的代谢调节代谢调节在发酵生产中的应用代谢调节在发酵生产中的应用一、教学目的与要求一、教学目的与要求了

2、了解解微微生生物物的的生生长长规规律律,掌掌握握测测定定微微生生物物生生长长繁繁殖殖方法,方法,熟悉熟悉环境因素对微生物生长的影响环境因素对微生物生长的影响二、教学内容:二、教学内容:1、测定生长繁殖的方法、测定生长繁殖的方法2、微生物的生长规律、微生物的生长规律()()3、影响微生物生长的主要因素、影响微生物生长的主要因素()()4、微生物的培养法概论、微生物的培养法概论5、有害微生物的控制、有害微生物的控制()第六章第六章 微生物的生长微生物的生长第六章第六章 微生物的生长微生物的生长个体繁殖个体繁殖个体生长个体生长群体生长群体生长第一节测定生长繁殖的方法第一节测定生长繁殖的方法一、测生长

3、量一、测生长量一一)直接法直接法(粗放的粗放的)测体积法测体积法(精确的精确的)称干重法称干重法二二)间接法间接法比浊法比浊法:分光光度法,:分光光度法,450650nm波段波段生理指标法生理指标法:测含氮量法测含氮量法(细菌细菌N%为为12.5%,酵母菌为,酵母菌为7.5%,霉菌为,霉菌为6.5%);测含碳量测含碳量;测磷、测磷、DNA、RNA、ATP、DAP等;等;产酸、产气、耗氧产酸、产气、耗氧、粘度和产热等。、粘度和产热等。三、微生物生长繁殖的测定方法三、微生物生长繁殖的测定方法二、计繁殖数二、计繁殖数适宜于测定适宜于测定单细胞单细胞的的细菌细菌和和酵母菌酵母菌,而对,而对放线菌放线菌

4、和和霉菌霉菌等丝状的微生物而言,只能计算其等丝状的微生物而言,只能计算其孢子数孢子数。一一)直接法直接法指用指用计数板计数板(如如血球计数板血球计数板)在在光学显微镜光学显微镜下直接观察细胞下直接观察细胞进行计数的方法。为包括死细胞在内的进行计数的方法。为包括死细胞在内的总菌计数法总菌计数法。为此,。为此,有用特殊染料作有用特殊染料作活菌染色活菌染色后再用光学显微镜计数的方法后再用光学显微镜计数的方法(如如酵母酵母+美蓝液;细菌美蓝液;细菌+吖啶橙吖啶橙)二二)间接法间接法是一种是一种活菌计数法活菌计数法。平板菌落计数法:平板菌落计数法:浇注浇注平板法、平板法、涂布涂布平板法平板法厌氧菌的菌落

5、记录数法:厌氧菌的菌落记录数法:亨盖特滚管亨盖特滚管培养法培养法细菌计数板和血球计数板都用来测微生物的总菌数。血球计数板用来测较大微生物如酵母菌酵母菌和霉菌孢子霉菌孢子的总数,细菌计数板用来测细菌细菌的总菌数。两种计数板的构造相似,不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数板深度的1/5。直接法直接法血球记数板血球记数板间间 接接 法法平板菌落计数法平板菌落计数法涂布平板法涂布平板法浇注平板法浇注平板法第二节第二节微生物的生长规律微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长一、微生物的个体生长和同步生长同步培养法同步培养法能使培养物中所有微生物细胞都处于能使培养物中所有微生物细胞都处于相同相同生长

6、阶段生长阶段的培养方法。的培养方法。同步生长同步生长通过同步培养的手段使细胞群中通过同步培养的手段使细胞群中各个体处各个体处于分裂步调一致于分裂步调一致的生长状态。的生长状态。获得方法获得方法1、环境条件诱导法、环境条件诱导法用用氯霉素氯霉素抑制细菌蛋白质的合成;抑制细菌蛋白质的合成;细细菌菌芽孢芽孢诱导发芽;诱导发芽;用用EDTA或或离子载体离子载体处理;处理;藻类细胞藻类细胞的光照、黑暗控制等。的光照、黑暗控制等。2、机械筛选法、机械筛选法用过滤、用过滤、密度梯度离心法密度梯度离心法或或膜洗脱法膜洗脱法ABA A:膜洗脱法:膜洗脱法B B:密度梯度离心:密度梯度离心常常用用同同步步培培养养

7、方方法法第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律二、二、无分支无分支单细胞单细胞微生物的微生物的典型生长曲线典型生长曲线生生长长曲曲线线:定定量量描描述述液液体体培培养养基基中中微微生生物物群群体体生生长长规律规律的实验曲线。的实验曲线。典典型型生生长长曲曲线线:当当把把少少量量纯纯种种单单细细胞胞微微生生物物接接种种到到恒恒容容积积的的液液体体培培养养基基中中后后,在在适适宜宜的的培培养养条条件件下下,以以细细胞胞数数目目的的对对数数值值作作纵纵坐坐标标,以以培培养养时时间间作作横横坐坐标标,就就可可画画出出一一条条由由延延滞滞期期、指指数数期期、稳稳定定期期和和衰衰亡期亡期4个阶段组

8、成的曲线。个阶段组成的曲线。根据微生物的根据微生物的生长速率常数生长速率常数,即每,即每小时分裂次数(小时分裂次数(R R)的不同粗分)的不同粗分微生物的典型微生物的典型生长曲线生长曲线总菌数总菌数活菌数活菌数培养时间培养时间/h h 延滞期延滞期 指数期指数期 稳定期稳定期 衰亡期衰亡期(+)0(-)一一)延滞期延滞期概念概念又又称称停停滞滞期期、调调整整期期或或适适应应期期。指指少少量量单单细细胞胞微微生生物物接接种种到到新新鲜鲜培培养养液液中中后后,在在开开始始一一段段时时间间内内,因因代代谢谢系系统统适适应应新新环环境境的的需需要要,细细胞胞数数目目没没有有增增加加的的一一段段时时期。

9、期。特点特点生生长长速速率率常常数数为为零零;细细胞胞形形态态变变大大或或增增长长;细细胞胞内内的的RNA尤尤其其是是rRNA含含量量增增高高,原原生生质质呈呈嗜嗜碱碱性性;合合成成代代谢谢十十分分活活跃跃,核核糖糖体体、酶酶类类和和ATP的的合合成成加加速速,易易产产生生各各种种诱诱导导酶酶;对对外外界界不不良良条条件件如如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。一一)延滞期延滞期影响延滞期长短的因素影响延滞期长短的因素菌种菌种接种龄接种龄指指接接种种物物或或种种子子的的生生长长年年龄龄,亦亦即即它它生生长长到到生生长长曲曲线线上上哪哪一

10、一阶段时用来作种的。是指某一群体的生理年龄。阶段时用来作种的。是指某一群体的生理年龄。对数期对数期接种龄的种子接种,则子代延滞期短;接种龄的种子接种,则子代延滞期短;延滞期延滞期或或衰亡期衰亡期种子接种,则子代延滞期长;种子接种,则子代延滞期长;稳定期稳定期种子接种,则延滞期居中。种子接种,则延滞期居中。接种量接种量接种量大,则延滞期短,反之则长。接种量大,则延滞期短,反之则长。培养基成分培养基成分发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近二二)指数期指数期概念概念又又称称对对数数期期,指指在在生生长长曲曲线线中中,紧紧接接着着延延滞滞期期的一段细胞数

11、以的一段细胞数以几何级数增长几何级数增长的时期。的时期。特点特点生生长长速速率率常常数数R最最大大,因因而而细细胞胞每每分分裂裂一一次次所所需需时时间间-代代时时(世世代代时时间间或或增增代代时时间间)或或原原生生质质增增加加一一倍倍所所需需的的倍倍增增时时间间最最短短。细细胞胞进进行行平平衡衡生生长长,故故菌菌体体各各部部分分的的成成分分十十分分均均匀匀酶系活跃,酶系活跃,代谢旺盛代谢旺盛。二二)指数期指数期影响指数期长短的因素:影响指数期长短的因素:菌种菌种营养成分营养成分营养丰富营养丰富的培养基上,指数期的培养基上,指数期较短较短营养物浓度:影响营养物浓度:影响生长速度生长速度和和总生长

12、量总生长量营营养养物物浓浓度度很很低低时时,才才会会影影响响生生长长速速度度;营营养养物物浓浓度度增增高高,生生长长速速度度不不受受影影响响,而而只只影影响响最最终终的的菌菌体体产产量量;若若进进一一步步提提高营养物浓度高营养物浓度,则,则生长速度生长速度和和菌体产量菌体产量均不受影响。均不受影响。时间时间生长速度和最大生长速度和最大收获量受影响收获量受影响只最大收获只最大收获量受影响量受影响8.0mg/mL8.0mg/mL6.0mg/mL6.0mg/mL4.0mg/mL4.0mg/mL2.0mg/mL2.0mg/mL1.0mg/mL1.0mg/mL0.5mg/mL0.5mg/mL0.2mg/

13、mL0.2mg/mL0.1mg/mL0.1mg/mL细细胞胞数数或或菌菌体体量量生生长长限限制制因因子子:凡凡处处于于较较低低浓浓度度范范围围内内可可影影响响生生长长速速率率和和菌菌体产量体产量的某营养物。的某营养物。培养温度培养温度温度接近最适生长温度,则指数期短。温度接近最适生长温度,则指数期短。二二)指数期指数期实践意义实践意义此此期期的的微微生生物物因因其其具具有有整整个个群群体体的的生生理理特特性性较较一一致致、细细胞胞各各成成分分平平衡衡和和生生长长速速率率恒恒定定等等优优点点,故故是是用用作作代代谢谢、生生理理等等研研究究的的良良好好材材料料,是是增增殖殖噬噬菌菌体体的的最最适适

14、宿宿主主,也也是是发发酵酵工工业中用作业中用作种子种子的最佳材料。的最佳材料。三三)稳定期稳定期概念概念又称又称恒定期恒定期或或最高生长期最高生长期特点特点生生长长速速度度常常数数R=0;菌菌体体产产量量达达到到最最高高点点,且且菌菌体体产产量量与与营营养养物物质质的的消消耗耗间间呈呈现现出出有有规规律律的的比比例例关关系系;细细胞胞内内开开始始积积累累糖糖原原、异异染染颗颗粒粒和和脂脂肪肪等等内内含含物物,产产芽芽孢孢杆杆菌菌在在此此形形成成芽芽孢孢;抗抗生生素素等等各种次生代谢物合成。各种次生代谢物合成。三三)稳定期稳定期稳定期到来的原因稳定期到来的原因营营养养物物尤尤其其是是生生长长限限

15、制制因因子子的的耗耗尽尽;营营养养物物的的比比例例失失调调;酸酸、醇醇、毒毒素素或或H2O2等等有有害害代代谢谢产产物物的的累累积积;pH、氧氧化化还还原原电电位位等等物物理理化化学学条条件件越越来来越越不不适适宜宜等。等。实践意义实践意义以以生生产产菌菌体体或或与与菌菌体体生生长长相相平平行行的的代代谢谢产产物物为为目目的的时时,稳稳定定期期是是产产物物的的最最佳佳收收获获期期;若若以以维维生生素素、碱碱基基、氨氨基基酸酸等等物物质质进进行行生生物物测测定定时时,稳稳定定期期为为最最佳佳的测定时期的测定时期。四四)衰亡期衰亡期概念概念处于稳定期的细菌继续培养,细胞的处于稳定期的细菌继续培养,

16、细胞的死亡率死亡率将逐渐增将逐渐增加,最终群体中活的加,最终群体中活的细胞数目细胞数目将以对数速率将以对数速率急剧下降急剧下降的时期的时期特点特点微生物的个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈微生物的个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈现现负生长状态负生长状态,R为负值。为负值。细胞形态发生细胞形态发生多形化多形化,例如会发生膨大或不,例如会发生膨大或不规则的规则的退化形态退化形态;有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发;有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生生自溶自溶;有的微生物在这期会进一步合成或;有的微生物在这期会进一步合成或释放释放对人对人类有益的抗生素等类有益的抗生素等次生代谢物次生代谢

17、物;而在芽孢杆菌中,往;而在芽孢杆菌中,往往此时往此时释放释放芽孢芽孢。四四)衰亡期衰亡期原因原因与菌种的与菌种的遗传特性遗传特性有关有关外界环境外界环境(营养、能源环境毒性等营养、能源环境毒性等)对继续生对继续生长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢,继而导致大量菌体死亡。明显超过合成代谢,继而导致大量菌体死亡。注意几个概念注意几个概念菌龄菌龄接种量接种量代时(世代时间,增代时间和倍增时间代时(世代时间,增代时间和倍增时间)生长限制因子生长限制因子指数期三个重要参数的关系指数期三个重要参数的关系1、繁殖代数(、繁殖代数(n)指数生长可以用

18、下式表示指数生长可以用下式表示b=B2n式中:式中:B:起始细胞数目起始细胞数目b:指数生长某个时刻指数生长某个时刻t时的时的细胞数目细胞数目n为繁殖代数为繁殖代数B,b和和t可由试验获得,可由试验获得,n可通可通过上式计算得出,将等式两侧过上式计算得出,将等式两侧取对数重排后得:取对数重排后得:lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgBlg20.3013.322(lgb-lgB)n例如:一培养液中微生物数目由开始的例如:一培养液中微生物数目由开始的1212,000(B),000(B),经,经4 4h(t)h(t)后增加到后增加到4949,000,000,000000(b(b ),这

19、样,这样,n n(lg4.9(lg4.910107 7lg1.2lg1.210104 4)3.3223.322121222、生长速率常数(、生长速率常数(R R)n3.322(lgb-lgB)t2-t1t2-t1R指数期三个重要参数的关系指数期三个重要参数的关系n=3.322(lgb-lgB)33、代时、代时(G)(G):G G1/R1/R(t(t2 2-t-t1 1)/n)/n在本例中,在本例中,G G4 46060/12/1220min20min该种微生物的该种微生物的代时代时为为2020分钟分钟。在。在4 4小时内共繁殖了小时内共繁殖了1212代代。代时代时能够反应细菌的能够反应细菌的生

20、长速率生长速率,代时短,生长速,代时短,生长速率快,代时长,生长速率慢。率快,代时长,生长速率慢。在很多微生物学研究在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。中常常要了解微生物的代时。在一定条件下,在一定条件下,每一种微生物的每一种微生物的代时代时是恒定的是恒定的,因此因此它是微生物菌种的一个重要特征。它是微生物菌种的一个重要特征。研究研究代时代时的意义:的意义:影响微生物代时长短的因素影响微生物代时长短的因素菌种菌种不同菌种差别很大。多数微生物的代时为不同菌种差别很大。多数微生物的代时为13h,然而,然而有些快速生长的微生物的代时还不到有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些,

21、而另一些微生物的代时却可长达微生物的代时却可长达几小时或几天几小时或几天。营养成分营养成分同一种微生物,在同一种微生物,在不同的生长条件不同的生长条件下其代时的下其代时的长短也长短也不同。不同。营养物浓度营养物浓度生长限制因子生长限制因子影响生长速率和总生长量影响生长速率和总生长量培养温度培养温度影响极大影响极大发酵实践、食品包藏和防止食物变质和中毒发酵实践、食品包藏和防止食物变质和中毒一些细菌的代时一些细菌的代时菌名菌名培养基培养基培培养温度养温度代时代时()(min)E.coli(大肠杆菌)大肠杆菌)肉汤肉汤3717E.coli牛奶牛奶3712.5Enterobacter aerogene

22、s(产气肠细菌)产气肠细菌)肉汤或牛奶肉汤或牛奶371618E.aerogenes组合组合372944B.subtilis(枯草芽孢杆菌)(枯草芽孢杆菌)肉汤肉汤3726-32S.aureus(金黄葡萄球菌)金黄葡萄球菌)肉汤肉汤3727-30Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳杆菌)嗜酸乳杆菌)牛奶牛奶376687Streptococcus lactis(乳酸链球菌)乳酸链球菌)牛奶牛奶3726S.Lactis 乳糖肉汤乳糖肉汤3748Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌)伤寒沙门氏菌)肉汤肉汤3723.5Mycobacterium tuberculosis(

23、结核分枝杆菌)结核分枝杆菌)组合组合37792993Nitrobacter agilis(活跃硝化杆菌)活跃硝化杆菌)组合组合271200不同温度下的代时不同温度下的代时如:如:E.Coli在不同温度下的代时在不同温度下的代时温度(温度()代时(分)代时(分)温度(温度()代时(分)代时(分)10860352215120371720904017.525404520302947.577本次教学回顾及作业本次教学回顾及作业教学回顾教学回顾6-1测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法测生长量测生长量直接法直接法(干重法)(干重法)、间接法、间接法(比浊法、生理指标法)(比浊法、生理指标法)计繁殖数计繁

24、殖数直接法直接法(显微镜计数法)(显微镜计数法)、间接法、间接法(平板菌落计数法、(平板菌落计数法、厌氧菌的菌落计数法)厌氧菌的菌落计数法)6-2微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的个体生长和微生物的个体生长和同步生长同步生长单细胞微生物的单细胞微生物的典型生长曲线典型生长曲线作业作业P1872,5上次教学回顾上次教学回顾6-1测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法测生长量测生长量计繁殖数计繁殖数6-2微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的个体生长和微生物的个体生长和同步生长同步生长单细胞微生物的单细胞微生物的典型生长曲线典型生长曲线直接法直接法(干重法)(干重法)间接法间接法(比浊法、生

25、理指标法)(比浊法、生理指标法)直接法直接法(显微镜计数法)(显微镜计数法)间接法间接法(平板菌落计数法)(平板菌落计数法)延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期注意几个概念注意几个概念:同步生长、同步生长、典型生长曲线典型生长曲线、延滞期、延滞期、指数期、稳定期、衰亡期、指数期、稳定期、衰亡期、接种龄接种龄、接种、接种量、量、繁殖代数、生长限制因子繁殖代数、生长限制因子第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养一一)分批培养与连续培养分批培养与连续培养分批培养分批培养概念:即概念:即单批培养单批培养或或密闭培养密闭培养。指将微生物置于。指

26、将微生物置于一定容积一定容积的培养基中,经过培养生长,最后的培养基中,经过培养生长,最后一次收获一次收获的培养方式。的培养方式。特点特点:培养基一次加入,不予:培养基一次加入,不予补充和更换补充和更换连续培养连续培养概念:又称概念:又称开放培养开放培养。即在一个恒定的。即在一个恒定的流动系统流动系统中培养微中培养微生物,其中的微生物可长期保持在生物,其中的微生物可长期保持在指数期指数期的的平衡生长状态平衡生长状态和和衡衡定的生长速率定的生长速率上,于是形成了连续生长上,于是形成了连续生长。连续培养连续培养指数期后期指数期后期以一定的速度流入新鲜以一定的速度流入新鲜培养基和无菌空气培养基和无菌空

27、气立即搅拌均匀立即搅拌均匀以同样的流速不以同样的流速不断流出培养物断流出培养物培养物就可达培养物就可达到动态平衡到动态平衡类型:主要有类型:主要有恒浊恒浊连续培养连续培养和恒化和恒化连续培养连续培养两种两种恒浊连续培养恒浊连续培养装置:恒浊器装置:恒浊器概念:概念:通过调节培养基通过调节培养基流速流速,使,使培养液培养液浊度浊度保持恒定的连续培养保持恒定的连续培养方法。方法。原理:原理:通过调通过调光电控制系统光电控制系统控制控制新鲜培养基流入的速度和培养物新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来流出的速度来维持菌维持菌浓度浓度不变不变,即即浊度浊度不变不变。当。当浊度高浊度高时,使新鲜时,使

28、新鲜培养基的培养基的流速加快流速加快;浊度浊度降低降低,则则减慢减慢培养基的流速。培养基的流速。特点特点:基质过量,微生物始终以:基质过量,微生物始终以最高速率最高速率进行生长,并可在允许进行生长,并可在允许范围内控制不同的范围内控制不同的菌体密度菌体密度;但;但工艺复杂,烦琐。工艺复杂,烦琐。使用范围:使用范围:用于生产用于生产大量菌大量菌体体、生产、生产与菌体生长相平行与菌体生长相平行的的某些某些代谢产物代谢产物,如乳酸、,如乳酸、乙醇等。乙醇等。培养液贮备瓶培养液贮备瓶恒浊器恒浊器培养菌液培养菌液恒化连续培养恒化连续培养装置:恒化器装置:恒化器概念概念:以:以恒定流速恒定流速使营养物质使

29、营养物质浓度浓度恒定恒定而保持细菌而保持细菌生长速率生长速率恒定的方恒定的方法。法。原理:原理:通过控制某一种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度(如碳、氮源、生长因子等)(如碳、氮源、生长因子等),使,使其始终成为其始终成为生长限制因子生长限制因子,而达到,而达到控制培养液流速保持不变,并使微控制培养液流速保持不变,并使微生物始终在生物始终在低于低于其最高生长速率其最高生长速率条条件下进行生长繁殖。件下进行生长繁殖。特点:特点:维持营养成分的维持营养成分的亚适量亚适量,控,控制微生物生长速率。制微生物生长速率。菌体生长速率菌体生长速率恒定,菌体均一、密度稳定,产量恒定,菌体均一、密度稳定,产量

30、低于最高菌体产量。低于最高菌体产量。应用范围:应用范围:实验室科学研究实验室科学研究恒浊连续培养与恒化连续培养的比较恒浊连续培养与恒化连续培养的比较装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养基培养基流速流速生长速率生长速率产物产物应用范围应用范围恒浊器恒浊器菌体密度菌体密度(内控制内控制)无限制生无限制生长因子长因子不恒定不恒定最高速率最高速率大量菌体或与菌大量菌体或与菌体相平行的代谢体相平行的代谢产物产物生产为主生产为主恒化器恒化器培养基流速培养基流速(外控制外控制)有限制生有限制生长因子长因子恒定恒定低于最高低于最高速率速率不同生长速率的不同生长速率的菌体菌体实验室为主实验室为主单批培养单批

31、培养连续培养连续培养时间时间Lg细胞数细胞数/个个mL-1连续流入新连续流入新鲜培养液鲜培养液单批培养单批培养恒浊法恒浊法恒化法恒化法连续培养连续培养单批培养与连续培养的关系单批培养与连续培养的关系连续发酵(连续发酵(continuousfermentation)连续发酵连续发酵:指:指连续培养连续培养在生产上的应用。与在生产上的应用。与单批发酵单批发酵相对。相对。优点优点高效,高效,简化了操作简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等操作;装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等操作;自控:自控:便于利用各种仪表进行自动控制;便于利用各种仪表进行自动控制;产品质量稳定产品质量稳定;节约节约大量动力、人力

32、、水和蒸汽,使水、汽、电的负荷均衡合理。大量动力、人力、水和蒸汽,使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点:缺点:菌种易于退化;易于遭到杂菌污染;营养物利用率低于单批培养。菌种易于退化;易于遭到杂菌污染;营养物利用率低于单批培养。因此,连续发酵的生产时间一般只能维持因此,连续发酵的生产时间一般只能维持数月数月1年年。第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养概念概念有时也称有时也称高密度发酵高密度发酵,一般是指微生物在液体培养中,一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度细胞群体密度超过常规超过常规10倍倍以上时的生长状态或培以上时的生长状态或培养技术。养技

33、术。主要发展于用主要发展于用基因工程菌基因工程菌(E.coli)(高密度值:高密度值:200400g(湿重湿重)/L)生产多肽类药物;生产多肽类药物;微生物种类微生物种类E.coli和和S.cerevisiae等少数兼性厌氧菌等少数兼性厌氧菌第二节第二节 微生物的生长规律微生物的生长规律四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养具体方法具体方法选取最佳选取最佳培养基成分培养基成分含量含量注意营养物浓度及比例,尤其是注意营养物浓度及比例,尤其是C/N比比补料补料一般应采用一般应采用逐量流加逐量流加的方式的方式提高提高溶解氧溶解氧的浓度的浓度提高氧浓度甚至用纯氧提高氧浓度甚至用纯氧防止防止有害代

34、谢产物有害代谢产物的生成的生成选用天然培养基,降低培养基的选用天然培养基,降低培养基的pH,以甘油代替葡萄糖、加以甘油代替葡萄糖、加入甘氨酸、甲硫氨酸,降低培养温度,采用透析培养法等入甘氨酸、甲硫氨酸,降低培养温度,采用透析培养法等本次教学回顾及作业本次教学回顾及作业教学回顾教学回顾6-1测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法测生长量测生长量计繁殖数计繁殖数6-2微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的个体生长和微生物的个体生长和同步生长同步生长无分支的单细胞微生物的无分支的单细胞微生物的典型生长曲线典型生长曲线微生物的微生物的连续培养连续培养微生物的微生物的高密度培养高密度培养作业作业P187

35、2,5,76-1测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法测生长量测生长量计繁殖数计繁殖数6-2微生物的生长规律微生物的生长规律微生物的个体生长和微生物的个体生长和同步生长同步生长无分支的单细胞微生物的无分支的单细胞微生物的典型生长曲线典型生长曲线微生物的微生物的连续培养连续培养微生物的微生物的高密度培养高密度培养上次教学回顾上次教学回顾直接法直接法间接法间接法直接法直接法间接法间接法诱导法诱导法筛选法筛选法延滞期延滞期指数期指数期稳定期稳定期衰亡期衰亡期恒浊法恒化法恒浊法恒化法第三节第三节 影响微生物的生长的主要因素影响微生物的生长的主要因素一、温度一、温度二、氧二、氧三、三、pH值值讨论题讨论题

36、试分析影响微生物生长的因素?试分析影响微生物生长的因素?1)物理因素:)物理因素:温度温度、水分、渗透压、光线、微波和、水分、渗透压、光线、微波和超声波超声波2)化学因素:)化学因素:营养元素营养元素、pH值值、氧气氧气和氧化还原和氧化还原电位、无机盐类、某些化学物质。电位、无机盐类、某些化学物质。注意:具体从最适、过高或过低三方面分析。注意:具体从最适、过高或过低三方面分析。第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论良好微生物培养装置的基本条件良好微生物培养装置的基本条件设计基础:微生物的设计基础:微生物的生长规律生长规律基础:基础:营养物质营养物质丰富而均匀丰富而均匀环境条件环境条件温度

37、温度通气通气条件(厌氧菌除外)条件(厌氧菌除外)物理化学因素物理化学因素有效防止杂菌污染有效防止杂菌污染第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论微生物培养技术发展轨迹的特点:微生物培养技术发展轨迹的特点:少量少量培养到培养到大规模大规模培养培养浅层浅层培养到培养到厚层厚层或或深层深层液体培养液体培养固体固体培养到培养到液体液体培养培养静止静止培养到培养到通气搅拌通气搅拌液体培养液体培养单批单批培养到培养到连续连续培养到培养到多级多级培养培养分散分散到到固定化固定化细胞细胞微生物细胞微生物细胞到到动植物细胞动植物细胞培养培养野生菌种到野生菌种到突变、遗传工程菌种突变、遗传工程菌种单菌发酵到单

38、菌发酵到混菌混菌发酵发酵低密度到低密度到高密度高密度人工控制发酵罐到多传感器、计算机在线控制自动发酵人工控制发酵罐到多传感器、计算机在线控制自动发酵第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论一、实验室培养法一、实验室培养法一)固体培养法一)固体培养法、好氧菌好氧菌的固体培养法的固体培养法主要用试管斜面、培养平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等主要用试管斜面、培养平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等、厌氧菌厌氧菌的固体培养法:的固体培养法:需要特殊的需要特殊的培养装置培养装置或或器皿器皿和特和特殊的殊的培养基培养基(其中除(其中除6大营养要素外,还得加入适当的大营养要素外,还得加入适当的还原剂还原剂,

39、必要时还需加刃天青等必要时还需加刃天青等氧化还原指示剂氧化还原指示剂)。(1)高层琼脂柱高层琼脂柱把含有把含有还原剂还原剂的的固体固体或或半固体半固体培养基装入试管中,灭菌培养基装入试管中,灭菌培养,如培养,如韦荣氏管韦荣氏管。(2)厌氧培养皿厌氧培养皿第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论一、实验室培养法一、实验室培养法一)固体培养法一)固体培养法、厌氧菌厌氧菌的固体培养法:的固体培养法:(3)亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术原理:原理:利用利用除氧铜柱除氧铜柱来制备来制备高纯氮高纯氮,再用此,再用此高纯氮高纯氮去驱去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气,除培养基配制、分装过

40、程中各种容器和小环境中的空气,使整个培养全过程始终处于使整个培养全过程始终处于高度无氧高度无氧条件下。条件下。培养基培养基:预还原无氧灭菌培养基预还原无氧灭菌培养基(PRAS培养基培养基)培养方法培养方法:密封后密封后置置冰浴中均匀滚动冰浴中均匀滚动,使含,使含菌培养基布菌培养基布满在试管内表面上。满在试管内表面上。优点:优点:试管内壁上的试管内壁上的琼脂层琼脂层有很大的有很大的表面积表面积可供厌氧菌可供厌氧菌长出长出单菌落单菌落,但,但试管口的面积和试管腔体积都极小试管口的面积和试管腔体积都极小,因,因而特别有利于阻止氧与厌氧菌接触。而特别有利于阻止氧与厌氧菌接触。第四节微生物培养法概论第四

41、节微生物培养法概论一、实验室培养法一、实验室培养法一)固体培养法一)固体培养法、厌氧菌厌氧菌的固体培养法:的固体培养法:(4)厌氧罐技术厌氧罐技术是一种经常使用但是一种经常使用但不是很严格不是很严格的厌氧菌培养技术。因为的厌氧菌培养技术。因为它仅能保证厌氧菌在它仅能保证厌氧菌在培养过程培养过程中处于良好的无氧环境。中处于良好的无氧环境。一般操作步骤(一般操作步骤(抽气换气法)抽气换气法):抽真空抽真空灌灌N2抽真空抽真空灌灌N2抽真空抽真空灌混合气体灌混合气体(N2:CO2:H280:10:10,V/V)“GasPak”内源性产气袋内源性产气袋(5)厌氧手套箱技术厌氧手套箱技术混合气体(混合气

42、体(N2:CO2:H285:5:10,V/V)和钯催化剂)和钯催化剂厌 氧 罐厌氧手套箱厌氧手套箱第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论一、实验室培养法一、实验室培养法二)液体培养法二)液体培养法、好氧菌好氧菌的液体培养法的液体培养法试管液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养摇瓶培养台式发酵罐台式发酵罐、厌氧菌厌氧菌的液体培养法的液体培养法放入前述放入前述厌氧罐厌氧罐或或厌氧手套箱中厌氧手套箱中培养即可培养即可若单独在若单独在有氧环境有氧环境下培养,则在培养基中必须加入下培养,则在培养基中必须加入巯基乙酸、巯基乙酸、半胱氨酸、维生素半胱氨酸、维生素C或庖肉或庖肉

43、等等有机还原剂有机还原剂,或加入,或加入铁丝铁丝等等无机无机还原剂还原剂,再用,再用深层培养深层培养或同时在液面上或同时在液面上封一层石蜡油封一层石蜡油或或凡士凡士林林-石蜡油石蜡油,保证其,保证其Eh=-150mV-420mV第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置二、生产实践中培养微生物的装置一)固态培养法一)固态培养法1、好氧菌的、好氧菌的曲法曲法培养(培养(瓶曲、袋曲瓶曲、袋曲、盘曲、帘子曲、盘曲、帘子曲、转鼓曲转鼓曲通风曲通风曲)曲的构成曲的构成与功能与功能固体基质固体基质菌体(菌丝、孢子或细胞)菌体(菌丝、孢子或细胞)代谢产物代谢产物提供提供营养源

44、营养源有利于疏松有利于疏松通气通气赋于曲的赋于曲的外形外形:可用作:可用作“种子种子”外酶类:可用作外酶类:可用作粗酶制剂粗酶制剂其他:如其他:如柠檬酸、赤霉素和抗生素柠檬酸、赤霉素和抗生素等等第四节微生物培养法概论第四节微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置二、生产实践中培养微生物的装置一)固态培养法一)固态培养法2、厌氧菌的、厌氧菌的堆积堆积培养培养我国的我国的传统白酒传统白酒生产中采用生产中采用大型深层地窖大型深层地窖对固态发酵料进行对固态发酵料进行堆积式固态发酵(有利于酵母菌的堆积式固态发酵(有利于酵母菌的酒精发酵酒精发酵和己酸菌的和己酸菌的己酸己酸发酵发酵)。)。第四节微生物

45、培养法概论第四节微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置二、生产实践中培养微生物的装置二)液体培养法二)液体培养法1、好氧菌的培养、好氧菌的培养1)浅盘培养:用)浅盘培养:用大型盘子大型盘子对好氧菌进行对好氧菌进行浅层液体静止浅层液体静止培养的培养的方法方法2)深层液体通气培养深层液体通气培养:应用大型:应用大型发酵罐发酵罐进行深层液体通气搅进行深层液体通气搅拌的培养技术,为拌的培养技术,为现代发酵工业的标志现代发酵工业的标志。瑞士比欧公司小型发酵罐瑞士比欧公司小型发酵罐中式发酵罐中式发酵罐本次教学回顾及作业本次教学回顾及作业教学回顾教学回顾6-3影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的

46、主要因素温度温度氧气氧气pH6-4微生物培养法概论微生物培养法概论实验室培养法实验室培养法生产实践中培养微生物的的装置生产实践中培养微生物的的装置作业作业P1879,10,14上次教学回顾上次教学回顾6-3影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素温度温度氧气氧气pH6-4微生物培养法概论微生物培养法概论实验室培养法实验室培养法生产实践中培养微生物的的装置生产实践中培养微生物的的装置最高生长温度最高生长温度最适生长温度最适生长温度最低生长温度最低生长温度专性好氧菌专性好氧菌兼性厌氧菌兼性厌氧菌微好氧菌微好氧菌耐氧菌耐氧菌厌氧菌厌氧菌最高生长最高生长pHpH最适生长最适生长pHpH最低生长

47、最低生长pHpH超氧化物岐化酶(超氧化物岐化酶(SOD)学说)学说第五节第五节 有害微生物的控制有害微生物的控制 控制有害控制有害菌的措施菌的措施杀灭法杀灭法抑制法抑制法灭菌灭菌消毒消毒彻底杀灭彻底杀灭(一切微生物一切微生物)部分杀灭部分杀灭(仅杀灭仅杀灭病原菌病原菌)杀菌杀菌溶菌溶菌防腐防腐化疗化疗抑制抑制霉腐霉腐微生物微生物抑制宿主体内的抑制宿主体内的病原菌病原菌防腐方法防腐方法低温低温4以下的各种低温(以下的各种低温(0,-20,-70,-196等)保藏食物、生等)保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等化试剂、生物制品或菌种等;缺氧缺氧抽真空抽真空、充氮气或二氧化碳、加入、充氮气或二氧化碳

48、、加入除氧剂除氧剂等;等;干燥干燥晒干、烘干、红外线干燥、添加生石灰、无水氯化钙或硅胶等作晒干、烘干、红外线干燥、添加生石灰、无水氯化钙或硅胶等作吸湿剂吸湿剂等;等;高渗:盐腌和糖渍高渗:盐腌和糖渍高酸度:如泡菜高酸度:如泡菜高醇度:如醉蟹、醉笋、黄泥螺等高醇度:如醉蟹、醉笋、黄泥螺等加防腐加防腐(霉霉)剂:苯甲酸、尼泊金(对羟基苯甲酸甲酯)等剂:苯甲酸、尼泊金(对羟基苯甲酸甲酯)等一、物理方法的控制一、物理方法的控制一一)高温灭菌和消毒高温灭菌和消毒原理:引起原理:引起蛋白质蛋白质、核酸核酸和和脂类脂类等重要生物高等重要生物高分子发生分子发生降解降解或或改变其空间结构改变其空间结构等,从而变

49、性等,从而变性或破坏。或破坏。干热灭菌法干热灭菌法湿热灭菌湿热灭菌(消毒消毒)法法火焰灼烧法火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法烘箱内热空气灭菌法常压常压加压加压巴氏消毒法巴氏消毒法煮沸消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法间歇灭菌法常规加压灭菌法常规加压灭菌法连续加压灭菌法连续加压灭菌法二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂评价药效和毒性的评价药效和毒性的3种指标种指标最低抑制浓度最低抑制浓度(MIC)半致死剂量半致死剂量(LD50)最低致死剂量最低致死剂量(MLD)化学因素化学因素表面消毒剂表面消毒剂化学治疗剂化学治疗剂溶液状态溶液状态气体状态气体状态抗代谢药物:抗代谢药物:磺胺类磺胺类

50、等等抗生素抗生素生物药物素生物药物素二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂一一)表面消毒剂表面消毒剂表面消毒剂表面消毒剂:可抑制或杀灭微生物,但:可抑制或杀灭微生物,但对人体也可能对人体也可能产生有害作用产生有害作用的化学试剂。的化学试剂。防腐剂防腐剂:可抑制微生物生长,但对:可抑制微生物生长,但对人体或动物体的毒人体或动物体的毒性较低性较低的化学试剂。的化学试剂。石炭酸系数:石炭酸系数:指在一定时间指在一定时间(10min)内,内,被测试被测试药剂药剂能能杀死全部杀死全部供试菌供试菌(伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌)的的最高稀释度最高稀释度与达到与达到同效的石炭酸的同效的石炭

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