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1、第第1 1篇篇 物质篇物质篇第第5 5章章 酶与维生素酶与维生素第第5 5章章 酶酶5.1 酶的概念酶的概念酶的分类与命名酶的分类与命名酶的化学本质酶的化学本质酶的结构与功能的关系酶的结构与功能的关系酶作用的专一性酶作用的专一性5.2 酶作用的机理酶作用的机理5.3 酶反应动力学酶反应动力学5.4 酶的制备与酶活力的测定酶的制备与酶活力的测定5.5 维生素与辅维生素与辅 酶酶 概概 述述1857185718571857年，酒精发酵机理：年，酒精发酵机理：年，酒精发酵机理：年，酒精发酵机理：酒精发酵是酵母活细胞引起的。酒精发酵是酵母活细胞引起的。酒精发酵是酵母活细胞引起的。酒精发酵是酵母活细胞引
2、起的。活体酵素活体酵素非活体酵素非活体酵素 Liebig、Berzelius 和和Wohler等：等：酒精发酵的本质是物质作用的结果。酒精发酵的本质是物质作用的结果。法国微生物学家巴斯德（Pasteur)酵素酵素生机论生机论物质论物质论1897189718971897年，德国学者年，德国学者年，德国学者年，德国学者BuchnerBuchnerBuchnerBuchner兄弟兄弟兄弟兄弟制造医药制造医药制造医药制造医药：酵母细胞酵母细胞破碎酵母细胞破碎酵母细胞石英砂研磨石英砂研磨浸提过滤浸提过滤破碎酵母细胞破碎酵母细胞滤液滤液蔗糖蔗糖发酵发酵酒化酒化 酶！酶！我国：我国：40004000多年前的
3、夏禹时代多年前的夏禹时代-酿酒已盛行。酿酒已盛行。（酒母酒母）公元公元1010世纪左右世纪左右-用豆类作豆酱。用豆类作豆酱。（霉菌蛋白酶作用于豆类蛋白质）霉菌蛋白酶作用于豆类蛋白质）30003000年前年前-利用麦曲制作饴糖。利用麦曲制作饴糖。（淀粉酶水解淀粉为麦芽糖）淀粉酶水解淀粉为麦芽糖）国外：国外：18331833年，年，PayenPayen和和Person-Person-从麦芽的水抽提物中用酒精沉从麦芽的水抽提物中用酒精沉 淀得到淀粉酶制剂（淀得到淀粉酶制剂（diastasediastase)。18781878年，德国年，德国Kuhne Kuhne 提出提出“EnzymeEnzyme”
4、一词，意为一词，意为“在在 酵母中酵母中”。18971897年，德国年，德国BuchnerBuchner兄弟兄弟 酵母提取液中分离出酒化酶酵母提取液中分离出酒化酶（eymaseeymase)。酶的研究理论研究应用研究酶的理化性质及催化性质的研究；酶的理化性质及催化性质的研究；锁钥学说锁钥学说(1890,Fischer)、诱导契合学说、诱导契合学说(1968,Koshland)的提出；的提出；米氏方程米氏方程(1913,Michaelis Menten)的建立的建立;脲酶结晶脲酶结晶(1926,Sumner)的获得；的获得；酶的结构与功能之间关系的阐释；酶的结构与功能之间关系的阐释；酶分子生物学
5、的建立。酶分子生物学的建立。限制性内切酶限制性内切酶Hind(1970,Smith);核酶的发现核酶的发现（1982，Cech小组）小组）；抗体酶的发现抗体酶的发现（1986，Schultz和和 Learner)。1808，罗门：胰酶制革；，罗门：胰酶制革；1917，法国人：淀粉酶作退浆剂。，法国人：淀粉酶作退浆剂。1949，日本：深层发酵生产淀粉酶。，日本：深层发酵生产淀粉酶。1959，日本：淀粉酶催化淀粉生产，日本：淀粉酶催化淀粉生产G。1969，日本：酶固定化技术成功。，日本：酶固定化技术成功。20世纪世纪70年代，多种类型酶反应器的建立。年代，多种类型酶反应器的建立。酶制剂工业的兴起与
6、发展酶制剂工业的兴起与发展兴起：兴起：19 19世纪，高峰让吉，开设生产黑曲霉淀粉酶工厂。世纪，高峰让吉，开设生产黑曲霉淀粉酶工厂。发展：发展：自然界中发现的酶：自然界中发现的酶：2500 2500多种。多种。申请专利的酶制剂：申请专利的酶制剂：100 100多种。多种。有经济价值的酶制剂：有经济价值的酶制剂：6060多种。多种。工业化生产的酶制剂：工业化生产的酶制剂：2020多种。（多种。（0.8%0.8%）产量（t）产值1981650004亿美元1985750006亿美元 目前 欧洲 日本 9亿美元3500亿日元公公 司司国国 家家Novo NordiskNovo Nordisk丹麦丹麦G
7、ist-BrocadesGist-Brocades荷兰荷兰GenencorGenencor美国美国AlkoAlko芬兰芬兰Bayer AGBayer AG德国德国CultorCultor芬兰芬兰Sovay&Cie SASovay&Cie SA比利时比利时天野制药天野制药日本日本长濑产业长濑产业日本日本74.3%（19932003）年份年份总收入总收入/亿美元亿美元增长率增长率/%/%19934.01-19944.256.219954.546.719964.877.319975.257.819985.698.319996.198.820006.769.320017.439.820028.1910
8、.220039.0610.7其他：制革、造纸、畜牧、医药、日化、废水处理。一、集中垄断一、集中垄断二、市场全球化二、市场全球化三、技术开发周期缩短三、技术开发周期缩短四、应用领域迅速扩大四、应用领域迅速扩大二、产业化现状二、产业化现状不容不容乐观！乐观！我国酶制剂工业的产业化现状我国酶制剂工业的产业化现状产品名称年产量/t技 术 状 况国 内国 外糖化酶16万30000-35000 U/ml50000 U/ml以上-淀粉酶4万6000 U/ml蛋白酶5万20000-25000 U/ml其他酶200产品质量稳定性差距大产品质量稳定总产量25万年销售额约7亿人民币Novo,93年，9亿美元1 1、
9、酶制剂开发主要是各大学和科研机构，经费不足。、酶制剂开发主要是各大学和科研机构，经费不足。国家投入有限，而企业对开发酶制剂的投资热情不高。国家投入有限，而企业对开发酶制剂的投资热情不高。2 2、生产规模小，无法同国外公司竞争。、生产规模小，无法同国外公司竞争。年产量超万吨，销售收入超年产量超万吨，销售收入超30003000万元：江苏无锡酶制剂万元：江苏无锡酶制剂厂、浙江德清、苏州宏达、山东沂水和张家港华昌厂、浙江德清、苏州宏达、山东沂水和张家港华昌5 5家。家。3 3、企业很少有独立开发新产品的尝试。、企业很少有独立开发新产品的尝试。4 4、产品品种少，结构极不合理。、产品品种少，结构极不合理
10、。5 5、制造成本占销售价的、制造成本占销售价的80%80%，国外仅占，国外仅占30%-50%30%-50%。6 6、装备落后。、装备落后。7 7、酶制剂应用领域十分狭窄。、酶制剂应用领域十分狭窄。三、主要存在问题三、主要存在问题三、主要存在问题三、主要存在问题应用领域洗涤剂纺织乳制品淀粉乙醇酿酒饲料焙烤果汁造纸其他国外酶的比例/%3614.410.87.27.210.18.62.90.72.2国内酶的比例/%17.42极少量极少量81.45少量-极少量少量1.13 四、未来发展展望四、未来发展展望技术研究：技术研究：1 1、酶的固定化。、酶的固定化。2 2、基因工程表达的酶制剂。、基因工程表
11、达的酶制剂。3 3、模拟酶、人工设计合成酶、抗体酶、杂合酶。、模拟酶、人工设计合成酶、抗体酶、杂合酶。4 4、非水系统酶反应技术。、非水系统酶反应技术。应用研究：应用研究：1 1、产品结构调整，增加新品种。、产品结构调整，增加新品种。2 2、实现规模化经营，增加产品竞争力。、实现规模化经营，增加产品竞争力。3 3、加强技术开发，提高产品质量。、加强技术开发，提高产品质量。5.1 酶的一般概念酶的一般概念定义：定义：酶是生物细胞产生的酶是生物细胞产生的,具有催化能具有催化能力的生物催化剂力的生物催化剂。酶具有一般催化剂的特征：酶具有一般催化剂的特征：酶具有一般催化剂的特征：酶具有一般催化剂的特征
12、：1.只能进行热力学上允许进行的反应；只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平 衡点；衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。通过降低活化能加快化学反应速度。4.反映前后质量和性质不改变。反映前后质量和性质不改变。酶的催化特点酶的催化特点：1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的 108-1020倍。2.2.专一性：酶对底物具有严格的选择性。专一性：酶对底物具有严格的选择性。3.3.敏感性：对环境条件极为敏感。易变性失活。敏感性：对环境条件极为敏感。易变性失活。4.4.可调性：酶活性的调节和酶合成
13、速度的调可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调 节。节。二、酶的分类与命名二、酶的分类与命名 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1.1.氧化还原酶类氧化还原酶类2.2.转移酶类转移酶类3.3.水解酶水解酶4.4.裂解酶类裂解酶类5.5.异构酶异构酶6.6.合成酶类合成酶类酶酶的的分分类类氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。反映通式：反映通式：主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。如，乳酸如，乳
14、酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)(1)氧化氧化-还原酶还原酶 Oxidoreductase OxidoreductaseAH2+BA+BH2转移酶催化基团转移反应。即将一个底物分子的转移酶催化基团转移反应。即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)(2)转移酶转移酶 Transferase Transferase酶酶的的分分类类AX+BA+BX水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。主要
15、包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：(3)(3)水解酶水解酶 hydrolase hydrolase酶酶的的分分类类AB+H2OAOH+BH裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。(4)(4)裂解酶裂解酶 Lyase Lyase酶酶的的分分类类CC键CH3C=OCOOH+CO2CH3C=OHCO键CH2
16、COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+H2O异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。底物分子内基团或原子的重排过程。例如，例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)(5)异构酶异构酶 Isomerase Isomerase酶酶的的分分类类AB酶酶的的分分类类合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-C-N N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。
17、A+B+ATP=A A+B+ATP=A B+ADP+Pi B+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸丙酮酸 +COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸(6)(6)合成酶合成酶 Ligase or Synthetase Ligase or Synthetase酶的命名 系统名系统名、惯用名惯用名。系统名系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：乳酸：NADNAD+氧化还原酶氧化还原酶惯用名惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：乳酸：NADNAD+氧化还原酶氧化还原酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 对于催化水解反应的酶一般在
18、酶的名称上省去反应类型。一、酶的化学本质及组成一、酶的化学本质及组成（一）大多数酶是蛋白质（一）大多数酶是蛋白质 1926年首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。酶是蛋白质的证据:1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。（二）酶的组成（二）酶的组成酶酶单纯酶单纯酶结合酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅因子辅因子辅酶辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基辅基：与膜蛋
19、白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属激活剂：金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.1.单体酶（单体酶（monomeric enzyme)monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。2.2.寡聚酶寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.3.多酶复合物多酶复合物(multienzyme
20、 system)(multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。EEE碱性EEE+EE+脲酶的结构与功能的关系酶的结构与功能的关系活性部位和必需基团活性部位和必需基团必需基团：必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。性丧失。活性部位：活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。直接有关的部位。必需基团必需基团活性部位活性部位维
21、持酶的空间结构维持酶的空间结构结合基团结合基团催化基团催化基团专一性专一性催化性质催化性质 酶分子中酶分子中与底物结与底物结合的部位合的部位或区域一或区域一般称为结般称为结合部位。合部位。酶分子的活性部位酶分子的活性部位1 1结合部位结合部位 Binding site Binding siten酶分子中促使底物发生化学酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位变化的部位称为催化部位。n通常将酶的结合部位和催化通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或部位总称为酶的活性部位或活性中心。活性中心。n结合部位决定酶的专一性，结合部位决定酶的专一性，n催化部位决定酶所催化反应催化部位决定酶所
22、催化反应的性质。的性质。2 2催化部位催化部位 catalytic site catalytic siten酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。的变化，对酶起激活或抑制作用。3 3调控部位调控部位 Regulatory site Regulatory site（二）酶原的激活（二）酶原的激活没有活性的酶的前体称为酶原酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。在组织细胞中，某些酶以酶原
23、的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。（三）同工酶（三）同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。乳酸脱氢酶（LDH）M MH HM MM MM MM MM M4 4H HM MM MM MM M3 3H HM MM MH HH HM M2 2H H2 2M MH HH HH HMHMH3 3H HH HH HH HH H4 4三、酶催化反应的专一性三、酶催化反应的专一性酶作用的酶作用的专一性专一性结构专一性结构专一性立体异构专一性立体异构专一性族（基团）专一性族（基团）专一性绝对
24、专一性绝对专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性基团（族）专一性：基团（族）专一性：对化学键和键一端的基团具有专一对化学键和键一端的基团具有专一性。性。RCOO-+R OH+H+酯酶酯酶：RCOR+H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖葡萄糖苷酶苷酶O R+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶脲酶：H2NCNH2+H2OO2NH3+CO2键专一性：键专一性：对键具有专一性，对键两端的基团无要求。对键具有专一性，对键两端的基团无要求。5.2 5.2 酶的催化作用机理酶的催化作用机理一、酶的
25、活性中心一、酶的活性中心一、酶的活性中心一、酶的活性中心 酶分子活性中心部位，酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。可以按单一方向进行。“三点结合三点结合”催化理催化理论论 认为酶与底物的结合处至少认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作这种情况下，不对称催化作用才能实现。用才能实现。E+SESE+P
26、中间产物存在的证据：中间产物存在的证据：1.1.同位素同位素3232P P标记底物法（磷酸化标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；酶与葡萄糖结合）；2.2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。化氢结合）。二、中间产物学说二、中间产物学说二、中间产物学说二、中间产物学说三、锁钥学说三、锁钥学说三、锁钥学说三、锁钥学说（Fischer，1890）n认为整个酶分子的天然构象是具认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样把钥匙对一把锁一样四、诱导契合学说四、
27、诱导契合学说四、诱导契合学说四、诱导契合学说（Koshland，1958）n该学说认为该学说认为：酶活性中心的结构原来不一定和底酶活性中心的结构原来不一定和底物的结构完全吻合，但有有一定的柔性，当底物物的结构完全吻合，但有有一定的柔性，当底物与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。五、酶具有高催化效
28、率的因素五、酶具有高催化效率的因素n在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性在酶促反应中，底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速度；度大大增加，有利于提高反应速度；n另一方面，由于活性中心的立体结构和相另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性特定位，使酶促反应具有高效率和专一性特点。点。1 1、邻近定向效应、邻近定向效应 酶与底物的结合，不仅酶
29、分子发生构象变化，同样底酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键扭曲和电子张力，降低了反应活化能。弱，产生键扭曲和电子张力，降低了反应活化能。n这是一个形成内酯的反应。当这是一个形成内酯的反应。当 R RCHCH3 3时，其反应速度比时，其反应速度比 R RH H的情况快的情况快315315倍。倍。n由于由于-CH-CH3 3体积比较大，与反应基团之间产生一种立体排斥张体积比较大，与反应基团之间产生一种立体排斥张力，使反应基团之间更容易形成稳定的五元环过渡状态。力，使反应基团之间
30、更容易形成稳定的五元环过渡状态。2 2、张力和变形、张力和变形n nBronstedBronstedBronstedBronsted的广义酸碱理论的广义酸碱理论的广义酸碱理论的广义酸碱理论：n 提供质子为酸，接受质子为碱。提供质子为酸，接受质子为碱。.n n酸碱催化：酸碱催化：酸碱催化：酸碱催化：酶分子的某些功能基团，作为酸或碱，通过酶分子的某些功能基团，作为酸或碱，通过向底物提供质子或夺取质子来达到加速反应的一类催化。向底物提供质子或夺取质子来达到加速反应的一类催化。（氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基）。（氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基）。n 广义酸基团广义酸基团 广义碱基团广义碱基团 n （
31、质子受体）（质子受体）（质子供体）（质子供体）3 3、酸碱催化酸碱催化 4 4、共价催化共价催化 n催化剂通过与底物形成反应活催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化速度的过程，称为共价催化。n酶中参与共价催化的基团主要酶中参与共价催化的基团主要包括包括 His His 的咪唑基，的咪唑基，Cys Cys 的的硫基，硫基，Asp Asp 的羧基，的羧基，Ser Ser 的羟的羟基等。基等。n某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价磷酸吡哆醛等也
32、可以参与共价催化作用。催化作用。5 5、酶的活性中心是低介电区域酶的活性中心是低介电区域 酶的活性中心酶的活性中心穴内是疏水的非极性穴内是疏水的非极性环境。有利于酶的催环境。有利于酶的催化基团对底物敏感键化基团对底物敏感键的作用的作用 增强其反应增强其反应能力，加快反应速度。能力，加快反应速度。5.3 5.3 酶促反应的动力学酶促反应的动力学 用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的反应速度。测定反应的初速度初速度。10 20 30 40 50 60 min产产物物生生成成量量斜率=浓度/时间=一、酶反应速度一、酶反应速度二、
33、底物浓度对酶作用的影响二、底物浓度对酶作用的影响n在低底物浓度时在低底物浓度时,反应反应速度与底物浓度成正比，速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。表现为一级反应特征。n当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到结合后，反应速度达到最大值（最大值（V Vmaxmax），此时），此时再增加底物浓度，反应再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为速度不再增加，表现为零级反应。零级反应。SvVmax零级反应 v=k E一级反应 v=k S用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线的二相现象：用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线
34、的二相现象：S +EESE+P当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。的增加，中间络合物的浓度不断增高。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。米氏方程式米氏方程式（Michaelis-Menten equation,1913Michaelis-Menten equation,1913）k1k2k3设设 km=k2+k3k1v=Vmax Skm
35、 +S（kmS，v=k.S；km S，v=Vmax）米氏常数的意义及测定米氏常数的意义及测定 v=Vmax/2，则：km=S意义意义：（1 1）k km m是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而是酶的一个基本的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、与具体的底物有关，且随着温度、pHpH和离子强度而改变。和离子强度而改变。（2 2）从）从k km m可判断酶的专一性和天然底物。可判断酶的专一性和天然底物。K Km m最小的底物，通最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3 3）当）当k k2 2k k3 3
36、时，时，k km m的大小可以表示酶与底物的亲和性的大小可以表示酶与底物的亲和性。当当当当k k k km m m m大，说明大，说明大，说明大，说明ESESESES容易解离，酶与底物结合的亲和力小容易解离，酶与底物结合的亲和力小容易解离，酶与底物结合的亲和力小容易解离，酶与底物结合的亲和力小。从米氏方程中求得：从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的当反应速度达到最大反应速度的90%90%，则，则90%V=100%VS/(km+S)v=Vmax Skm +S即 S=9km在进行酶活力测定时，通常用在进行酶活力测定时，通常用4 4k km m的底物浓度即可。的底物浓度即可。米氏常数可根据
37、实验数据作图法直接求得：先测定不同底物米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从浓度的反应初速度，从v v与与SS的关系曲线求得的关系曲线求得V V，然后再从，然后再从1/21/2V V求得相应的求得相应的SS即为即为k km m（近似值）。（近似值）。通常用通常用:Lineweaver-Burk作图法作图法（双倒数作图法）（双倒数作图法）+1v=kmVmax S1Vmax11/Vmax-1/Km斜率斜率=Km/VmaxKm/Vmax三、酶浓度对酶作用的影响三、酶浓度对酶作用的影响n在有在有足够底物足够底物和和其他条件不其他条件不变变的情况下：的情况下：n n v
38、=k EEV四、四、pHpH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响pHv最适最适pH（optimum pH）1.1.最适最适pHpH 2.pH2.pH稳定性稳定性表现出酶最大活力的表现出酶最大活力的pHpH值。值。在一定的在一定的pHpH范围内酶是稳定范围内酶是稳定的。的。3.pH3.pH对酶作用的影响机制：对酶作用的影响机制：(1).(1).环境过酸、过碱使酶变性失活；环境过酸、过碱使酶变性失活；(2).(2).影响酶活性基团的解离；影响酶活性基团的解离；(3).(3).影响底物的解离。影响底物的解离。五、温度对酶作用的影响五、温度对酶作用的影响Tv最适温度最适温度温度的影响：温度的影响：
39、温度的影响：温度的影响：n 一方面是温度升高一方面是温度升高,酶促反应速度加快。酶促反应速度加快。n 另一方面另一方面,温度升高温度升高,酶的高级结构将发生变化酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低或变性，导致酶活性降低甚至丧失。甚至丧失。n 因此大多数酶都有一因此大多数酶都有一个最适温度。个最适温度。在最适温在最适温度条件下度条件下,反应速度最大。反应速度最大。六、激活剂对酶作用的影响六、激活剂对酶作用的影响凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。激活剂激活剂小分子有机物：抗坏血酸、半胱氨酸、小分子有机物：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等。谷胱甘肽等。金属
40、离子：金属离子：K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cr3+、Fe2+。注意使用浓度，激活剂的浓度过高、过低不激活反而注意使用浓度，激活剂的浓度过高、过低不激活反而注意使用浓度，激活剂的浓度过高、过低不激活反而注意使用浓度，激活剂的浓度过高、过低不激活反而抑制酶促反应。抑制酶促反应。抑制酶促反应。抑制酶促反应。七、抑制剂对酶作用的影响七、抑制剂对酶作用的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用酶的抑制作用。降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂抑制剂（I I）。）。抑制作用抑制作用可逆抑可逆抑制作用制作用竞争性
41、抑制作用竞争性抑制作用不可逆抑不可逆抑制作用制作用非竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用（一）（一）不可逆抑制作用不可逆抑制作用n不可逆抑制不可逆抑制-抑制剂与酶反应抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。合，引起酶的永久性失活。S +EESE+P+IEIn如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。抑制程度是由酶与抑抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。浓度决定。Ev1231.1.反应体系中不加反应体系中不加I I。2.2.
42、反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。量的不可逆抑制剂。3.3.反应体系中加入一定反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。量的可逆抑制剂。（二）（二）可逆抑制作用可逆抑制作用1、竞争性抑制作用、竞争性抑制作用n某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。制了。S+EESE+P+IEISvkmkm无 I有 IV/21 1）抑制剂和底物竞）抑制剂和底物竞
43、争酶的结合部位。争酶的结合部位。3 3）抑制程度取决于）抑制程度取决于I I和和S S的浓度以及与的浓度以及与酶结合的亲和力大酶结合的亲和力大小。小。2 2）竞争性抑制剂的）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分结构与底物结构十分相似。相似。竞争性抑制作用特点：竞争性抑制作用特点：2、非竞争性抑制作用、非竞争性抑制作用n酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂。n如某些金属离
44、子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+、HgHg2+2+）以及）以及EDTAEDTA等，通常等，通常能与酶分子的调控部位中的能与酶分子的调控部位中的-SH-SH基团作用，改变酶的空基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。间构象，引起非竞争性抑制。S +EESE+P+IEI+S+IEISE+P非非竟竟争争性性抑抑制制反竞争性抑制作用反竞争性抑制作用-抑制剂必须在酶与底物结抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成合后才能进一步形成ESIESI复合物。复合物。S +EESE+P+IESIE+P3 3、反竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用（八）酶的变（别）构效应（八）酶的变（别）构效应有
45、些酶具有类似血红蛋白那样的别构效应，称为别构别构酶酶。特点特点：1.一般是寡聚酶；2.具有别构效应；3.v对S不呈直角双曲线。SvS90%VS10%V=81S90%VS10%V 81S90%VS10%V 81ATCase（天冬氨酸转氨甲酰酶）的抑制剂是CTP，激活剂是ATP。Aspv+ATP+CTP+ATP使酶饱和使酶饱和V/2S0.5酶的制备与活力的测定酶的制备与活力的测定酶活力酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。是指酶催化某一化学反应的能力。酶（活力）单位：酶（活力）单位：酶（活力）单位：酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的
46、酶量。（的底物转化为产物所需的酶量。（U/gU/g，U/mlU/ml）在最适的反应条件（在最适的反应条件（2525）下，每分钟内催化一微摩尔）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即1IU=1mol/min在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需在最适条件下，每秒钟内使一摩尔底物转化为产物所需的酶量定为的酶量定为1kat1kat单位，即单位，即 1kat=1mol/s 1kat=6107IU工业上大多采用工业上大多采用微生物发酵微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。的方法来获得大量酶制剂。优点：优点：不受气候、地理条件的限
47、制，动、植物体内的酶大多不受气候、地理条件的限制，动、植物体内的酶大多可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量由丰富。还可可从微生物体内找到，微生物繁殖快，产酶量由丰富。还可以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。以通过选育菌种来提高酶的产量和用廉价原料大量生产。酶分离纯化的三个基本步骤：酶分离纯化的三个基本步骤：抽提，纯化，结晶或制剂。抽提，纯化，结晶或制剂。方法：方法：1.1.根据溶解度不同根据溶解度不同（盐析法、有机溶剂沉淀法、等（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）；电点沉淀法、选择性沉淀法）；2.2.根据酶与杂蛋白分子大根据酶与杂蛋白分子大小的差别小的差别（
48、凝胶过滤法、超离心法）；（凝胶过滤法、超离心法）；3.3.根据酶和杂蛋白根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）；（吸附分离法）；4.4.根据带电性质根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）；焦层析法）；5.5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别根据酶与杂蛋白的稳定性差别（选择性变（选择性变性法）；性法）；6.6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用（亲和作用（亲和层析法）。亲和层析法）。酶的纯度：酶的纯度：酶的纯度：酶的纯度：比活力比活力=
49、活力单位数活力单位数/毫克蛋白（氮）毫克蛋白（氮）纯化倍数纯化倍数=每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力产率产率%（回收率）（回收率）=100=100每次总活力每次总活力第一次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法酶的保存：酶的保存：1.1.低温（低温（0-40-4，-20-20）；）；2.2.高浓度较稳定；高浓度较稳定；3.3.加入稳定剂；加入稳定剂；4.4.固定化。固定化。酶的固定化酶的固定化就是把水溶性酶经就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）物理（吸附法与包埋法）或或化化学方法（共价偶联法与交联法）
50、学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。吸附法：吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。包埋法：包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。偶联法：偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。交联法：交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状网状”结构。结构。5.