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1、 丙二醛（丙二醛（MDA）含量的测定）含量的测定 丙二醛是膜脂过氧化最重要的产丙二醛是膜脂过氧化最重要的产丙二醛是膜脂过氧化最重要的产丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一。植物在逆境下遭受伤害与活物之一。植物在逆境下遭受伤害与活物之一。植物在逆境下遭受伤害与活物之一。植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。相关。相关。相关。植物生理学实验课件植物生理学实验课件植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，氧积累诱发的膜
2、脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）是膜脂）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。原理原理丙二醛在高温及酸性环境下可与丙二醛在高温及酸性环境下可与丙二醛在高温及酸性环境下可与丙二醛在高温及酸性环境下可与2-2-硫代巴比妥酸硫代巴比妥酸硫代巴比妥酸硫代巴比
3、妥酸（TBATBA）反应产生红棕色的产物）反应产生红棕色的产物）反应产生红棕色的产物）反应产生红棕色的产物3,5,5-3,5,5-三甲基恶三甲基恶三甲基恶三甲基恶唑唑唑唑2,4-2,4-二酮（三甲川），该物质在二酮（三甲川），该物质在二酮（三甲川），该物质在二酮（三甲川），该物质在532 nm532 nm处有一处有一处有一处有一吸收高峰，并且在吸收高峰，并且在吸收高峰，并且在吸收高峰，并且在660nm660nm处有较小光吸收。根据处有较小光吸收。根据处有较小光吸收。根据处有较小光吸收。根据其其其其532 nm532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。的
4、消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。醛、可溶性糖对此反应有干扰，在醛、可溶性糖对此反应有干扰，在醛、可溶性糖对此反应有干扰，在醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm450 nm处有一处有一处有一处有一吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除。原理原理硫代巴比妥酸丙二醛3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）仪器设备仪器设备1.分光光度计；分光光度计；2.研钵；研钵；3.剪刀；剪刀；4.恒温水浴；恒温水浴；5.试管：试管：20 mL4 6.离心
5、机。离心机。试剂试剂1.5%三氯醋酸；三氯醋酸；2.0.5%硫代巴比妥酸（用硫代巴比妥酸（用5%三氯醋酸三氯醋酸溶解定容）；溶解定容）；3.0.05 mol L1磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pH 7.8。材料材料正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米或其他植物的叶片。或其他植物的叶片。方法与步骤方法与步骤1取小麦植株上不同叶位的叶片取小麦植株上不同叶位的叶片35片，洗净擦干，剪成片，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段，混匀。长的小段，混匀。2称取叶片切段称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和英砂和2 mL 0.05
6、 mol L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆。磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用将匀浆转移到试管中，再用3 mL 0.05 mol L-1磷酸磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液。3在提取液中加入在提取液中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。硫代巴比妥酸溶液，摇匀。4将试管放入沸水浴中煮沸将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中，（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放出现小气泡开始计时）。到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。入冷水浴中。5待试管内溶液冷却后，待试管内溶液冷却后，3000g离心离心
7、15 min，取上清，取上清液并量其体积。以液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm和和450 nm处的消光值。处的消光值。计算结果计算结果式中，式中，Vt：提取液总体积（：提取液总体积（mL）；）；Vs：测定用提取液体积（：测定用提取液体积（ml）；）；FW：样品鲜重（：样品鲜重（g）。）。注意事项注意事项 1可溶性糖与可溶性糖与TBA显色反应的产物在显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。必要时要排除可溶性糖的干扰。2低浓度的铁离子能增强低浓度的铁离子能增强MDA与与TBA的显色反的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为（最终浓度为0.5 nmol L-1）3如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。最好使用低温离心机离心。思考题思考题 不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化不同植物在同一逆境下，丙二醛含量变化不同，说明了什么？不同，说明了什么？