第二章-组培资料.pdf

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1、 第二章 植物组织培养的基本理论、条件与操作技术 第一节 植物组织培养的基本理论 一、植物细胞的全能性及其表达 1.植物组织培养（Plant tissue culture）：在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture,shoot apex culture,apical meristem cultur

2、e)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养(protoplast culture)2.植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下进行表达，具有分化发育成完整植株的潜能，称为。植物组培诞生的理论基础。不同类型细胞全能性的强弱：卵细胞茎尖、根尖分生组织形成层薄壁细胞厚壁细胞（木质化）特化细胞（筛管等细胞）。3.植物细胞全能性的表达 全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为。全能性只是一种可能性。完整细胞核具有该植物体全套的遗传信息，是全能性

3、表达的内因。全能性表达须满足 2 个条件：1）脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制；2）营养和激素，使其脱分化与再分化。二、植物细胞的脱分化与再分化 1.细胞分化（Cell differentiation）定义：指在个体发育中，由同一种细胞类群经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同细胞类群的过程。细胞分化是组织与器官分化的基础。细胞分化的本质是基因差别表达。通过组培研究，揭示细胞的分化规律：1）成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。2）生理生化分化先于形态结构分化。3）完整植株中，细胞发育途径一旦被决定常不再改变，而离体培养可通过脱分化消除这种决定。4）极性是植物细

4、胞分化的基本现象，即在器官、组织、细胞中，在不同轴向上存在生理生化和形态结构的梯度差异。5）由不等分裂导致细胞分化的差异，说明细胞质在起作用。6）有位置效应，可能与生理状态和激素分布有关，导致基因表达差异。7）植物生长调节剂对细胞分化有关键调节作用。8）细胞分化时，常见核内多倍性和多线染色体。2.脱分化（dedifferentiation）:在组培过程中，已分化的成熟细胞失去原来的结构和功能，恢复为分生状态，经分裂形成愈伤，或只形成未分化细胞特性的过程为。分化的逆转。影响脱分化的因素：1)脱离母体：损伤是前提，自我调节和修复。2)生长调节剂：生长素起主要作用。3)外植体生理状态：对培养的反应不

5、同，如花器官较易，茎叶较难；幼嫩组织较易，老熟组织较难。4)基因型：双子叶易于单子叶，同种植物有差异。3.愈伤组织（callus）:在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。4.再分化/再生(redifferentiation/regeneration):由脱分化的愈伤组织或细胞在一定培养条件下重新分化，形成各种组织、器官甚至完整植株的过程。植物离体再生的途径：1）器官形成(organogenesis)：从愈伤组织或外植体形成不定芽、不定根，然后形成完整植株。2）体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)：从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构

6、（体细胞胚），进一步发育成完整植株。也可直接由外植体再生体细胞胚。组织培养的过程：第二节 植物组织培养的基本条件 一、实验室及其设备 1.准备室 主要设备：电冰箱、天平、酸度计、高压灭菌锅、烘箱等。2.接种室（无菌操作室）主要设备：超净工作台。3.培养室 主要设备：培养架、控光温设备、摇床、培养箱。4.细胞学实验室 主要设备：显微镜。主要以 13 为主。二、培养条件 1.温度：一般 25 2，过高过低抑制生长和分化。2.光照：每日光照 1216 h，光强 10005000 lx。3.湿度：室内相对湿度 70%80%,过低使培养基失分，过高易造成污染。4.氧气：封口膜、棉塞、纱布+牛皮纸。第三节

7、 培养基及其配制 一、培养基的成分 体外植物器官、组织和细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 根 芽 植物 培养基=水+无机有机激素固化剂其它 1.水：蒸馏水、自来水（大规模生产）。2.无机盐 1）大量元素：浓度大于 0.5mM 或 100mg/L。N：KNO3、NH4NO3，有时添加氨基酸；P：KH 2P04；K：KN03；Ca:CaCl2 2H2O;Mg,S:MgSO47H20 2）微量元素：浓度低于 0.5 mM 或 100 mg/L,一般 10-710-5M，缺少会导致生长、发育异常。Cu：CuSO4;Fe:FeSO47H20 与 Na2EDTA 2H20 的螯合物；B:H3BO3;Mn:M

8、nSO4 H20；Mo:Na2MoO4 Co:CoCl2 6H20 Zn:ZnSO4 7H20 3.有机化合物 1）糖：常用蔗糖（2%5%），葡萄糖和果糖等也用，大规模生产用绵白糖/砂糖。最常用的碳源（Carbon source）是蔗糖（sucrose），葡萄糖和果糖（Glucose and Fructose）也是较好的碳源，可支持许 多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖（Maltose,galactose,mannose and lactose）在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在 2%5%，常用 3%，即配制一升培养基称取 30g 蔗糖，有时可用 2.5%，但在胚培养时采用 4%

9、15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。2）维生素：用量一般 0.11.0 mg/L。常用：VBl(盐酸硫胺素)：促进愈伤组织的产生和生长；VB6(盐酸吡哆醇)：促进根的生长；VB3(烟酸)：与代谢和胚的发育有关；Vc：抗氧化，防止组织褐变。也用 VH(生物素)、叶酸和 VB12。3）肌醇：促进组织生长及胚状体、芽和细胞壁的形成。用量一般 50100 mgL。4）氨基酸及有机添加物：常用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；也用水解酪蛋白(CH，aa 混合物)。用量 101000mgL。营养丰富，易引起污染，一般不用。5）天然复合物：椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥、马铃薯泥等，含 aa、激素、酶

10、等化合物，促进细胞增殖与分化，但成分复杂，一般不用。4.植物生长调节物（plant growth regulator）植物激素：是植物新陈代谢中产生的天然 化合物，它能以极微小的量影响到植物 的细胞分化、分裂、发育，影响到植物 的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的 生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。植物激素包括：生长素，细胞分裂素，赤霉素，乙烯，脱落酸等，1）生长素类(auxin)：用量 0.0110 mg/L。在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促

11、进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(105-10-8 mgL)就可促进生长，其次是茎 和芽。2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）:起动能力比 IAA 高 10 倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）；NAA（naphthalene acetic acid，萘乙酸）:在组织培养中的起动能力要比 IAA 高出 34 倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。IAA（indo acetic acid，吲哚乙酸）:是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活 力

12、较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用、，高温 高压易被破坏，也易被细胞中的 IAA 分解酶降解，受光也易分解。IBA（indole butyri acid，吲哚丁酸）:促进发根能力较强的生长调节物质 作用强弱：2,4-D NAAIBA IAA。2,4-D 常用于愈伤的诱导，NAA 常用于生根。2）细胞分裂素类(cytokinin)：用量 0.110 mg/L。6-BA/BA（6-苄基氨基/腺嘌呤）；BAP(卞氨基嘌呤)；KT（kinetin，激动素）；Zt（zeatin，玉米素）2-ip（异戊烯基腺嘌呤）等。作用强弱：Zt2-ip6-BA/BAPKT。6-BA 和 KT 常用于诱

13、导不定芽的分化和茎、苗的增殖。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的 分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或 用量较低。3)赤霉素（Gibberellins,GAs）有 20 多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是 GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。4）脱落酸（Abscisic Acid,ABA）促进叶片离体（脱落）和种子休眠在水分胁迫下气孔关闭过程中起主要作用在干旱时促进胚胎形成，确保形成正常的胚胎。赤霉素和 ABA 都可以促进体胚

14、发生。激素配比模式 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高：有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素。适中：有利于根芽的分化。低：有利于芽的形成。5.固化剂 1）琼脂(agar)：用量 610gL。2）其他：滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。除上述 5 类外，特殊情况下加抗生素、活性炭。二、培养基的 pH 值 范围 5.56.0，一般 5.8。pH 值高于 6.5 时，培养基常变硬；低于 5.0 时，琼脂不能很好

15、凝固。高压灭菌会降低 pH 值约 0.20.3。pH 值用 0.1M 的 NaOH 和 HCl 来调整。三、培养基的渗透压 培养基中的盐类、蔗糖等影响渗透压，通常 12 个大气压即可。实际考虑不多。培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化 合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常 12 个大气压对植物生长有促进作 用，2 个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而 56 个大气压植物生长就会完 全停止，6 个大气压植物细胞就不能生存。四、常用培养基的种类和特点 1.MS：无机盐/离子浓度较高，且较平衡，广泛应用。2.B5：含较低的铵（常抑制生长），适合于双子叶特别是木本植物。3.White：无机盐含量较低

16、，适于生根培养。4.N6：成分较简单，KNO3 和(NH4)2 SO4 含量高，用于花药培养。5.KM-8P：有机成分复杂，包括多种单糖和维生素，用于原生质体培养。五、培养基的配制 1.母液(stock solution)的配制 为简便和精确而配，4 1 个月，沉淀或长菌丢弃。大量元素：1020 倍/微量元素：5001000 倍 铁盐：100 倍 有机物：100200 倍 生长调节物质：110 mg/L。注意：一些盐类易沉淀，应分别溶解再混合。用化学纯(CP)或分析纯(AR)药品及蒸馏水配制。配制方法：1）生长素类：先用少量 95%乙醇或 0.1mol/L 的 NaOH 或 KOH 助溶，再加

17、温水，冷却后定容。2）细胞分裂素类：先用少量 0.5mol/L 或 1mol/L 的 HCl 或 NaOH 溶解，再加温水，冷却后定容。3）铁盐：先将 EDTA-Na2 在 50水中溶解，然后加入 FeSO47H20或与 FeSO47H20 溶液混合，7580螯合 1h，棕色瓶存放。用螯合铁可避免沉淀，使铁缓慢释放。2.培养基的配制 1）在烧杯中放入一定量的水，依次加入大量元素、微量元素、有机物和铁盐母液；2）加入蔗糖；3）如果需要，加入肌醇等大量成分；4）定容，调 pH 值；5）加琼脂；6）装在大三角瓶中灭菌后分装，或先分装再灭菌。灭菌：高压蒸汽灭菌（1.01.1kg/cm2，121，152

18、0min），24 h 内完成，或放 42 天。注意：灭菌时间过长，有机物分解、糖焦化、盐沉淀、难凝固（琼脂解聚）。灭菌后培养基 pH 值下降 0.2-0.3 单位。过滤除菌的成分，待培养基温度 5060时加入。高压灭菌使蔗糖水解为单糖，渗透压变化；温度过高会使糖类焦化，可能有毒。培养基可预培养 3 天，无污染后再用。培养基存放于洁净处或 4冰箱，最好 2 周内用完，根据需要可遮光。第四节 离体无菌操作技术 一、灭菌方法 1.物理灭菌 1.1 高压高温蒸气灭菌（培养基、器皿、用具）原理：在密闭的灭菌锅内，蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，锅内温度也随之增加。在 1 atm/cm2(

19、0.1Mpa)的压力下，锅内温度达 121，持续约 20min，可杀死各种微生物的营养体及其孢子。1.2 灼烧灭菌（金属器械）镊子、剪子、解剖刀等浸入 95%的酒精，用前在酒精灯火焰上灼烧灭菌。1.3 过滤除菌（不耐热物品）玉米素、赤霉素、脱落酸和维生素等不耐热，用 0.22/0.45m 滤膜过滤除菌。液体量大时，用抽滤装置；液体量小时，可用注射器。1.4 干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）烘箱 160180，90120 min 杀灭微生物。此法能源消耗大，浪费时间，不推荐。1.5 紫外线照射灭菌（接种室、超净台）紫外线照射引起细菌蛋白和核酸发生变化、染色体变异而死亡。260nm 波长杀菌力最强。

20、适于空气和物体表面灭菌。2.化学灭菌 2.1 消毒剂 Disinfectant 灭菌 常用氯化汞、次氯酸钠、次氯酸钙、70%酒精。1）浸润灭菌：植物材料。2）喷雾灭菌：桌面、墙面、手臂等。2.2 熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体扩散到空气中，杀死空气和物体表面的微生物。常用熏蒸剂是甲醛，按 58mlm3 用量，置于广口容器中，加 5g/m3高锰酸钾氧化挥发。二、无菌操作技术 无菌操作：在经严格灭菌的超净台或接种室内，使用灭菌的器皿和用品进行操作，叫。超净台中操作步骤：1.打开超净台风机 hood，开紫外灯照 20min 左右；2.用 70%酒精对超净台和双手喷雾；3.未经高

21、压灭菌的镊子和剪刀等用灼烧灭菌；4.尽量在酒精灯火焰旁操作、接种；5.双手尽量不要离开工作台，避免说话和走动；6.操作完毕后清理工作台。常用灭菌剂的使用浓度及时间 灭菌剂 使用浓度（%）处理时间（min）去除难易 灭菌效果 对植物毒性 酒精 7075 0.22 易 好 有 次氯酸钙 910 530 易 很好 低毒 次氯酸钠 0.52 530 易 很好 无 氯化汞 0.11 58 较难 最好 剧毒 过氧化氢 1012 515 最易 好 无 硝酸银 1 530 较难 好 低毒 抗菌素 450mg/L 3060 中等 较好 低毒 三、外植体的灭菌与接种 1.外植体的选择 1）基因型：影响培养难易和再

22、生途径，草本比木本、双子叶比单子叶易于成功。2）取材季节：野外最好在生长开始和旺长季节。3）发育年龄和生理状态：取幼龄、幼嫩（活跃）部位。首选茎尖，分生能力强、遗传性稳定、病毒少或无，但来源有限，常用无菌苗各部位组织。2.外植体的灭菌 无菌苗可直接切取外植体和接种。带菌材料需消毒灭菌，才能切取外植体进行接种。灭菌步骤：取材切割自来水冲洗（几分钟至数小时）7075%酒精 2060 sec（浸湿表面）无菌水冲洗灭菌剂处理无菌水冲洗切取外植体接种。注意：冲洗可加吐温 tween(表明活性剂)或洗衣粉；从酒精消毒开始在超净台操作，30sec 左右；升汞用无菌水冲洗 56 次。3.接种 将灭过菌的材料剪

23、切适当大小：叶片 0.5cm2，茎段 0.5cm 长，茎尖0.20.3mm 大小（含 l2 个叶原基 leaf primordium），接种于培养基，封口，标名称、日期等，在适宜条件下培养。接种过程中谨防污染。1，酒精消毒双手，2，外植体消毒，3.浸泡 5min，4.器械消毒，5.灼烧消毒，6.7.酒精消毒器皿，8.旋转灼烧器皿，9.修剪外植体，10.11.取出外植体转接到培养基上，12，封好瓶口 进行愈伤组织的培养。四、培养过程中的污染及对策 1.细菌性 Bacteriological 污染 症状：接种后 13 d，外植体附近粘液状（mucoid）、泡沫状（spumescence）、混浊（dirty）、云雾状（nebulous）痕迹。污染原主要来自外植体。对策：严格操作，对外植体彻底灭菌。2.真菌性污染 症状：接种后 38 d，外植体附近或培养基上长霉斑（mildew spot）。污染原主要来自空气。对策：清洁环境，清洗或更换超净台过滤装置，严格操作。