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1、阿德福韦联合恩替卡韦治疗多药物作用后的慢性乙型肝炎的早期疗效评估及其影响因素分析张长江，熊瑜琳，谭朝霞，周霞，朱研，李权泗，王小红 (第三军医大学西南医院全军感染病研究所，重庆400038)摘要目的 观察阿德福韦酯(Adefovir, ADV)联合恩普卡韦(Entecavir, ETV)治疗多种核甘(酸)类似物 (nuclcosidc/nuc loot ide analogues, NAs)序贯治疗失败的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)的早期疗效，分 析影响早期疗效的风险因素。方法 收集51例经过多NAs治疗失败，最后接受ADV+ETV联合治疗的CHB患者，分析
2、临床 一般特征，对其肝脏生化学指标、免疫学指标及病毒学指标进行检测；对潜在影响联合治疗早期疗效的11个变量进行单 因素分析，继之进行非条件logistic回归分析。结果51例患者半年内HBV DNA下降大于1 x 10拷贝/m】或达到不可测 水平的有39例，早期应答率达76.5乐非条件Logisitic回归分析显示影响联合治疗的因素有：基线丙氨酸氨基转移醐 (alanine aminotransferase, ALT)水平(片0.028, 3M.021, 95% 夕：1.0021.039)和联合治疔前接受 NAs 治疗的时间 (任0. 0290. 05,。庐0. 945, 95%C/:0. 8
3、98-0. 994)。结论ADV+ETV是多种NAs序贯治疗失败CHB患者的有效补救治疗 措施；基线ALT水平水平越高、联合治疗前NAs治疗时间越短的CHB患者联合治疗应答率越高。关键词肝炎病毒，乙型；核音类似物；联合疗法；早期疗效中图法分类号文献标志码AStudy on early response and risk factors of Adefovir and Entecavir combination treating chronic hepatitis B after the treatment of multi-antivirus drugs sequential therapyZ
4、hang Changjiang, Xiong Yuli, Tan Zhaoxia. Zhou Xia, Zhu Yan, Li Quanrun, Wang Xiaohong (Institute of Infectious Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)Abstract! Objective To investigate the early response to Adefovir Dipivoxil (ADV) and Entecavir (ETV
5、) combination therapy in patients with chronic hepatitis B (CHB), who has underwent multi-nucleoside/nucleotide analogues (NAs), and analyze the risk factor. Methods There are 51 of patients who experienced failure of multi-NAs sequential treatment and finally received ADV+ETV combination therapy. C
6、linical features were collected. Alanine aminotransferase (ALT) level, HBeAg status, hepatitis B virus (HBV) DNA level, HBV genotype and NAs-resistant mutation were delected. 11 of potential risk factors for the early response to ADV+ETV were analyzed by Binary logistic regression. Results 39 of 51
7、patients received ADV+ETV combination therapy obtained the early response (i.e. HBV DNA level decreased more than 1 x 1(P copies/ml or undetectable during 6 months). The early response rate is 76.5%. The logistic regression showed that baseline ALT level (P=0.0280.05) and the duration of undergoing
8、NAs sequential treatment prior to combination therapy with ADV+ETV (P=0.0290.05) were of statistical significance. Conclusion ADV+ETV therapy is effective rescue strategy in patients who experienced failure of multi-NAs sequential treatment. Higher baseline ALT level and shorter duration of undergoi
9、ng sequential antiviral drugs before combination therapy with ADV+ETV are helpful for patients to obtain the early response (o successive ADV+ETV.Key words: hepatitis B virus, nucleoside/nucleotide analogue, drug therapy, combination, early response治疗的关键措施，临床证据表明抗HBV治疗可延缓通信作者：王小红.电话：(023) , E-mail:疾
10、病进展、提高生活质量及延长生存期。目前，抗抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 1IBV药物包括核甘(酸)类似物(nuclcosidc/nu- 治疗是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB) cleotide analogues, NAs)及干扰素两大类药物，然而，这些药物尚不能清除患者肝细胞内共价闭合 环状 DNA（covalent closed circular DNA, cccDNA）, 尤其是NAs类药物，故CHB患者需长期抗病毒治疗。 然而，随着NAs药物治疗时间的延长，耐药发生率 也在增加工随着对耐药产生机制的认识，NAs抗 HBV
11、治疗经历了单药、单药序贯及序贯联合治疗的过 程。在我国，已有大量接受单药、单药序贯及序贯 联合治疗的患者人群，且数量仍会增加。因此，该 患者人群最终的治疗转归值得关注。本研究对多种 核首类药物序贯治疗失败的CHB患者接受阿德福韦 酯（adefovir, ADV） +恩替卡韦（entecavir, ETV） 联合治早期疗效的影响因素进行了回顾性研究。1 资料与方法病例选择2007年3月至2009年6月在本科接受ADV （10 mg, 口服，1次/d） +ETV （0.5mg, 口服，1次/d）联合治疗的CHB患者51 例，患者在ADV+ETV.联合治疗前已接受拉米夫定、ADV、ETV 或替比夫定
12、单药或拉米夫定联合ADV或替比夫定联合ADV治 疗，并且均治疗失败（指序贯治疗过程中出现HBVDNA升高或 ADV+ETV联合治疗前36个月内HIW DNA下降小于10拷贝 /ml）,剔除并丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人类免疫缺陷 病毒感染，合并自身免疫性肝病、失代偿性肝病以免疫抑制 剂治疗的患者。所有入选患者符合2005年12月中华医学会肝 病学分会和感染病学分会联合制定的慢性乙型肝炎防治指 南诊断标准，且依从性好。51例CHB患者男性44例,女性7例,年龄（39.09.9）岁, 病程（12.26.5）年，B基因型39例，占76. 5舟，C基因型12 例，占23.5$。基线（是指患者第1次接
13、受As治疗的时间） lg（HBV DNA）为（7. 400. 96）拷贝/ml、中位丙氨酸氨基转 移酶（alanine aminotransferase, ALT）水平为 185IU/L、 HBeAg阳性36例，占70.6%, HBeAb阳性32例，占62. 7乐 其中 HBeAg和HBeAb同时阳性17例，占33. 3%。ADV+ETV联合治疗前 接受NAs治疗时间（45. 421.6）个月,ADV+ETV治疗前lg（HBV DNA）为（4.931.53）拷贝为1、中位ALT水平为43 IU/L。研究分组，应答组：ADV+ETV联合治疗6个月HBV DNA降 至不可测水平,或者HRV DNA
14、下降eixlO拷贝/ml；应答不 佳组：ADV+ETV联合治疗6个月HBVDXA未降至不可测水平，或 者HBV DNA下降W1X 10拷贝/ml。患者每23个月门诊随访 HBV DNA定量、肝功、肾功、乙肝病毒5项、血常规等指标。1.1 生化学及免疫学检测生化学指标采用日立7020全自动生化分析仪检测。血清 HBV标志物采用Roche电化学发光法（Roche公司）检测。1.2 血清病毒学指标检测1.3. 1血清HBV DNA定量检测 血清HBV DNA定量采用 LightCycler荧光定量PCR仪和HBV DNA定量试剂盒（上海科 华公司）检测，最低检测值为IX 10,拷贝/ml。1. 3.
15、 2 HBV逆转录酶（reverse transcriptase, RT）区耐药 变异检测采用标准破裂解-蛋白酎K消化-酚/氯仿/异戊醇（25： 24： 1）抽提制备HBVDNA模板I 对HBV逆转录酶区 396bp的片段进行PCR扩增，目的片段包含已知的NAs药物相关 的主要耐药变异位点。正向引物P1为5，-CY （T/C） TGTATTCCCATCCCATC-3/ （597-615 nt），反向引物P2 为5 -TGACATACTTTCCAATCAATAGG-3; （ 970992 nt）。PCR产物 由上海生工测序,测序引物为P1。获得序列采用BioEdit 7. 0.5分析耐药变异。1
16、.3.3 HBV基因分型 对已行测序检测的患者采用 CluslalX 1.8. 3进行序列比对，NimbleTree进行系请分析基 因型测定。部分患者行引物特异性PCR扩增方法进行基因分 型叫Logisit ic回归分析的应变量和自变量设定应变量y是接受ADV+ETV治疗6月否应答（1=应答，2=应 答不佳）。初步认为影响ADV+ETV治疗疗效的因素（自变量） 可能有年龄（XI:男=1,女=2）、性别（X2）、病程（X3）、 HBeAg状态（X4:阴性=1,阳性=2）、HBV基因型（X5: B型=1, C型=2）、基线HBV DNA水平（X6）、基线ALT水平（X7 ）、ADV+ETV 开始治
17、疗时HBV DNA水平（X8）、ADV+ETV开始治疗时ALT水平 （X9）、ADV+ETV联合治疗前是否发现ADV/ETV耐药变异（X10: 发现=1,不发现=0）、ADV+ETV治疗前接受NAs治疗的月数 （XII）=统计学分析采用SPSS 11. 5统计软件进行数据分析,HBV DNA定量在 进行统计分析前取对数值（低于检测值时取3.0） 对各计数 资料以频数和百分比表示，进行检验或Fisher精确概率 法检验：对近似正态分布的计量资料以支土s表示，进行独 立样本检验：对偏态分布的计量资料以中位数表示，进行 Mann-whitney ，检验。为不遗漏一些可能有意义的因素，确 定选入或剔除
18、的检验水准为a =0. 10,然后进行多因素非条件 Logisitic回归分析,检验水准a =0.05,自变量筛选采用最 大似然估计向后逐步删除法（Backward： LR）。2 结果1 ADV+ETV联合治疗的早期疗效51例患者接受ADV+ETV联合治疗时间（10. 97. 5）个月, 最长约40个月，获得早期应答患者39例，应答不佳患者12例， 早期应答率约76. 5%, ADV+ETV联合治疗过程中无明显不良事 件发生。2.2 ADV+ETV联合治疗前耐药变异44例患者进行了 HBV-RT区测序，30例检测到1个以上耐药 变异（少数患者M检测到3个以上耐药变异），14例未检测到 耐药变异
19、，变异检出率为68.2与。具体耐药变异分布见表1。表1 ADV+ETV联合治疗前耐药变异分布蛆别rtl8l(例)rt236(例)r48Mrt236(例)rtl80+rt204(例)rt2O4()rt2l5(例)rt 194(例)rt250(W)应答组（n=39）43192111应答不佳组（n=12）12151101总计（例）552143212rt: HBV逆特亲酪；rt后数字代表HBV RT爱白发生氢基酸直换的位置表2单因素分析法分析多NAs作用后影响ADV+ETV联合治疗早期疗效的因素组别性别例（%）基因型例（劭耐药变异例R）基线水平ADV+EIV联合治疗时年龄 （岁）病程 （年）HBcAg
20、 阳 性画数%)1治疗时间（月）男性女性BK!C型发现未发现未桧测IglHBVDNA) (拷如ml)ALT(IU/L)llinv DMAl(拷贝 /ml)ALT(IU/L)应答如3362019201367. 34 1921.81 +4039. 112.22839. 5 (n=39)(85%)(15%)(51%)(49*)(51%)(33%)(15%)1.021.4510.25. 1(72%)20.2应答不佳1113910117. 58 1585. 35 5137.612.3858. 6 组 5-12)(92%)(8%)(25%)(75%)(83%)(8%)(8%)0. 731.799.910.
21、 1(67%)18.0统计使2/= 1.609加0.729-2. 722尸1.079=-1.066r=0.461t=0. 027万2.923P(iL1.0000. 2050. 0760. 4690. 0060. 2860. 2860. 6470.9790. 7300. 005HBV:乙型肝炎病毒：ALT:丙乳酸乳基转移酶：基蝮：第1次接受NAs治疗时a: ADV+ETV治疗前是否发现时药变异（其中有7例未行HBV逆转录解区测序分析）：b: ADV+ETV治疗肺拄受NAs治疗的月数2.3 单因素分析法分析多NAs作用后影响ADV+ETV联合治疗早期疗效的因素多NAs作用后，影响ADV+ETV联合
22、治疗早期疗效的单因素 分析显示：年龄、性别、基因型、病程、HBcAg阳性、基线HBV DNA水平、开始接受ADV+ETV联合治疗时的HBV DNA水平以及 ALT水平对ADV+ETV联合治疗早期疗效的影响无统计学意义 （处0. 1）,而基线ALT水平（a-2. 722,40.006）、联合治 疗前是否发现ADV或ETV的常见耐药位点（P=0. 076）和联合治 疗前接受NAs治疗的时间（t=2. 923,六0. 005）因素与ADV+ETV 联合治疗的早期疗效相关（表2）。2.4 多因素非条件Logisitic回归法分析多NAs作用后影响ADV+ETV联合治疗早期疗效的因素在单因素分析的基础上
23、，对基线ALT水平、ADV+ETV联合 治疗前是否发现ADV/ETV耐药变异及ADV+ETV联合治疗前的 NAs治疗时间，进行多因素非条件Logisitic回归分析。如表3 所示，多因素非条件Logisitic分析最终结果显示基线ALT水 平（/X0.05）和ADV+ETV联合治疗前接受NAs治疗的时间（秋0. 05）对ADV+ETV联合治疗早期疗效的影响具有统计学意 义。表3多因素Logisitic回归法分析多NAs作用后影响ADV+ETV联合治疗早 期疗效的因素ALT:丙氨酸氮基转移尊：a：指第1次授受NAs治疗时ALT水平：b:拒ADV+ETV 联合治疗前经NAs治疗时间再响因素6aid
24、 72产僮0R 值(95% C1)ALT水平”0.0200. 0091.8160. 0281.021 (1.002-1.039)治疗时间-0. 0570. 0264.7420.0290. 945(0.8980.994)常数项-0.0391.9060. 0000. 9830.9612.5 模型拟合显著性检验采用Backward: LR,得模型显著性检验，/2=21. 141, 片0. 000,说明本例可以用Logisitic模型拟合。逐步回归后 模型预测准确率为90.皴，比回归前的88. 6%和模型中未引入 任何自变量的75. 0%分别高2. 3%和15. 9量3讨论临床实践中，ADV+ETV联
25、合治疗被用于多种 NAs序贯治疗失败患者的补救治疗措施之一，但目 前仍没有可靠的循证医学证据支持18刈，仅有个案 报道L本研究对51例经多种NAs序贯治疗失败， 最后接受ADV+ETV联合治疗的患者进行回顾性研 究，评估了 ADV+ETV联合治疗的早期疗效，分析 了影响早期疗效的因素。本研究结果显示，在ADV+ETV联合治疗 （10.97.5）个月期间，ADV+ETV联合治疗多种 NAs序贯治疗失败的CHB早期应答率为76.5%,且 无明显不良事件发生，提示ADV+ETV是多种NAs 序贯治疗失败CHB患者的有效补救治疗措施。本研究对ADV+ETV联合治疗早期疗效的11个 潜在影响因素进行单因
26、索分析，结果显示患者的基 线ALT水平、联合治疗前接受NAs治疗的时间及联合 治疗前是否检测到ADV/ETV的常见耐药变异与联合 治疗早期疗效有关（产值分别为0.006、0.005和 0.076），而年龄、性别、基因型、病程、基线HBV DNA 水平、开始接受ADV+ETV联合治疗时的HBV DNA 水平以及ALT水平对ADV+ETV联合治疗的早期疗 效影响无统计学意义（P0.1）。进一步多因素非条 件logistic回归分析后显示基线ALT水平（P=0.028, 0R= 1.021, 95%CI： 1.0021.039)和ADV+ETV联 合治疗前NAs治疗时间(P=0.029, ORR.9
27、45,95%CI： 0.8980.994)对ADV+ETV联合治疗接受过多种 NAs序贯治疗失败CHB患者的早期疗效影响具有统 计学意义。上述研究结果提示，基线ALT水平是决 定患者是否开始接受NAs治疗的重要因素，它不但影 响开始抗病毒治疗的疗效，而且影响着后续 ADV+ETV联合抗病毒治疗的转归，而联合治疗前 ALT水平对ADV+ETV联合治疗的早期疗效无统计 学意义，支持目前的观点即耐药发生后，临床工作 中更换抗病毒药物不应以是否出现ALT升高为依据 。对于曾经接受多种NAs治疗失败的CHB患者, ADV+ETV联合治疗前接受的多种NAs序贯治疗时 间越长，此联合治疗的早期疗效越差，考虑
28、与应答 不佳者多位点耐药联合变异的发生率高有关，与最 近的研究结果一致Hl提示NAs治疗失败后尽早采 用ADV+ETV联合治疗方案。值得注意的是，与初始NAs治疗的疗效影响因素 分析不同，联合治疗前是否发现耐药变异和 H B VDN A水平对ADV+ETV联合治疗的早期疗效无 统计学意义，考虑可能与病例数有限、未耐耐药变 异进行分级等有关。由于ADV+ETV联合治疗是最近推荐的联合治 疗方案，加之费用昂贵，故本研究收集的病例数和 随访时间有限。将来，有必要进一步扩大病例数， 将联合治疗前的耐药变异、基线ALT水平等因素进 行详细分级分析(如将耐药变异的个数进行分级， 对ALT正常、12倍正常值
29、上限、2倍以上正常值 上限等进行详细分级等)，另一方面，继续对患者 进行随访，研究其远期疗效及其影响因素。总之，ADV+ETV联合治疗多种NAs序贯治疗 失败的CHB患者安全有效。进行抗病毒治疗前，基 线ALT水平是决定是否开始抗病毒治疗关键因素。 NAs治疗过程中，如出现NAs耐药，应尽早采用联 合治疗。参考文献1 Lok AS, McMahon B J. Chronic hepatitis B J. Hepatology, 2007, 45(2): 507-539.2J Lok A S, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resist
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