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1、会计学1PCR法获取目的基因法获取目的基因PCRPCRPCRPCR技术的定义及其发展历史技术的定义及其发展历史技术的定义及其发展历史技术的定义及其发展历史PCRPCRPCRPCR技术的原理技术的原理技术的原理技术的原理 PCRPCRPCRPCR的反应体系和条件的反应体系和条件的反应体系和条件的反应体系和条件PCRPCRPCRPCR法获取目的基因法获取目的基因法获取目的基因法获取目的基因PCRPCRPCRPCR技术的未来展望技术的未来展望技术的未来展望技术的未来展望第1页/共22页PCR技术技术 多聚酶链式反应多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)PCR技术即多聚酶
2、链式反应，又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。在生物学实验中做为基础存在，可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。第2页/共22页一、一、PCR技术的创建技术的创建1.Khorana1.Khorana等等19711971年提出在体外经年提出在体外经DNADNA变性、变性、与适当引物杂交、再用与适当引物杂交、再用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸,克隆克隆DNADNA的设想。的设想。2.19832.1983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技术技术,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。3.19883.1988年年Saik
3、iSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq）引入了）引入了PCRPCR技术。技术。4.19884.1988年，第一台年，第一台PCRPCR仪问世。仪问世。5.19895.1989年美国年美国ScienceScience杂志比喻杂志比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。第3页/共22页二、二、PCR技术的原理技术的原理 1.PCR1.PCR技术技术技术技术在微量离心管中在微量离心管中,加加入适量的缓冲液入适量的缓冲液,微量的微量的模板模板DNA,四种脱氧核苷四种脱氧核苷
4、酸酸,耐热性耐热性DNA聚合酶聚合酶,一一对合成对合成DNA的引物的引物,通过通过高温变性高温变性、低温退火低温退火和中和中温延伸温延伸三个阶段的循环合三个阶段的循环合成成DNA，每一次循环使，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过大一倍。一般样品经过30次循环次循环,可使基因的拷可使基因的拷贝数达到数百万。贝数达到数百万。第4页/共22页 PCRPCR原理原理原理原理 （1）类似于）类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在在 （3）重复）重复“变性变性-退火退火-延伸延伸”的循环，可获得大
5、量的新的循环，可获得大量的新DNA链，而链，而且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量且这种新链又可成为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。产物，数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。（2）PCR过程：由变性过程：由变性复性（退火）复性（退火）-延伸三个延伸三个基本反应步骤构成基本反应步骤构成 变性：变性：94左右，使双链左右，使双链DNA模板解离成为模板解离成为单链；单链；复性：复性：55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链互补单链互补配对结合；配对结合；延伸：延伸：72左右，左右，“模板模板-引物结合物引物结合物”在
6、在DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的合成新的DNA链链第5页/共22页2.PCR2.PCR技术的特点技术的特点技术的特点技术的特点1 1）速度快，灵敏度高：经过）速度快，灵敏度高：经过）速度快，灵敏度高：经过）速度快，灵敏度高：经过3030轮循环，理论上目的产物的轮循环，理论上目的产物的轮循环，理论上目的产物的轮循环，理论上目的产物的 扩增量达扩增量达扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（个拷贝（个拷贝（101099拷贝）。拷贝）。拷贝）。拷贝）。2 2）特异性：
7、引物的序列及其与模板结合的特异性是决定）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。3 3）操作简便易行：
8、只需要数小时就可以用电泳法检出）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1g1g基因组基因组基因组基因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。第6页/共22页三、三、PCR的反应体系和基本步骤的反应体系和基本步骤H H2 2O O 3535L L10PCR10PCR反应缓冲液反应缓冲液反应缓冲液反应缓冲液 55L L25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 44L L4 4种种种种dNTPdNTP 44L
9、 L上游引物（引物）上游引物（引物）上游引物（引物）上游引物（引物）0.50.5L L下游引物（引物）下游引物（引物）下游引物（引物）下游引物（引物）0.50.5L L模板模板模板模板DNADNA (约约约约1ng)1ng)0.50.5L LTaqTaq酶酶酶酶 0.50.5L L 1.1.反应体系组成成分反应体系组成成分反应体系组成成分反应体系组成成分（总体积：（总体积：（总体积：（总体积：50 50 L L）第7页/共22页模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2+预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNT
10、P 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2+TaqDNATaqDNA聚合聚合聚合聚合酶酶酶酶9494 5min5min2.2.基本程序基本程序基本程序基本程序PCR排管第8页/共22页Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferMgMg2+2+循循循循环环环环仪仪仪仪949455 55 72 72 72 72 5 57 min7 min扩增出的目标基因第9页/共22页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳转移点样进行电泳扩增出的目的基因第10页/共22页3.PCR3.PCR反应条件反应条件反应条件反应条件循环参数循环
11、参数循环参数循环参数（1 1）预变性：）预变性：）预变性：）预变性：94 94 5 min 5 min（2 2）变性：）变性：）变性：）变性：94 94 20 s-45 s 20 s-45 s 使双链使双链使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链解链为单链解链为单链（3 3）退火：温度由引物的解链温度）退火：温度由引物的解链温度）退火：温度由引物的解链温度）退火：温度由引物的解链温度TmTm决定，时间决定，时间决定，时间决定，时间45 s45 s左右。左右。左右。左右。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度增加温度能减少引物与模板的
12、非特异性结合；降低温度增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度 可增加反应的灵敏性。可增加反应的灵敏性。可增加反应的灵敏性。可增加反应的灵敏性。（4 4）延伸：一般为）延伸：一般为）延伸：一般为）延伸：一般为7272，时间由扩增片段长度决定。，时间由扩增片段长度决定。，时间由扩增片段长度决定。，时间由扩增片段长度决定。（5 5）循环次数：主要取决于模板）循环次数：主要取决于模板）循环次数：主要取决于模板）循环次数：主要取决于模板DNADNA的浓度，一般为的浓度，一般为的浓度，一般为的浓度，一般为25-3525-35次次次次 次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入次数过多，导致扩增效率降低
13、，错误掺入次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入 率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。率增加。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。（6 6）延伸补齐：）延伸补齐：）延伸补齐：）延伸补齐：72 72 5 min10 min 5 min10 min第11页/共22页PCR技术的注意事项1.合理分隔实验室合理分隔实验室将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PC
14、R产物的鉴定应与其他步骤严格分开。2.吸样枪吸样枪由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3.试剂分装试剂分装所有的PCR试剂都应小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂和PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存。4.防止操作人员污染防止操作人员污染一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。第12页/共22页四、四、PCR法获取目的基因法获取目的基因第13页/共22页n n由由由由Taq DNATaq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩
15、增的聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCRPCR产物中，其产物中，其产物中，其产物中，其33末端总是会带有一个非模板依赖型的突末端总是会带有一个非模板依赖型的突末端总是会带有一个非模板依赖型的突末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是出碱基，而且这个碱基几乎总是出碱基，而且这个碱基几乎总是出碱基，而且这个碱基几乎总是A A，因为，因为，因为，因为Taq DNATaq DNA聚合酶对聚合酶对聚合酶对聚合酶对dATPdATP具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用由于该突出碱基的存
16、在，克隆时可以使用由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T T载体克隆目的基因。载体克隆目的基因。载体克隆目的基因。载体克隆目的基因。1.T1.T载体克隆载体克隆载体克隆载体克隆PCRPCR获取的目的基因获取的目的基因获取的目的基因获取的目的基因第14页/共22页 具有具有具有具有3-5 3-5 外切酶活性的外切酶活性的外切酶活性的外切酶活性的DNA DNA 聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如聚合酶（如pfupfu聚合酶），其聚合酶），其聚合酶），其聚合酶），其扩增的扩增的扩增的扩增的PCR PCR 产物是平末端产物是平末端产物是平末端产物是平末端,要对这种平末端的要对这种平末端的要对这种平末端的要
17、对这种平末端的PCR PCR 产物进产物进产物进产物进行克隆行克隆行克隆行克隆,应首先对应首先对应首先对应首先对PCRPCR产物的产物的产物的产物的33末端进行加末端进行加末端进行加末端进行加A A的工作。工作的工作。工作的工作。工作的工作。工作程序如下程序如下程序如下程序如下方案一方案一方案一方案一胶回收平末端胶回收平末端胶回收平末端胶回收平末端 PCRPCR产物，进入产物，进入产物，进入产物，进入5l 10Tag DNA Polymerase Buffer5l 10Tag DNA Polymerase Buffer、4 4种种种种dNTPdNTP或或或或dATPdATP（终浓度为（终浓度为
18、（终浓度为（终浓度为200nM200nM）、）、）、）、2.5U Tag DNA Polymerase2.5U Tag DNA Polymerase，加水至终反应体积为加水至终反应体积为加水至终反应体积为加水至终反应体积为 50l50l，7272 保温保温保温保温10min10min，纯化，纯化，纯化，纯化 PCRPCR片段后进行片段后进行片段后进行片段后进行TATA克隆克隆克隆克隆方案二方案二方案二方案二PCR PCR 反应（反应（反应（反应（50l 50l 反应体积）结束以后，加入反应体积）结束以后，加入反应体积）结束以后，加入反应体积）结束以后，加入1l 20mM dATP 1l 20m
19、M dATP 和和和和2.5U 2.5U 的的的的Tag Tag 酶，酶，酶，酶，7272 保温保温保温保温10min 10min，然后进行直接进行，然后进行直接进行，然后进行直接进行，然后进行直接进行TATA克隆克隆克隆克隆第15页/共22页2.2.设计酶切位点克隆设计酶切位点克隆设计酶切位点克隆设计酶切位点克隆PCRPCR获取的目的基因获取的目的基因获取的目的基因获取的目的基因355限制性内切酶的识别序限制性内切酶的识别序限制性内切酶的识别序限制性内切酶的识别序列列列列目的基因的目的基因的目的基因的目的基因的PCRPCR片段片段片段片段355限制性内切酶的识别序限制性内切酶的识别序限制性内
20、切酶的识别序限制性内切酶的识别序列列列列经限制酶切割得到的具经限制酶切割得到的具经限制酶切割得到的具经限制酶切割得到的具有粘性末端的线性载体有粘性末端的线性载体有粘性末端的线性载体有粘性末端的线性载体经限制酶切经限制酶切经限制酶切经限制酶切割得到粘性割得到粘性割得到粘性割得到粘性末端末端末端末端体外连接体外连接体外连接体外连接获得目的基因的克隆获得目的基因的克隆获得目的基因的克隆获得目的基因的克隆第16页/共22页1 1、不对称、不对称、不对称、不对称PCRPCR2 2、反向、反向、反向、反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)3 3、多重、多重、多重、多重PCRP
21、CR（复合（复合（复合（复合PCRPCR）4 4、LP-PCR LP-PCR（Labelled primers)Labelled primers)5 5、锚定、锚定、锚定、锚定PCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）6 6、PCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法7 7、原位、原位、原位、原位PCRPCR8 8、反转录、反转录、反转录、反转录PCRPCR（RT-PCR)RT-PCR)9 9、荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)五、五、PCRPCR的类型的类型第17页/
22、共22页荧光定位PCR技术（FQ-PCR）FQ-PCR的工作原理是利用Taq 酶的5 3外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5端标以荧光报告基团，靠近3端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号,实现了仪器实时检测，为新的PCR定量原理创造了条件。第18页/共22页PCR技术
23、的应用举例：技术的应用举例：研究：基因克隆；研究：基因克隆；DNADNA测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结测序；分析突变；基因重组与融合；鉴定与调控蛋白质结 合合DNADNA序列；序列；转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生转座子插入位点的绘图；检测基因的修饰；人类基因组工程：用散布重复序列产生DNADNA标志；标志；遗传图谱的构建遗传图谱的构建(检测检测DNADNA、多态性或精子绘图多态性或精子绘图)；物理图谱的构建；测序，表达图谱；物理图谱的构建；测序，表达图谱法医：犯罪现场标本分析，法医：犯罪现场标本分析，DNADNA检测比对，检测比对，
24、DNADNA安保标记。安保标记。医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。组织和群体生物学：遗传聚类研究；动物保护研究。古生物学：考古与博物馆标本分析。古生物学：考古与博物馆标本分析。动物学：动物传染病的诊断等。动物学：动物传染病的诊断等。植物学：检测植物病原等。植物学：检测植物病原等。第19页/共22页PCR技术的未来展望技术的未来展望 到2030年，由于基因技术的空前发展，一个人的全部基因组序列可能只需要1000美元就能得到。基因定制，基因医疗，基因药物都不会再是设想，而将逐渐成为现实，而这一切，都建立于PCR技术所树立起来的基础之上。随着技术发展，个人基因信息也许会成为新的重要隐私。第20页/共22页谢谢！谢谢！请老师和同学们批评指正。请老师和同学们批评指正。第21页/共22页