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1、血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离2 2答答（1 1）提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNADNA的难度大。的难度大。这是因为，与这是因为，与DNADNA相比，蛋白质对温度、盐相比，蛋白质对温度、盐浓度、浓度、pHpH等条件要敏感得多，很容易失活；等条件要敏感得多，很容易失活；（2 2）并且蛋白质的空间结构多种多样，理）并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。特性摸索提取的条件，设计特定的方法。P57练习：练习：复习复
2、习:1、造成蛋白质结构多样性的原因？、造成蛋白质结构多样性的原因？2、举例说明蛋白质功能的多样性。、举例说明蛋白质功能的多样性。根据蛋白质的哪些特性，可以将不根据蛋白质的哪些特性，可以将不同种类的蛋白质分离开来？同种类的蛋白质分离开来？分子的形状和大小、所带电荷的分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。其他分子的亲和力等。（一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1、定义：、定义：根据相对分子质量的大小分离蛋白根据相对分子质量的大小分离蛋白 质的有效方法。质的有效方法。2.原理：原理：相对分子质量较小的蛋
3、白质容易进相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长，移动较慢；入凝胶内部通道，路程较长，移动较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动较快，从而分离。路程较短，移动较快，从而分离。基础知识基础知识（二）（二）缓冲溶液：缓冲溶液：1、缓冲、缓冲作用作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液的酸和碱对溶液PHPH的影响，维持溶液的影响，维持溶液pHpH基基本保持不变。本保持不变。2、配制原则、配制原则：（1 1）缓冲溶液通常由
4、）缓冲溶液通常由1212种缓冲剂溶解种缓冲剂溶解于水中配制而成的。于水中配制而成的。（2 2）调节缓冲剂的使用比例可以制得在）调节缓冲剂的使用比例可以制得在不同范围内使用的缓冲液。不同范围内使用的缓冲液。弱酸和弱酸盐弱酸和弱酸盐：H2CO3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONa弱碱和弱碱盐弱碱和弱碱盐：NH4OHNH4CI3、缓冲溶液的作用意义缓冲溶液的作用意义 生物体内的进行的各种化学反应都生物体内的进行的各种化学反应都是在一定的是在一定的PH下进行的，为了能够在实下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的就必须保持体外
5、的PH与体内的基本一致。与体内的基本一致。因此缓冲溶液的正确配制和因此缓冲溶液的正确配制和PH的准确测的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。重要的意义。（三）电泳：（三）电泳：1、概念：是指带电粒子在电场的作用下概念：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。发生迁移的过程。2、原理：样品中各种分子带电性质、分原理：样品中各种分子带电性质、分子大小、形状的不同，使带电分子产生不同子大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度。的迁移速度。3、常用的电泳方法：、常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳回
6、答问题：回答问题：1、测定蛋白质分子量通常使用哪种电泳、测定蛋白质分子量通常使用哪种电泳方法？方法？2、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的？、聚丙烯酰胺凝胶如何组成的？3、SDS是什么物质？在测定蛋白质分子是什么物质？在测定蛋白质分子量时起什么作用？量时起什么作用？4、用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分、用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理是什么？子量的原理是什么？实验操作实验操作:蛋白质提取和分离一般步骤：蛋白质提取和分离一般步骤：1、样品处理、样品处理2、粗分离、粗分离3、纯化、纯化4、纯度鉴定、纯度鉴定一、样品处理：一、样品处理：（一）基础知识：（一）基础知识：1、血液的组成：、血液的组成：2
7、、血红蛋白的结构：、血红蛋白的结构：血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中约最多。在红细胞的组成中约90%是血红蛋白。是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成，包括两个血红蛋白由四个肽链组成，包括两个-肽链肽链和两个和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。氧化碳。血红蛋白因含有血红素而成红色。（二）样品处理步骤：（二）样品处理步骤：1.红细胞洗涤红细胞洗涤：（1）洗涤红细胞的目的是什么？）洗涤
8、红细胞的目的是什么？（2）如何分离红细胞？）如何分离红细胞？（3）如何洗涤红细胞？）如何洗涤红细胞？去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。离心离心取红细胞取红细胞重复洗涤重复洗涤 将红细胞液体倒入烧杯，加入五倍体将红细胞液体倒入烧杯，加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放：（1）如何释放血红蛋白？）如何释放血红蛋白？（2）使用）使用蒸馏水、甲苯有
9、何作用？蒸馏水、甲苯有何作用？（4）采集的血样为什么要及时并采用低速短时）采集的血样为什么要及时并采用低速短时离心分离红细胞？离心分离红细胞？（5）为何要用生理盐水重复洗涤三次？）为何要用生理盐水重复洗涤三次？洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；用0.9%生生理盐水是为了保持红细胞内外正常的渗透压，防止理盐水是为了保持红细胞内外正常的渗透压，防止细胞破裂。细胞破裂。离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。达不到分离的效果。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。3.分离血红蛋白溶
10、液：分离血红蛋白溶液：（1）如何分离血红蛋白？）如何分离血红蛋白？离心离心分层分层过滤过滤分液分液（2）离心后分几层？每层各是什么物质？）离心后分几层？每层各是什么物质？分分4层；自上而下，第一层是层；自上而下，第一层是无色透明无色透明的甲苯层，第二层的甲苯层，第二层是是白色白色薄层固体，是脂溶性薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第三层是物质的沉淀层，第三层是红红色透明色透明液体，是血红蛋白水液体，是血红蛋白水溶液，第四层是其他杂质的溶液，第四层是其他杂质的暗红色暗红色沉淀物。沉淀物。4.透析：透析：（1）如何透析？）如何透析？（2）透析袋用什么制成？作用是什么？）透析袋用什么制成？作用是什么？
11、（3）透析目的是什么？）透析目的是什么？透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃透析袋一般是用硝酸纤维素（又称玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由出入，纸）制成的。透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋中。而将大分子保留在袋中。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品中的缓冲液。或用于更换样品中的缓冲液。血红蛋白溶液血红蛋白溶液 透析袋透析袋 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 二、二、凝胶色谱操作：凝胶色谱操作：1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：2、凝胶色谱柱的填装：、凝胶色谱柱的填装：3、样品的加入和洗脱：、样品的加入和洗脱：（1）为什么要根据色谱柱
12、内的体积计算所需）为什么要根据色谱柱内的体积计算所需要的凝胶量？要的凝胶量？（2）本实验使用的什么凝胶？名称中）本实验使用的什么凝胶？名称中“G”和和75各表示什么意思？各表示什么意思？用凝胶色谱法进行洗脱的目的是将相对用凝胶色谱法进行洗脱的目的是将相对分子质量大的杂质除去。分子质量大的杂质除去。三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：判断纯化的蛋白质是否达到要求，判断纯化的蛋白质是否达到要求，进行蛋白质纯度的鉴定。进行蛋白质纯度的鉴定。思考下列问题：思考下列问题：1.1.蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现蛋白质提取和分离的四个步骤分别体现在那些实验操作中？在那些实验操作中？首先
13、通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。2.血红蛋白有何特点？这一特点对进行血红蛋白有何特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？蛋白质的分离有什么意义？3.如何判断血红蛋白分离是否
14、成功？如何判断血红蛋白分离是否成功？因含有血色素而呈红色，在样品洗脱因含有血色素而呈红色，在样品洗脱时，可通过颜色来判断什么时候收集洗时，可通过颜色来判断什么时候收集洗脱液。使操作变得直观、简化了操作步脱液。使操作变得直观、简化了操作步骤。骤。若血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平若血红蛋白红色区域均匀、狭窄、平整，则分离成功；若血红蛋白红色区域歪整，则分离成功；若血红蛋白红色区域歪曲、散乱、变宽，则不成功。曲、散乱、变宽，则不成功。若填装不紧密、不均匀，有气泡，会若填装不紧密、不均匀，有气泡，会形成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样形成无效空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱
15、液中品分子从这些空隙中通过，扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。4.填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气填装凝胶色谱柱为什么要紧密不能有气泡？泡？5.用什么方法加速干燥的凝胶颗粒膨胀？用什么方法加速干燥的凝胶颗粒膨胀？用这种方法有什么优点？用这种方法有什么优点？将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近沸腾。逐渐升温接近沸腾。节约时间；节约时间；除去凝胶中可能带有除去凝胶中可能带有的微生物；的微生物；排除胶粒内的空气。排除胶粒内的空气。注意事项：注意事项：1.红细胞洗涤次数不能过少；2.离心速度不能过高和时间不能过长；3.填装凝胶色谱柱不能有气泡，要紧密；4.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。